一种鹿prdx4基因及其克隆方法与编码蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鹿PRDX4基因及其克隆方法与编码蛋白，属于基因工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] PRDX4是PRDXs家族的重要成员，定位于内质网。PRDX4的作用机制主要有两种： 一是参与细胞的氧化还原反应，防止细胞氧化损伤；二是可以作为激活NF-kB和ICAM-1氨 基端激酶的一类TRX依赖的过氧化物酶。目前，多种动物的PRDX4mRNA序列已经成功克隆 出来，在UNIPR0T上已有人、盘基网柄菌、小鼠、大鼠和牛5个物种的PRDX4序列被鉴定出来 且通过审阅。梅花鹿PRDX4蛋白在角柄骨膜致敏区细胞中的显著性表达说明其可能在鹿茸 快速生长繁殖、分化迀移及维持组织细胞稳定中发挥重要作用，但目前梅花鹿基因组序列 尚未测出，有关梅花鹿PRDX4基因的克隆和功能研究均未见报道，给梅花鹿PRDX4cDNA序列 带来了很大困难。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种鹿过氧化还原酶4(Peroxiredoxin4, PRDX4) 基因PRDX4,所采取的技术方案如下：
[0004] 本发明的一个目的在于提供一种鹿过氧化还原酶4基因PRDX4,该基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。经过分析所获得的鹿过氧化还原酶4基因PRDX4, mRNA翻译区 序列长度为819bp，包含有起始密码子ATG和终止密码子TGA，序列含A204个，含C 202个， 含 G 212 个，含 T 201 个，含量分别为 24.9%、24.7%、25.9%、24.5%。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种所述基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 2所示。经分析，所获得的鹿过氧化还原酶4,其氨基酸序列长度为272个氨基 酸，亲水性蛋白，有两个保守功能域，分别是PRX_Typ2cys (Peroxiredoxin family, Typical 2_Cys PRX subfamily)和 AhpC(Alkyl hydroperoxide reductase, AhpC)，前 38 个氨基酸 残基 MEAPPPPLPA MTLAPGRSRK LLLLPLLLFL LRAEAVRG 可能是信号肽序列。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种所述基因的克隆方法，其步骤如下：
[0007] 1)采取梅花鹿的角柄骨膜致敏区细胞并进行培养，获得鹿角柄骨膜致敏区细胞；
[0008] 2)提取步骤1)中获得的鹿角柄骨膜致敏区细胞中的mRNA，根据所得mRNA合成 cDNA ；
[0009] 3)设计PCR扩增引物；
[0010] 4)以步骤2)所得的cDNA为模板，利用步骤3)设计的引物进行PCR扩增，利用电 泳鉴定并回收目标扩增产物；
[0011] 5)对步骤4)所得的目标扩增产物进行生物信息分析鉴定。
[0012] 优选地，步骤1)所述培养，培养条件是：利用含有10%胎牛血清，1%青链霉素的 DMEM培养基，在37°C，5. 00% C02的条件下培养3天。
[0013] 优选地，步骤3)所述扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 优选地，步骤4)所述PCR扩增，扩增条件为：95°C预变性5min，94°C 30s，67. 3°C 3〇8,72°(：15〇8,30个循环，循环结束后72°(：1111111。
[0015] 优选地，步骤5)所述分析鉴定，是利用核酸电泳判断检测泳道中是否含有大小为 800-900bp的条带，再通过与已知物种序列进行对比分析，确定目的片段是否为目的片段。
[0016] 所述方法的具体步骤如下：
[0017] 1)采取梅花鹿的角柄骨膜致敏区细胞，并利用含有10%胎牛血清，1 %青链霉素 的DMEM培养基，在37°C，5. 00% C02的条件下培养3天，获得鹿角柄骨膜致敏区细胞；
[0018] 2)提取步骤1)中获得的鹿角柄骨膜致敏区细胞中的mRNA，根据所得mRNA合成 cDNA；
[0019] 3)设计PCR扩增步骤2)所述cDNA的引物，获得如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4的 引物；
[0020] 4)以步骤2)所得的cDNA为模板，利用步骤3)所获得的引物进行PCR扩增，扩增 条件为：95°C预变性5min，94°C 30s，67. 3°C 30s，72°C 15〇8,30个循环，循环结束后72°〇 lmin，获得扩增产物；
[0021] 5)利用核酸电泳判断步骤4)通过对比marker，所得扩增产物中是否含一条 800-900bp的DNA条带，再通过与已知物种序列进行对比分析，确定目的片段是否为目的片 段。
[0022] 本发明获得的有益效果：
[0023] PRDX4蛋白的存在能够保证细胞和组织的正常生长增殖；激活NF-kB和ICAM-1 氨基端激酶的一类TRX依赖的过氧化物酶；PRDX4可以保护胰岛0细胞免受损伤，抗衰老。 克隆出该基因后，可以进行下一步的蛋白表达载体构建，研究PRDX4蛋白表达及与其他鹿 茸再生相关蛋白的相互作用，以期揭示其在鹿茸再生过程中的作用。
[0024] 本发明通过引物设计方法优化及RT-PCR成功克隆出梅花鹿PRDX4cDNA序列，并进 行生物信息学分析。本发明中的引物设计优化方法可以给其他非模式生物或无全基因组学 列物种的基因克隆及表达提供理论参考。
【附图说明】
[0025] 图1为鹿过氧化还原酶4基因PRDX4的核酸电泳图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0027] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0028] 梅花鹿（Cervus nippon)角柄骨膜取自中国农业科学院特产研究所实验鹿场。
[0029] 实施例1鹿角柄骨膜细胞的提取（Sun H等，2012)及mRNA的提取
[0030] 将从中国农业科学特产研究所实验鹿场获得的梅花鹿角柄骨膜取回后，根据 Sun H 等人（Sun H, Yang F, Chuff,Zhao H, McMahon C, Li C. Lentiviral-mediated RNAi knockdown of Cbfal gene inhibits endochondral ossification of antler stem cells inmicromass culture. PLoS One. 2012, 7(10): e47367)的方法对所得骨膜进行处理，并获 得梅花鹿的角柄骨膜致敏区细胞。
[0031] 将鹿茸角柄骨膜致敏区细胞放在含有20ml的10%胎牛血清，1 %青链霉素的DMEM 培养基的75cm2培养瓶中，37°C，5. 00% C02的条件下培养2天；弃去旧培养液，换20ml同上 的新培养液同等条件下继续培养1天，获得鹿角柄骨膜致敏区细胞。
[0032] 细胞培养瓶中培养好的梅花鹿角柄骨膜致敏区细胞，弃去培养液，胰酶消化收集 细胞，1*细胞洗涤液（上海生工）洗涤两次，用于梅花鹿角柄骨膜致敏区细胞总RNA的提取 (PureLink? RNA Mini Kit, Life Technologies)，然后合成 cDNA 第一链（Prime Script? First Stand cDNA Synthesis