一种高效率基因定向克隆的方法
【专利摘要】本发明公开一种高效率基因定向克隆的方法。该方法利用Topoisomerase?I室温下5分钟快速连接以及体外环化原理实现高效率定向克隆的方法。该方法包括：带有Topoisomerase?I酶识别位点以及定向序列的载体、定向引物的设计、PCR片段的制备、以及构建目标基因的重组载体。由于所用载体带有原核表达载体的所有调控元件，因此，PCR产物可以连接该载体，经PCR鉴定后无需确定目的基因的连接方向，即可直接用于原核表达。
【专利说明】一种高效率基因定向克隆的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域一种高效率的基因定向克隆的方法。
【背景技术】
[0002]基因克隆技术是分子生物学中一项重要技术，国内外专家学者探索了很多不同的克隆方法，有非定向克隆和定向克隆，并且相应的建立了多种载体。由于非定向克隆的方法虽然操作简便，能够得到较高的克隆数，但是后续的鉴定工作比较复杂，目前较为常用的定向克隆包括2种方法: [0003](I)传统的T4DNA连接酶连接法
[0004]限制性酶切载体以及片段产生互补配对的粘性末端，在T4DNA连接酶作用下形成重组分子。其原理是:在目的基因片段的两端分别设计两个酶切位点(与载体上的酶切位点相同，确保片段插入方向正确)，后利用特定的限制性内切酶，分别对载体及PCR产物的片段进行双酶切后用T4DNA连接酶进行连接。该方法的缺点是:1、载体和片段包含酶切位点。目的基因片段需要根据载体的酶切位点进行比对和序列分析，确保序列内部无选定的酶切位点，设计引物，给片段的两端分别加上酶切位点和保护碱基，再次PCR后，得到带有酶切位点的基因片段序列。2、酶切后，需要对PCR产物进行纯化，该过程可采用柱式法或割胶法，耗时较长，且在一定程度上可能损伤DNA片段，或导致突变。3、T4DNA连接酶作用时间较长，一般需要再特定反应温度下，需要反应过夜或多个小时才能完成片段的连接。4、T4DNA连接酶与片段和载体的三分子碰撞连接，其三分子同时碰撞的几率与成功性都较低。
[0005](2) DNA拓扑异构酶法
[0006]1990年,美国科学家Shuman S.发现牛痘病毒DNA拓扑异构酶1,1991年他证明该酶特异性地识别CCCTT，而且在2分钟之内可以完成80%的连接反应，从而为应用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I进行快速分子克隆提供了理论基础(Sekiguchi J, Cheng C, Shuman SKinetic analysis of DNA and RNA strand transfer reactions catalyzed by vacciniatopoisomerase.J Biol Chem.1997Jun20 ;272 (25):15721-8)。
[0007]1999年，Shuman S.证明DNA和DNA拓扑异构酶I共价偶联的效率在室温5分钟可以达到 93 % (Cheng C，Shuman S.Site-specific DNA transesterificationby vaccinia topoisomerase:role of specific phosphates and nucleosides.Biochemistry.1999Decl4 ；38 (50):16599-612) ?由于 Topoisomerase 的突出性能，它已被成功应用于TA克隆和定向克隆。
[0008]以Invitrogen公司利用Topoisomerase I实现定向克隆为例，其设计原理为载体一端为4个碱基突出端，另一端为平末端，当平端插入片段与载体连接时，平端片段5’ -OH攻击突出端，实现连接。这种方法虽然能实现定向克隆，但克隆效率低(WWW.1nvitrogen.com)。另外，Cheng C，2000年报道，利用拓扑异构酶I引发的内源双链DNA断裂损伤修
复途径-重组侧翼连接途径实现定向克隆(Cheng C，Shuman S.Recombinogenic flap
ligation pathway for intrinsic repair of topoisomerase IB-1nduced double-strandbreaks.Mol Cell Biol.2000Nov ；20(21):8059-68)。在这一途径中，牛痘病毒拓扑异构酶共价结合于DNA平末端，并催化其同具有5’缩进和3’突出尾部的DNA双链的共价连接。该方法的缺点是用“flap”随机攻击DNA双链，因而克隆效率低。
【发明内容】
[0009]鉴于上述现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种利用Topoisomerase I室温下5分钟快速连接以及体外环化原理实现高效率定向克隆的方法。该方法优点:通过特定引物设计，与特定的载体连接，5分钟可以完成定向克隆，克隆效率达100%，而且不受克隆基因序列的限制。
[0010]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是:
[0011]本发明提供一种高效率基因定向克隆的方法，该方法包括以下步骤:
[0012](I).载体准备:所述载体一端为偶联拓扑异构酶I的平末端，另一端为包含6个碱基的突出端的定向克隆或表达载体；
[0013](2).引物设计
[0014]一条引物为非定向引物，另一条引物为定向引物，其中，所述常规引物为无额外碱基和无磷酸化的与插入片段DNA互补的引物，所述定向引物的5’端依次为与步骤(1)中载体上突出端的6个碱基互补配对的碱基序列和拓扑异构酶I识别位点的互补序列“AAGGG”，且磷酸化；
[0015](3) PCR扩增，获得插入片段DNA
[0016]使用步骤(2)的引物对模板DNA进行PCR扩增；
[0017]⑷反应
[0018]将载体，插入片段DNA，拓扑异构酶I混合，室温5分钟，获得环化产物。
[0019]在此步骤中，三个反应同时发生，(I)不包含额外序列，无磷酸基的插入片段一端与偶联Topoisomerase I的载体的一端连接，包含额外碱基以及磷酸基的插入片段一端，由于其磷酸基的存在，无法和偶联了 Topoisomerase I载体的一端发生连接；(2)Topoisomerase I识别插入片段Topoisomerase I位点，发生切割反应产生6个碱基的粘性末端。(3)自我环化，6个碱基的粘性末端和载体的粘性末端互补配对，发生环化。如图2所示。
[0020]进一步地,步骤(1)中，载体的全长序列如序列表SEQ ID N0.1所示。进一步地，所述拓扑异构酶I识别位点为“CCCTT”。进一步地，上述方法还包括:将步骤(4)获得的环化后产物转入大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，然后鉴定阳性重组子。
[0021]鉴定阳性重组子的方法包括:
[0022](I)PCR方法鉴定阳性重组子
[0023]挑选克隆置于10 μ I无菌水中，涡旋混合，取I μ I混合液于25 μ I反应体系，用定向引物和非定向引物鉴定重组子。
[0024]PCR反应条件:94°C预变性10分钟(裂解细胞，失活核酸酶)，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸(根据片段的大小确定延伸时间)30个循环，72°C后延伸10分钟。
[0025](2)限制性酶切分析阳性重组子
[0026]挑选阳性重组子，过夜培养。用试剂盒小量提取质粒，选择适宜的限制性内切酶，酶切鉴定重组子。
[0027](3)测序:用定向引物和非定向引物测序，确定序列的正确性。本发明构建的载体及所提供的定向克隆技术能广泛用于PCR产物的直接定向克隆及表达，具有很高的应用价值，其优势在于:1、PCR产物无需酶切、纯化，以简单快捷的方法实现5分钟快速定向克隆。
2、若该方法应用于表达载体上,如本实施例中(p_￡^ST?.-Dlcloning Vector),定向克隆PCR产物于的T71ac启动子高效表达的载体中直接进行表达，操作简化，重组载体经鉴定后即可立即进行蛋白表达的等工作。3、经该方法得到的重组载体，测序的成功率提高很多，能保证100%准确。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1:载体-Dlcloning Vector 的图谱
[0029]图2:使用本发明方法实现闻效率定向克隆不意图；
[0030]图3:实施例1中的PCR鉴定阳性克隆。分别插入3个目的片段lkb，2kb，3kb的PCR鉴定结果。其中:泳道M:Trans2K Plus II DNA Marker，泳道1-20:插入基因片段
【具体实施方式】
[0031]本发明提供一种定向克隆方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所用的材料及来源分别为:载体P凡-Dlcloning
Vector (北京全式金生物技术有限公司)、引物合成(北京英俊生物技术有限公司)，Topoisomerase I (北京全式金生物技术有限公司)。T4polyneuclotide kinase、10XNEBDNA Ligase Buffer (New England Biolabs) ,TransStart^^DNA Polymerase (北京全式金生物技术有限公司)，(Trans`l-Tlchemically competent cell (北京全式金生物技术有限公司)，EasyPure? Genomic DNA Kit (北京全式金生物技术有限公司)，7hms2K?Plus II DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)
[0032]实施例1:
[0033]用JraraiStori? FastPfu DNA Polymerase扩增3个不同长度的片段,分别进行定向克隆后，用PCR的方法验证定向克隆效果。
[0034]1.目的基因引物设计与合成
[0035]以人基因组DNA核酸序列为模板，选取三段目的基因，基因片段大小分别为以lkb、2kb、3kb。用primer5.0软件分别设计三对引物，将定向引物磷酸化后再进行PCR反应。引物见表1。
[0036]表1PCR扩增所用引物、DNA片段大小
[0037]
【权利要求】
1.一种高效率基因定向克隆的方法，该方法包括以下步骤: (1)载体准备:所述载体一端为偶联拓扑异构酶I的平末端，另一端为包含6个碱基的突出端的定向克隆或表达载体； (2)引物设计 一条引物为常规引物，另一条引物为定向引物，其中，所述常规引物为无额外碱基和无磷酸化的与插入片段DNA互补的引物，所述定向引物的5’端依次为与步骤(1)中载体上突出端的6个碱基互补配对的碱基序列和拓扑异构酶I识别位点的互补序列“AAGGG”，且磷酸化； (3)PCR扩增，获得插入片段DNA 使用步骤(2)的引物对模板DNA进行PCR扩增； (4)反应 将载体，插入片段DNA，拓扑异构酶I混合，室温5分钟，获得环化产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，载体的全长序列如序列表SEQID N0.1 所示。
3.根据权利要求1所 述的方法，其特征在于，所述拓扑异构酶I识别位点为“CCCTT”。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括:将步骤(4)获得的环化后产物转入大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，然后鉴定阳性重组子。
【文档编号】C12N15/63GK103642829SQ201310675252
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】辛文, 耿亮 申请人:北京全式金生物技术有限公司