山羊RanBP9基因克隆及在精子中的定位检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了山羊Ran结合蛋白9 (RanBPg)基因克隆及其在精子中的定位检测 方法，设及生物技术领域。
【背景技术】
[0002] RanBPg在胚胎干细胞中可W自行发育，且在精子和卵子发生过程中具有重要调节 作用，也是一种由多个部分组成的脚手架蛋白质，在介导细胞表面受体蛋白和细胞内信号 传递中发挥着重要功能。RanBP9蛋白功能的发挥与多种生物过程相关，例如，细胞增殖和 调亡、性腺的生长和发育等。另外，RanBPg是小鼠精子发生和卵子发生过程中必不可少，且 在精细胞繁殖阶段的睾丸突变体发育中，RanBPg有一个显著的下降过程。同时也是一种神 经性受体的新颖结合蛋白，在胞浆内作为交互器诱导信号传导，在胚胎干细胞中可W自行 发育，且在精子和卵子发生过程中具有重要调节作用。
[0003] 但山羊RanBPg基因序列及其在精子中的定位检测还是空白。我们利用酵母双杂 交技术筛选出了RanBPg基因，本发明的目的是克隆山羊RanBPg序列，其在精子中的定位检 巧。，为研究其在山羊生长发育中的功能奠定基础。
【发明内容】
[0004] 本发明是根据相关的生物技术，公开了山羊Ran结合蛋白9 (RanBPg)基因克隆及 其在精子中的定位检测方法，按W下步骤进行： 一、RT-PCR克隆山羊的RanBPg基因。 阳00引二、Q-PCR检测RanBP9mRNA在山羊睾丸、附睾组织中的相对表达量。
[0006] Ξ、制备山羊睾丸、附睾组织切片；组织免疫巧光技术检测RanBP9蛋白在山羊睾 丸、附睾组织中的表达。
[0007] 四、精子细胞免疫巧光技术研究RanBPg蛋白在精子中的定位。
[0008] 本发明克隆出山羊的RanBPg序列，得到RanBPg蛋白在山羊精子中的表达定位，最 终为研究RanBPg在山羊精子转染外源DNA中的作用机制奠定基础。
【附图说明】
[0009] 图1是山羊睾丸组织总RNA提取图，1-4均为样品。
[0010] 图2是山羊RanBP9基因序列扩增图，1-4均为PCR产物，Μ为marker(DL2000)。
[0011] 图3是RanBP9mRNA在睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾和脾脏组织中相对表达量图， 大写字母：P<〇. 01，小写字母：P<〇. 05。1 :睾丸，2 :附睾头，3 :附睾体，4 :附睾尾，5 :脾脏。 阳01引 图4是RanBP9蛋白在睾丸和附睾组织中的检测结果图，A:实验组，B:对照组 (1%PBS代替一抗)。1 :睾丸，2 :附睾头，3 :附睾体，4 :附睾尾，200倍倒置显微镜下观察。 阳01引 图5是RanBP9蛋白在山羊精子中的定位图，A1，A2分别表示RanBP9蛋白，400倍 倒置显微镜下观察。
【具体实施方式】
[0014] 本发明中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0015] 【具体实施方式】一：本实施方式主要是克隆山羊的RanBPg基因序列，其特征在于按 W下步骤进行： 一、 山羊睾丸组织总RNA提取(按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书进行）及RNA完 整性和纯度检测巧日图1); 二、反转录获得cDNA模板，反应体系及程序按下表进行； 表1反转录体系
表2反转录程序
Ξ、RT-PCR扩增RanBPg基因； 1、 设计引物扩增目的片段，合成引物。
[0016] 表3RanBP9基因不同位点引物序列
2、RT-PCR进行基因序列扩增，具体程序如下： 表4RanBPg基因扩增PCR反应体系
表5PCR反应程序
3、PCR产物巧日图2 )进行测序拼接，得到RanBPg序列。 阳017] 【具体实施方式】二：本实施方式与【具体实施方式】一的步骤一和二相同，不同点按W 下步骤进行： 一、 在NCBI上下载山羊β-actin基因mRNA序列和克隆的RanBP9基因序列设计巧光 定量PCR引物； 表6山羊RanBP9基因和β-actin巧光定量PCR引物
二、 巧光定量检测RanBP9mRNA的相对表达量，具体程序如下： 表7巧光定量PCR反应体系_^
^ 表8巧光定量PCR反应程序
Ξ、各样品进行的巧光定量PCR扩增的Ct值由样品的扩增曲线得到，样品中RanBPg基 因与β-actin基因的相对表达量通过方程2AEt计算Act=Ct-Ct3cti。。结果经过均一化处 理之后取平均值并做柱状分析，通过SPSS19. 0软件进行统计分析，采用AVAN0方差分析对 平均值和标准差进行计算，并且进行差异显著性检验(如图3)。
[0018] 【具体实施方式】Ξ:本实施方式是进行RanBPg蛋白的组织表达分析，具体实施步骤 如下： 一、样品采集：迅速采集山羊睾丸和附睾。山羊睾丸横切两半后固定一周，修成小块，固 定7化后再次修块，继续固定4她。山羊附睾按照附睾头、附睾体和附睾尾分别固定一周，修 成小块，固定7化后再次修块，继续固定4她； 二、睾丸和附睾样本固定后，对布整齐标本进行修块，分类后贴好标签，按照W下程序 脱水、透明、浸蜡和包埋； 表9组织切片程序_
Ξ、标本包埋后进行切片，切片厚度为4X10-6m，在45°C~50°C溫水中展片，拱片时动 作要迅速，防止切片标本与载玻片之间形成气泡，拱片后80°C左右烤片30min，装盒备用。 未切完蜡块保留备用。选择切片，置于7(TC烘箱中烤片化； 四、 按照W下程序脱蜡； 表10组织切片脱蜡程序
五、 95°C巧樣酸钢抗原修复液修复15min，自然冷却，PBS冲洗两次，每次5min; 六、 滴加PBS-BSA(5%)抗体封闭液，37 °C封闭30min;滤纸吸干封闭液，滴加 50μ1PBS-BSA(5%)稀释的抗体，4°C解育过夜； 屯、PBS洗3次，每次lOmin;加入FITC标记的二抗（PBS-BSA(5%)按照1:100稀释)， 37°C解育比； 八、在暗处，PBS冲洗3次，每次lOmin;滤纸吸去PBS，滴加化echst33258染色液，室溫 放置5-8min，吸去染色液，滴加甘油或抗泽灭封片剂封片；利用巧光显微镜观察并成像拍 照巧日图4)。 阳019]
【具体实施方式】四：本实施方式是运用离屯、管细胞免疫巧光法进行RanBPg蛋白在 精子上的定位分析，具体实施步骤如下： 一、 采用假阴道法采集成年山羊的精液，进行精液品质鉴定； 二、取50μ1精液于1. 5ml离屯、管中，加入950μ1生理盐水，于4°C1000巧m离屯、5min， 重复一次。吸去生理盐水，W4°CPBS重悬细胞； Ξ、离屯、吸去PBS，Wlml4%PFA固定重悬精子，置于冰上固定30min。
[0020] 四、离屯、吸去固定液，用1. 5ml4°CPBS重悬精子，放置5min后，用PBS再次洗涂精 子； 五、 离屯、吸去PBS，重悬精子于一抗中，置于4°C溫育比； 六、 离屯、吸去PBS，W二抗重悬精子，4°C溫育比；用4°CPBS稀释精子和抗体至1. 5ml; 离屯、吸去PBS，W4°CPBS重悬精子，重复一次； 屯、暗处离屯、，W少量PBS重悬，将适量的精子细胞悬液滴于多聚赖氨酸覆层的载玻片 上，加盖玻片，马上使用巧光显微镜观察拍照(如图5)。
【主权项】
1.山羊Ran结合蛋白9 (RanBP9)基因克隆及其在精子中的定位检测方法，其特征在于 按以下步骤进行： 一、RT-PCR克隆山羊的RanBP9基因； 二、Q-PCR检测RanBP9 mRNA在山羊睾丸、附睾组织中的相对表达量； 三、 制备山羊睾丸、附睾组织切片；组织免疫荧光技术检测RanBP9蛋白在山羊睾丸、附 睾组织中的表达； 四、 精子细胞免疫荧光技术研究RanBP9蛋白在精子中的定位。2.权利要求1所述的山羊Ran结合蛋白9 (RanBP9)基因克隆及其在精子中的定位检 测方法，其特征在于步骤一中的RT-PCR模板是山羊睾丸组织提取RNA，设计特异引物和扩 增方法。3. 权利要求1所述的山羊Ran结合蛋白9 (RanBP9)及其在精子中的定位，其特征在于 步骤四中进行组织免疫荧光实验，采用改进的细胞离心管免疫荧光法，按以下步骤进行： (1) 采用假阴道法采集成年山羊的精液，进行精液品质鉴定； (2) 取5(^1精液于1.5 1111离心管中，加入950以1生理盐水，于4°(： 1000印111离心5 min，重复一次；吸去生理盐水，以4°CPBS重悬细胞； (3) 离心吸去PBS，以1ml4%PFA固定重悬精子，置于冰上固定30min; (4) 离心吸去固定液，用1.5ml4°CPBS重悬精子，放置5min后，用PBS再次洗涤精 子； (5) 离心吸去PBS，重悬精子于一抗中，置于4°C温育1h; (6) 离心吸去PBS，以二抗重悬精子，4°C温育lh;用4°CPBS稀释精子和抗体至1. 5ml;离心吸去PBS，以4°CPBS重悬精子，重复一次； (7) 暗处离心，以少量PBS重悬，将适量的精子细胞悬液滴于多聚赖氨酸覆层的载玻片 上，加盖玻片，马上使用荧光显微镜观察拍照。
【专利摘要】本发明公开了山羊Ran结合蛋白9（RanBP9）基因克隆及其在精子中的定位检测方法，涉及生物技术领域。本发明的目的是提供山羊RanBP9基因克隆及其在精子中的定位检测方法。方法：一、克隆引物设计；二、RT-PCR扩增序列，测序获得山羊RanBP9基因序列；三、RanBP9？mRNA先对表达量分析；四、RanBP9蛋白在组织中的表达；五、精子细胞免疫荧光方法检测RanBP9在精子中的定位。通过本发明获得了山羊RanBP9基因序列，研究了RanBP9？mRNA和蛋白质在不同组织中的表达及其在精子上的定位，为研究其在山羊生长发育中的功能奠定基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/12, G01N33/569, C12N15/10, G01N33/68
【公开号】CN105368840
【申请号】CN201510914039
【发明人】赵永聚, 沈彦花, 唐毅平
【申请人】西南大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月12日