一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法
【专利摘要】本发明公开了一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：A1、提取猪背最长肌中的总RNA，将其反转录成cDNA；A2、引物的设计及PCR反应：根据已知的小鼠、大鼠和人的Sox6编码区序列，设计一对简并引物，上游引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为：上游引物（pSOX6CDS?F）：5’-ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3’，下游引物（pSOX6CDS?R）：5’-TCAGTTGGCACTGACAG(C/G)(T/C)TC(T/C)GGG-3’；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。提供一种简单、快捷的获取猪Sox6基因编码区全序列的方法，填补了该基因在猪上的空白，为进一步研究猪Sox6功能及应用奠定了基础。
【专利说明】—种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法。
【背景技术】
[0002]肌纤维是肌肉的基本组成单位。根据其代谢特点，肌纤维分为有氧代谢型(红肌纤维)和酵解代谢型(白肌纤维)，根据其收缩特性，肌纤维分为慢肌纤维(I型纤维)和快肌纤维(II型纤维)。红肌纤维多为慢肌纤维，而白肌纤维多为快肌纤维。肌纤维数目在动物出生时已经稳定，但其类型在出生后易受内因和外因影响而发生转化。肌纤维类型与畜禽肉品质密切相关，提高I型肌纤维在肌肉中的比例可有效地改善畜禽肉品质。
[0003]Sox6是转录因子Sox基因家族的重要成员，存在于多种组织中，并以骨骼肌中的含量最丰富，且快肌多于慢肌。人工突变或缺失Sox6基因的动物，其慢肌纤维相关基因表达水平显著提高，I型肌纤维在肌肉中的比例明显增加，肌肉颜色鲜红。因此，Sox6在肌纤维类型转化中发挥了重要的作用。
[0004]反转录:提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，在逆转录酶以及Oligo (dT)和/或随机引物的作用下反转录成cDNA。
[0005]简并PCR克隆未知基因编码区全序列:根据已知的其他物种该基因编码区序列，分别在包含起始密码子和终子密码子处设计并合成多条不同核苷酸序列组成的混合引物(简并引物)，再以反转录产物(cDNA)为模板，以简并引物为引物，进行PCR扩增，将纯化的PCR产物与T载体连接，连 接产物经化学法转化到大肠杆菌后涂布于含相应抗生素的固体LB平板，倒置于生化培养箱37°C培养过夜，随机挑取几个长出的单菌落进行划线培养，经菌落PCR (直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增)初步鉴定后，提取该菌落的质粒进行DNA序列测定。克隆到T载体并转化大肠杆菌后不仅可以将含有目的片段的质粒以保存菌种的方式长期保存，在需要时可利用大肠杆菌大量复制该质粒，还可以克服PCR产物测序时测序引物近端的碱基无法通过测序获得的缺点。该技术仅需知晓相近物种某基因编码区序列，便可快速获得未知的其他物种该基因编码区全序列。该技术成功的关键是简并引物和PCR扩增条件。
[0006]在知晓某基因cDNA片段但不知晓其编码区全序列的情况下，可以采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得其编码区全序列。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往5’端和3’端延伸扩增从而获得完整的基因5’非翻译区、编码区和3’非翻译区的方法。采用RACE技术来获得基因编码区全序列，成本高、周期长、工作量大、PCR产物片段长度不明确、技术难度大。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快捷的获取猪Sox6基因编码区全序列的方法，填补了该基因在猪上的空白，为进一步研究猪Sox6功能及应用奠定了基础。
[0008]本发明采用以下技术方案:[0009]1.一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法，包括以下步骤:
[0010]Al、提取猪背最长肌中的总RNA，将其反转录成cDNA ；
[0011]A2、引物的设计及PCR反应:根据已知的小鼠、大鼠和人的Sox6编码区序列，设计一对简并引物，上游引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为:
[0012]上游引物(pS0X6CDSF):5’ -ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3’
[0013]下游引物(pS0X6CDSR):5，-TCAGTTGGCACTGACAG(C/G) (T/C)TC(T/C)GGG-3’
[0014]PCR 反应体系为 50 μ L [ddH2027 μ L，10 X LAPCR Buffer II (Mg2+ free)5 μ L, dNTPmixture (2.5mM each)8 μ L，MgCl2 (25mM)5 μ L，上下游引物(10 μ M)各 2 μ L，cDNA (模板)
0.5 μ L，TaKaRa LA Taq (5units/μ L)0.5 μ L]。PCR 反应条件均为 95°C预变性 3min，然后进行 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，共 35 个循环，最后再 72°C延伸 lOmin。
[0015]A3、PCR产物的回收和纯化；
[0016]A4、克隆。
[0017]2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Al包括以下步骤:用液氮将3日龄DLY仔猪背最长肌(500mg)磨成粉末装入1.5mL离心管，加入ImL的TRIzoI液，用手激烈摇晃混匀后，室温放置5min ;4°C，12，OOOg离心IOmin ;将上清液用移液器转移到另一个新的1.5mL离心管，加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇动15s后于室温下静置3min ；4°C，12, OOOg离心15min ;取上层水相0.4mL至一新的1.5mL离心管,加入0.4mL冰预冷的异丙醇，轻缓`充分混匀，室温静置IOmin ;4°C，12，000g离心IOmin ;弃上清，加入lmL75%乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀一次；4°C，7，500g离心5min ;弃上清，晾干残余乙醇，加入20 μ L DEPC处理过的水溶解沉淀；取3 μ L于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余RNA样品于零下80°C贮存。
[0018]取Iyg 总 RNA、lyL Oligo dT 引物(50μΜ)和 IyL dNTP mixture (IOmMeach)，用DEPC处理过的水补充至10 μ L，65°C加热变性5min后快速置于冰中，再加入4 μ L5 XPrimeScript Buffer>0.5 μ L RNase Inhibitor (40U/μ L)、4.5 μ LDEPC 处理过的水和 IyL PrimeScript RTase (200U/μ L)，于 42°C 反应 45min 将其中的 mRNA 反转录为cDNA，最后于70°C作用15min以灭活反转录酶，立即使用或零下20°C保存备用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是PCR扩增猪Sox6基因编码区全序列的琼脂糖凝胶电泳图。
[0020]图2是菌落PCR鉴定重组质粒pMD19-T-pSoX6CDS的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0021]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0022]步骤一提取猪背最长肌中的总RNA (核糖核酸)，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0023]1.组织的采集
[0024]选取3日龄杜长大(DLY)仔猪捅心脏放血处死后立即取背最长肌500mg肌放入液氮罐中用于总RNA提取
[0025]2.总RNA的提取及反转录[0026]在实验室用液氮将背最长肌磨成粉末装入1.5mL离心管,加入ImL TRIzol液,用手激烈摇晃混匀后，室温放置5min ；4°C, 12000g离心lOmin。
[0027]将上清液用移液器转移到另一个新的1.5mL离心管，加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇动15s后于室温下静置3min。
[0028]4°C, 12000g离心15min后取上层水相0.4mL至一新的1.5mL离心管，加入0.4mL
冰预冷的异丙醇，轻缓充分混匀，室温静置lOmin。
[0029]4°C，12000g离心IOmin后弃上清，加入lmL75%乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤
沉淀一次。
[0030]40C，7500g离心5min后弃上清，晾干残余乙醇，加入20 μ L DEPC处理过的水溶解沉淀。
[0031 ] 取3 μ L于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余RNA样品于零下80°C贮存。
[0032]取Iyg 总 RNA、lyL Oligo dT 引物(50μΜ)和 IyL dNTP mixture (IOmMeach)，用DEPC处理过的水补充至10 μ L，65°C加热变性5min后快速置于冰中，再加入4 μ L5 XPrimeScript Buffer、。.5 μ L RNase Inhibitor (40U/μ L)、4.5 μ L DEPC 处理过的水和IyL PrimeScript RTase (200U/μ L)，于42°C反应45min将其中的mRNA反转录为cDNA，最后于70°C作用15min以灭活反转录酶，立即使用或零下20°C保存备用。
[0033]步骤二简并引物的设计及PCR反应；
[0034]根据已知的小鼠、大鼠和人的Sox6编码区序列，GenBanK登录号分别为U32614、ΝΜ_001024751和AF309034，设计一对简并引物，上游引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为:
[0035]上游引物(pS0X6CDSF):5’ -ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3，
[0036]下游引物(pS0X6CDSR):5，-TCAGTTGGCACTGACAG(C/G) (T/C)TC(T/C)GGG-3’
[0037]PCR反应体系为 50 μ L:ddH2027 μ L, 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ free)5 μ L, dNTPmixture (2.5mM each)8 μ L，MgCl2 (25mM)5 μ L，上下游引物(10 μ M)各 2 μ L，cDNA (模板)0.5 μ L, TaKaRa LA Taq (5units/μ L) 0.5 μ L0
[0038]PCR 反应条件均为 95°C预变性 3min，然后进行 95°C 30s，55°C 30s, 72°C 3min，共35个循环，最后再72°C延伸lOmin。
[0039]步骤三PCR产物的回收和纯化；
[0040]采用OMEGA公司plasmid Mini kit I试剂盒回收PCR产物，具体操作步骤为:
[0041]按照上面所述，制备200ul PCR反应液，电泳后割胶，步骤如下:
[0042]a.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外光下用消毒刀片切下目的条带，将切下的胶切成小块置于1.5mL离心管中，称量胶的重量，加入3-6倍的Buffer B2,于50°C水浴至胶块完全溶化。
[0043]b.将胶溶液移入吸附 柱中，8000g离心30s，倒掉收集管中液体，每次最多加入750 μ L0
[0044]c.向吸附柱中加入500 μ L Wash solution, 9000g离心30s，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。
[0045]d.将空吸附柱于9000g离心lmin。[0046]e.向空吸附柱中加入65°C预热的灭菌ddH2030 μ L，室温静置2min，13000g离心2min。
[0047]f.离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液。
[0048]g.取3 μ L于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余DNA样品于零下20°C贮存。
[0049]步骤四克隆；
[0050]1.目的片段与载体连接
[0051]将回收后的目的片段与PMD19-T载体连接，连接体系为10yL[回收后的PCR片段
4.7 μ L，pMD19-T Simple Vector0.3 μ L, Solution I 5 μ L]。以上操作在冰上进行，混匀后在连接仪上于16°C连接4h。
[0052]2.大肠杆菌感受态细胞的制备
[0053]a.将大肠杆菌DH5 α单菌落接种于3mL LB液体培养基，37°C振荡培养过夜。
[0054]b.按1%接种于50mL LB液体培养基，37 °C振荡培养至OD6tltl为0.3-0.5，冰浴IOmin0
[0055]c.4°C，5000rpm 离心 3min，弃上清，加入 15-20mL80mmol/L CaCl2,轻轻悬浮，冰浴20_25mino
[0056]d.AUOOOrpm 离心 3min，弃上清，菌体用 l-2mL80mmol/L CaCl2 轻轻悬浮，加 20%的甘油，分装，于零下80°C保存备用。
[0057]3.连接产物的转化
[0058]a.取新鲜制备或冻存的DH5 α感受态细胞置于冰上，加入10 μ L连接产物，冰浴25_30mino
[0059]b.421`热激1.5-2min，立即置冰上2min，再加入400-600 μ L LB液体培养基，37°C
培养Ih。
[0060]c.涂布于LB固体平板(含50 μ L/mL氨苄青霉素)，37°C培养过夜。 [0061]4.菌落PCR初步鉴定
[0062]a.取适量200μ? PCR管置于冰上，每管先加13.75 μ L灭菌水，用灭菌的牙签接少量菌落于PCR管的底部，混匀并稍微离心后，于PCR仪上95°C变性5min，立即置于冰上。
[0063]b.混匀并稍微离心后，再加入 2.5μ LlOXLA PCR Buffer II (Mg2+ free)、4yLdNTP mixture(2.5mM each),2.5μ L MgCl2(25mM)、上下游引物(10 μ M)各 I μ L 和 0.25 μ LTaKaRa LA Taq (5units/yL)0
[0064]c.混合均匀后，按以下条件进行PCR反应:95°C预变性3min，然后进行95°C 30s,55°C 30s, 72°C 3min，共 35 个循环，最后再 72°C延伸 lOmin。
[0065]d.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，初步筛选重组质粒。
[0066]5.DNA测序及检验实验的正确性
[0067]挑取菌落PCR鉴定为阳性克隆的I号菌落，送往DNA测序公司，提取质粒后进行序列测定。将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的猪Sox6基因完整编码区的核苷酸序列与已知的人、猩猩、小鼠、大鼠和牛的Sox6基因完整编码区核苷酸序列的同源性分别为87.7%,94.56%,86.71%、90.91%和89.49%。表明该方法能达到获得猪Sox6基因完整编码区序列的目的。[0068]获得的猪Sox6基因完整编码区的核苷酸序列为:
【权利要求】
1.一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤: Al、提取猪背最长肌中的总RNA，将其反转录成cDNA ； A2、引物的设计及PCR反应:根据已知的小鼠、大鼠和人的Sox6编码区序列，设计一对简并引物，上游引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为:上游引物(PS0X6CDS F):5’ -ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3’
下游引物(PS0X6CDS R):5，-TCAGTTGGCACTGACAG (C/G) (T/C) TC (T/C) GGG-3，
PCR 反应体系为 50ii L[ddH2027 ii L，IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ free) 5u L, dNTPmixture (2.5mM each)8 y L，MgCl2 (25mM)5 y L，上下游引物(10 y M)各 2 y L，cDNA (模板).0.5 u L, TaKaRa LA Taq (5units/u L) 0.5 u L] ;PCR 反应条件均为 95°C预变性 3min，然后进行 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，共 35 个循环，最后再 72°C延伸 IOmin ； A3、PCR产物的回收和纯化； A4、克隆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Al包括以下步骤:用液氮将3日龄DLY仔猪背最长肌500mg磨成粉末装入1.5mL离心管,加入ImL TRIzol液,用手激烈摇晃混匀后，室温放置5min ;4°C，12，OOOXg离心IOmin ;将上清液用移液器转移到另一个新的.1.5mL离心管，加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇动15s后于室温下静置3min ；4°C,.12，OOOXg离心15min ;取上层水相0.4mL至一新的1.5mL离心管,加入0.4mL冰预冷的异丙醇，轻缓充分混匀，室温静置IOmin ;4°C，12，OOOg离心IOmin ;弃上清，加入lmL75%乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀一次；4°C，7，500g离心5min ;弃上清，晾干残余乙醇，加入.20 u L DEPC处理过的水溶解沉淀；取3 ii L于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余RNA样品于零下80°C贮存； 取 Iyg 总 RNA、liiL Oligo dT 引物(50yM)和 I y L dNTP mixture (IOmMeach)，用DEPC处理过的水补充至10 y L，65°C加热变性5min后快速置于冰中，再加入.4 u L5 XPrimeScript Buffer、0.5 u L RNase Inhibitor (40U/ u L)>4.5 u L DEPC 处理过的水和IuL PrimeScript RTase (200U/y L)，于42°C反应45min将其中的mRNA反转录为cDNA，最后于70°C作用15min以灭活反转录酶，立即使用或零下20°C保存备用。
【文档编号】C12N15/10GK103740701SQ201410006972
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】黄志清, 陈小玲, 温万雪, 杨亭, 徐孟, 陈代文 申请人:四川农业大学