版纳绳蚋抗菌肽SibaCec及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种吸血昆虫版纳绳蚋AaiMaease)抗菌肽57AaCec及其 基因和应用，属于生物医学技术领域。
【背景技术】
[0002] 当前由抗生素引起的耐药性问题日益严峻，多肽类抗微生物(抗菌肽）药物的潜在 应用价值引起了各国科研人员的研究兴趣。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，大多数抗 菌肽分子量小于10000道尔顿，带正电，富含疏水碱基，能够形成两亲性的结构。研究表明， 抗菌肽能够在低浓度下快速杀灭各种革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、寄生虫等病原微生物， 而且也能杀死多种肿瘤细胞，抑制病毒的繁殖与扩散。此外，它们还无致畸变作用，无蓄积 毒性，不容易产生抗药性。一些临床前期的数据表明，抗菌肽对于局部感染和全身感染都有 效，有希望成为新一代抗微生物药物。
[0003] 昆虫是地球上最大的生物种群，除海洋外，其余所有的生态环境都有昆虫的分布。 昆虫不像高等动物那样具有高度专一的获得性免疫系统，即在昆虫体内缺乏T和B淋巴细 胞系统，也无免疫球蛋白及补体系统。然而昆虫能在几亿年的自然进化当中仍然占据种群 优势，表明其应该有非常强大的先天免疫系统，使得昆虫能够抵御环境中诸多微生物的侵 袭。研究表明，昆虫的先天免疫系统能够快速大量合成多种抗菌肽直接杀灭入侵机体的各 种病菌。此外，它们还可以通过参与、调节机体的免疫系统间接发挥各种防御功能。目前， 从昆虫来源的抗菌肽中筛选潜在的抗生素替代物是当前学界的研究热点。这些抗菌肽具有 不同的结构和抗菌活性，是新型多肽类抗微生物药物开发的优良模板库。吸血昆虫版纳绳 蚋属于昆虫纲双翅目蚋科蚋属，主要分布于云南省西双版纳，其体内的抗菌活性物质成分 尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(革兰氏阴性细菌）的版纳绳 蚋抗菌肽及其基因和应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： (1)版纳绳蚋抗菌肽57AaCec :抗菌肽57AaCec，是中国吸血昆虫版纳绳蚋抗菌肽基因 编码的一种直链多肽，含有34个氨基酸残基，分子量3432. 12道尔顿，等电点10. 73。多肽 全序列一级结构(氨基酸序列SEQ ID NO: 1)为：
[0006] (2)版纳绳蚋抗菌肽57AaCec前体的基因克隆：版纳绳蚋唾液腺总RNA提取，mRNA 纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选抗菌肽57AaCec基因。 扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5'41644(：1'11^64441'(：1'1'1'11^13'，？0?另一扩增 引物为 CLONTECH 公司 SMART ? cDNA Library Construction Kit 中的 3 ' PCR Primer 引 物，其序列为5'ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3'。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列 测定。测序结果表明编码版纳绳蚋抗菌肽前体的基因由272个核苷酸（SEQ ID N0:2)组成 (GenBank accession KT223121)，其自 5' 端至 3' 端序列为：
(3)版纳绳蚋抗菌肽的制备方法(常规方法）：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，采 用自动多肽合成仪化学合成其氨基酸序列，C末端酰胺化。通过HPLC反相C18柱层析脱 盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法（Fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS )，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测 序仪测定氨基酸序列结构。
[0007] 本发明的版纳绳蚋抗菌肽57AaCec作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的 应用。
[0008] 本发明的有益效果在于：本发明克隆得到版纳绳蚋抗菌肽57如Cec的编码基因， 利用化学合成的方法合成了 57AaCeC。该抗菌肽对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和 鲍氏不动杆菌具有强的杀灭作用，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简 单的有益特点。
【具体实施方式】
[0009] 下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于 此。
[0010] 实施例一、版纳绳蚋抗菌肽57AaCec前体的基因克隆 (1)、版纳绳蚋唾液腺总RNA提取： A.版纳绳蚋于解剖显微镜下取唾液腺组织，累积300 mg样品，加入3 ml Trizol溶液， 于20 ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。
[0011]B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4°C，12000 rpm离心10 分钟，弃除沉淀。
[0012] C?上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4°C，12000 rpm，离心10分钟，沉 淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为版纳绳蚋唾液腺总RNA。
[0013](2 )、版纳绳蚋唾液腺mRNA的纯化： 版纳绳蚋唾液腺mRNA分离纯化采用美国PR0MEGA公司的PolyATtract? mRNA Isolation Systems 试剂盒。
[0014] A.提取的版纳绳蚋唾液腺总RNA溶于500 yl DEPC水中，放入65°C水浴10分 钟，加人3 yl的Oligo (dT)探针和13 yl 20 X SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A 液。
[0015] B?磁珠（SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0? 5X SSC 0. 3 ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1 ml 0. 5XSSC悬浮，称之为B液。
[0016] C?将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0? IX SSC洗涤4次，最后弃上清，加0. Lml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至 新的试管，再加入0. 15 ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则 上清中为纯化的版纳绳蚋唾液腺mRNA。
[0017] D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5. 2,等体积异丙醇，于-70°C放置30分钟，4°C， 12000 rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10 y I DEPC水中。
[0018] (3)版纳绳蚋唾液腺cDNA文库构建： 米用CL0NTECH公司Creator?SMART?cDNALibraryConstructionKit质粒cDNA文库构建试剂盒。
[0019] A. cDNA第一链合成（mRNA反转录）： 在0. 5 ml无菌的离心管加入I yl版纳绳蚋唾液腺mRNA、l yl SMART IV寡聚核苷 酸、I yl CDS 111/3' PCR引物，加2 yl去离子水使总体积达到5 yl。
[0020] 混匀离心管中的试剂并以12000 rpm离心15秒，72°C保温2分钟。将离心管在冰 上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2. 0 y I 5X第一链缓冲、I. 0 y I 20mM二硫苏 糖醇、1.0 yl 10 mM dNTP混合物、1.0 yl PowerScript反转录酶。混合离心管中试剂 并以12000 rpm离心15秒，在42°C保温1小时。将离心管置于冰上中止第一链合成。从离 心管取2 y 1所合成的cDNA第一链备用。
[0021] B.采用长末端聚合酶链式反应（LD- PCR )方法扩增第二链 95°C预热PCR仪，将2 yl cDNA第一链（mRNA反转录)、80 yl去离子水、10 yl 10\八如&拉&86 2?0?缓冲、2 4 150\(1犯13混合物、2 4 15'？0?引物、2 4 10)5 111/3' PCR引物以及2 iU大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。在PCR仪中按以下程序扩 增：95°C，20秒钟；22个循环（95°C，5秒钟；68°C，6分钟）。循环结束后，将离心管中合成的 cDNA双链进行抽提。
[0022] C.PCR产物用PR0MEGA公司的Wizard?SVGelandPCRClean-UpSystem试 剂盒进行抽提回收，步骤如下： 将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入 离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。12000 rpm离心30秒，倒掉收集 管中的废液。加入700 W的洗脱液(含乙醇）于离心纯化柱中，以12000 rpm离心30秒， 倒掉收集管中的废液。重复步骤2。12000 rpm离心5分钟，将离心纯化柱置于新的离心管 中。加入30 超纯水，在室温下静置5分钟。12000 rpm离心30秒，管底溶液即为所纯化 过的cDNA双链。 D.大肠杆菌DH5 a感受态细胞的制备： 挑取单个DH5 a菌落，接种于3 ml不含氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)培养基中， 37 °C培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50 ml LB培养液中，37°C振荡2小 时。当OD6。。值达到0. 35时，收获细菌培养物。将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用 冰预