专利名称：双峰驼ucp2蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼UCP2蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术：
解耦联蛋白2 (UCP2)是1997年发现的一种新的解偶联蛋白，它是线粒体内膜载体家族的一员。与其类似物UCPl相比，UCP2在棕色脂肪组织中含量较低，但在体内分布广泛，因而引起人们的关注。UCP2的主要功能是控制ATP合成，即通过介导线粒体质子泄漏，将质子驱动中贮存的能量以热能的形式释放，最终引起ATP生成减少。此外，UCP2还可调节脂肪酸代谢、控制活性氧的产生。UCP2在调节大脑功能，抑制细胞死亡方面也起着重要作用。UCP2基因定位在与肥胖和高胰岛素血症显示连环遗传的染色体区1，UCP2在参与脂肪和能量代谢的组织中表达，因此促使人们对其与代谢紊乱尤其是2型 糖尿病的关系产生了兴趣。人UCP2基因定位于染色体llql3。UCP2基因结构于1998年阐明，其蛋白由309个氨基酸残基组成，相对分子质量约为32k，理论的等电点为9. 74。其序列与其类似物UCPl和UCP3分别有59 %和73 %的相似性。人UCP2基因与鼠相同，均含8个外显子和7个内含子，分别跨越8和6. 3 kb长的区域。与其他线粒体载体家族成员相似，UCP2有两种转运模式一是利用对基质特异的载体，另一种则是通过特异性较低的通道。根据目前的研究，若能提高UCP2在特异组织中的表达，可减少脂肪堆积而对抗肥胖，对非乙醇性脂肪肝亦有保护作用，同时也是一种简单有效的减肥方法。若能选择性减少β细胞中UCP2的表达，可成为防治2型糖尿病的一个新的靶点。由于肥胖和2型糖尿病是多基因作用的结果，除UCP2基因的效应外，还应积极探索其它相关基因的作用，以及这些基因是否与UCP2基因有协同作用。在动物方面UCP2基因遗传变异方面的报道较少，至今尚未发现克隆获得双峰驼UCP2基因编码蛋白序列以及对动物UCP2基因进化规律研究的报道。UCP2在能量代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用，因此，通过对UCP2从基因、蛋白质和抑制剂等多方面的研究，必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、II型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望。双峰驼有较强的耐旱和沉积脂肪能力，尤其是在水草充足的季节，驼峰能在短时间内沉积大量脂肪，很适合进行脂类和能量代谢研究。
发明内容
本发明提供了一种双峰驼UCP2蛋白基因，该双峰驼UCP2蛋白基因的重组蛋白编码序列是一种在线粒体中控制ATP合成，调节脂肪酸代谢、控制活性氧的产生等密切相关的基因，其核苷酸序列与牛的UCP2蛋白核酸序列ΝΜ_001033611.1具有92%的相似性。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼UCP2蛋白基因，其特征在于该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-1852位的核苷酸序列，其同牛UCP2基因蛋白编码序列同源性为92. 00%，编码氨基酸序列同源性为95. 00%。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种双峰驼UCP2蛋白基因的
重组蛋白。下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进
上述重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。上述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼UCP2蛋白中得到双峰驼UCP2蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA-3’，
SEQ ID NO. 4 01igo dT。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼UCP2蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步，组织分离(Isolation);第二步,总RNA的分离(TotalRNA isolation),总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA-3’，
SEQ ID NO. 4 01igo dT。本发明双峰驼UCP2蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它在能量代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用，因此，通过对UCP2从基因、蛋白质和抑制剂等多方面的研究，必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、II型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，因此本发明具有很大的应用价值。
附图1为双峰驼UCP2蛋白基因RT-PCR产物电泳图。附图2为双峰驼和牛、人、鼠、猪等14种动物用Clustal X中对齐的UCP2蛋白氨基酸序列同源性比较结果图。附图3为本发明双峰驼UCP2蛋白氨基酸序列和牛、人、鼠、猪等14种动物UCP2蛋白氨基酸序列构建的系统进化树图。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。实施例1 :一种双峰驼UCP2蛋白基因，其特征在于该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-1852位的核苷酸序列，其同牛UCP2基因蛋白编码序列同源性为92. 00%，编码氨基酸序列同源性为95. 00%。
实施例2 :—种双峰驼UCP2蛋白基因的重组蛋白。实施例3 :重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。实施例4 :重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。实施例5 :重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼UCP2蛋白中得到双峰驼UCP2蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA-3’，
SEQ ID NO. 4 01igo dT。实施例6 :—种双峰驼UCP2蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步，组织 分离(Isolation);第二步，总 RNA 的分离(Total RNA isolation),总 RNA 的分离(TotalRNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全长 cDNA 的克隆(Cloning ofFull-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA-3’，
SEQ ID NO. 4 01igo dT。双峰驼UCP2蛋白基因cDNA序列的克隆1. 组织分离(Isolation)
从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于一 70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。2.总 RNA 的分离(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的准备工作
玻璃制品用O. lmol/L的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时。匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用O. 1%的DEPC水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用O. 5%的SDS处理。Tip头、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。(2 )组织总RNA提取
取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogenBRL, USA)的匀浆器管中匀浆，4°C、12000g离心10分钟，吸取上清液，15_30°C温育5分钟，加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2_3分钟；4°C、12000g离心15分钟，吸取上清液，加O. 8ml异丙醇，混合均匀，15-30°C温育10分钟，4°C、12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA;倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗涤RNA，4°C、7500g离心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA，溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。(3)组织总RNA的鉴定
通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入I X TBE待用。琼脂糖凝胶用IXTBE配制。在IOul上样缓冲液(2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2 — 3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。3.全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
(1)引物设计及合成
根据 GenBanK 发表的牛(Accession No: NM_001033611.1)、人(Accession No:NM_003355. 2)、马(Accession No: ΧΜ_001498480. 2)等物种的UCP2蛋白基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼UCP2蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼UCP2蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID N0:4 (反向)，序列信息如下
SEQ ID NO:3 (正向)5，- ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA -3，
SEQ ID NO:4 (反向)01igo dT
(2)RT-PCR 扩增
按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成IOul 2 XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixtur, 0. 5ul RnaseInhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul), lul Oligo dT Primer,lul RNASample,1. 5ul Rnase Free dH20，总体系为 20 ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5V 5分钟。PCR扩增条件970C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72V I分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10分钟，4°C保存。(3)克隆和测序
PCR扩增片段的回收片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中，按每IOOmg琼脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟；将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg离心I分钟，倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体。离心I分钟；将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I分钟后，IOOOOg离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。回收片段同T载体的连接连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程如下在 EP 管中制备下列连接反应液pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul，DNA 20_40ng，Solution I 5ul，加dH20至10ul，将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。质粒的转化从一 70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶；IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟，42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟；力口400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟，取IOOul铺于LB平板上，平板含0. 1%(V/V)的氨苄青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10-15小时。转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落，将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模板，用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入O. 1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。质粒的回收质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下将转化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀，细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心，在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮，加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟，加入350ulP3液，温和摇匀，离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体，在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体，在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体，离心I分钟；将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟，EP管中液体即为回收的质粒。质粒的酶切鉴定为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定·本研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和Hin d II1.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul,Hind III lul，IOXK Buffer 2ul, DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul，30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电泳检测。重组质粒的测序取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。双峰驼UCP2蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建1、双峰驼UCP2蛋白基因编码序列同源性比较
在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠、猪等14种动物的UCP2蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较见附图2，比较结果显示，其同牛UCP2基因编码蛋白序列同源性为92. 00%，编码氨基酸序列同源性为95. 00%。2、UCP2蛋白基因编码序列系统发生树构建
在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠等14种物种的14条UCP2蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树见附图3。结果显示双峰驼UCP2蛋白基因同牛的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼UCP2蛋白基因。本发明在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为19IObp，电泳结果见附图1，其中59-61位为起始密码子ATG，1850-1852位为终止密码子TGA，59-1852位为编码蛋白质区域(⑶S)。在SEQ ID NO. 1，双峰驼UCP2蛋白基因编码612个氨基酸。双峰驼和猪、人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的UCP2蛋白基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。对包括SEQ ID NO.1在内的14个物种的14条UCP2蛋白基因的⑶S序列构建了系统发生树，结果发现，双峰驼UCP2蛋白同牛的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼UCP2蛋白基因。本发明在提供了双峰马它UCP2蛋白基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上； 将牛、人、鼠、猪等不同物种UCP2蛋白基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的14个物种的14个UCP2蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树。本发明中的双峰驼UCP2蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考牛、人、鼠等物种的UCP2蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼UCP2蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼UCP2蛋白基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ IDNO. 2。本发明参考其它物种UCP2基因序列，克隆测序获得双峰驼UCP2基因的cDNA序列，并对不同物种UCP2基因的CDS序列进行同源性比较，旨在了解 和验证UCP2基因的结构特点，为今后研究UCP2基因与双峰驼脂类和能量代谢的关系提供基础资料。以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。序列 表
权利要求
1.一种双峰驼UCP2蛋白基因，其特征在于该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第 59-1852位的核苷酸序列，其同牛UCP2基因蛋白编码序列同源性为92. 00%，编码氨基酸序列同源性为95. 00%。
2.一种根据权利要求1所述的双峰驼UCP2蛋白基因的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
4.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
5.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼UCP2 蛋白中得到双峰驼UCP2蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA-3’，SEQ ID NO. 4 01igo dT。
6.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼UCP2蛋白中得到双峰驼UCP2蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA-3’，SEQ ID NO. 4 01igo dT。
7.一种根据权利要求1所述的双峰驼UCP2蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行 第一步，组织分离(Isolation);第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation),总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定； 第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGGTTGGACTGAAGCCTTCA-3’，SEQ ID NO. 4 01igo dT。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼UCP2蛋白，该双峰驼UCP2蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法具有SEQIDNO.1中从核苷酸第59-1852位的核苷酸序列。本发明双峰驼UCP2蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它在能量代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用,因此,通过对UCP2从基因、蛋白质和抑制剂等多方面的研究,必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、Ⅱ型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，因此本发明具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/12GK103014009SQ201210478260
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司