多肽、单克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地，多肽、单克隆抗体及其制备方法和应用，更具 体地，涉及分离的多肽、单克隆抗体及其制备方法以及用于检测血清中细胞周期因子γ的试 剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 细胞周期因子Y(CCNY)又称CyclinY、cyc_Y、周期素盒蛋白l(cyclinboxprotein 1)、周期素折叠蛋白l(cyclinfoldprotein1)或周期素盒携带蛋白l(cyclin-box carryingprotein1)，是近年来新发现的一种细胞周期蛋白，其编码基因ccny定位于10号 染色体，全长3968bp，有10个外显子，9个内含子。细胞周期因子Y含有341个氨基酸，分子量 约为39KD。研究显示，CCNY基因水平的变化影响着细胞周期的进程，进一步影响着肿瘤细胞 的增殖，迀移与侵袭能力，从而影响着肿瘤的发生、发展的进程。据最新的研究显示，细胞周 期因子Y不仅能够促进脑胶质瘤细胞的增殖，细胞周期因子Y还能促进直肠癌瘤细胞的粘附 能力、细胞的迀移和侵袭，从而影响着直肠癌细胞的转移。关于细胞周期因子Y表达水平的 研究显示，应用免疫组化的方法对非小细胞肺癌组织以及癌旁组织中的细胞周期因子Y水 平进行检测，结果显示细胞周期因子Y水平在癌症组织中明显高于癌旁组织。因此细胞周期 因子Y表达水平的改变与肿瘤的发生、发展存在着一定的关系。
[0003] 目前临床蛋白水平检测最常见的使用方法是免疫组织化学法，但是免疫组织化学 法所需的组织标本一般是通过有创的手段如活体取样或是通过手术获得，在无创情况下难 以得到，并且大部分患者是在疾病已经发生了影像学改变的情况下才进行免疫组织化学的 检测，因此拖延了诊断和治疗时间。以免疫反应为基础的酶联免疫吸附实验(ELISA)的检测 方法，可以快速，可靠，有效的对血清中细胞周期因子Y进行检测，与免疫组织化学相比较， ELISA检测方法成本低，所需设备简单，检测样本易获得，高效，快速，操作方便，易于临床推 广。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种简单易行，灵敏、准确和快速检测血清细胞周期因子Y的试剂盒和方法。
[0005] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所 述多肽具有SEQIDNO: 1所示氨基酸序列。
[0006] 根据本发明的又一方面，本发明提供了一种单克隆抗体。根据本发明的实施例，所 述单克隆抗体的识别表位是SEQIDNO: 1所示氨基酸序列。
[0007] 根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前述单克隆抗体的方法。根据本 发明的实施例，该方法包括:将前述的多肽与KLH载体蛋白进行连接，以便得到载体-多肽连 接体溶液;将所述载体-多肽连接体溶液与弗氏佐剂混合并乳化，以便得到免疫乳剂;利用 所述免疫乳剂对哺乳动物进行初次免疫，以便得到初次免疫后的哺乳动物;利用所述免疫 乳剂对所述初次免疫后的哺乳动物进行加强免疫，以便得到加强免疫后的哺乳动物;提取 所述加强免疫后的哺乳动物的脾细胞，并将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以便得到杂交 瘤细胞;将所述杂交瘤细胞腹腔接种至经降植烷预处理的哺乳动物，其中，每只哺乳动物接 种的所述杂交瘤细胞的数量为5.0\10 6-5.0\107，以便得到腹水；以及将所述腹水进行纯 化，以便获得所述单克隆抗体。由此，利用该方法获得识别细胞周期因子Y中段的单克隆抗 体。
[0008] 根据本发明的再一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试 剂盒包括固相载体，其中，所述固相载体上携带前述的单克隆抗体。由此，利用该试剂盒可 以简便、准确、灵敏和高效的检测细胞周期因子Y，尤其是人血清和血浆中的细胞周期因子 Yo
[0009] 根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于检测细胞周期因子Υ的方法。根据 本发明的实施例，该方法包括：（1)包被前述的单克隆抗体至试剂板，4°C过夜后洗板，以便 得到包被所述单克隆抗体的固相载体；（2)向所述包被细胞周期因子Y的固相载体中加入2-10%胎牛血清封闭液，4°C封闭过夜后洗板，以便得到封闭后的固相载体；（3)将细胞周期因 子Y和待检测的样品进行梯度稀释，并加入到所述封闭后的固相载体中，孵育后洗板；（4)向 步骤(3)得到的固相载体中加入识别所述细胞周期因子Y的多克隆抗体，孵育后洗板；（5)向 步骤(4)得到的固相载体中加入辣根酶标记抗体，孵育后洗板；（6)向步骤(5)得到的固相载 体中加入底物显色液；以及(7)向步骤(4)得到的固相载体中加入终止液，终止反应，检测 0D450的值，通过分析0D450值的大小，判断人细胞周期因子Y的浓度。由此，利用该方法可以 简便、准确、灵敏和高效的检测细胞周期因子Y，尤其是人血清和血浆中的细胞周期因子Y。
[0010] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0011] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0012] 图1显示了根据本发明一个实施例的制备单克隆抗体的方法流程图；
[0013] 图2显示了根据本发明一个实施例的用于检测血清中细胞周期因子Y的方法流程 图；
[0014] 图3显示了根据本发明一个实施例的标准曲线的示意图。
【具体实施方式】
[0015] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0016] 在本发明的描述中，术语"纵向"、"横向"、"上"、"下"、"前"、"后"、"左"、"右"、"竖 直"、"水平"、"顶"、"底"等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是 为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对 本发明的限制。
[0017] 需要说明的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可以 明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说 明，"多个"的含义是两个或两个以上。
[0018] 分离的多肽、单克隆抗体及其制备方法
[0019] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所 述多肽具有SEQIDN0:1所示氨基酸序列，其中，SEQIDN0:1所示氨基酸序列具体如下：
[0020] ENLHPLSKSEVPPDYDKHNPEQKQIYRFVR(SEQID N0：1)
[0021] 本文所用术语"分离的"是指如核酸或者蛋白质等材料，其与其天然存在的环境相 分离。所述分离的材料任选包含在其天然环境中未发现的材料。
[0022] 根据本发明的又一方面，本发明提供了一种单克隆抗体。根据本发明的实施例，所 述单克隆抗体的识别表位是SEQIDN0:1所示氨基酸序列。SEQIDN0:1所示氨基酸序列存 在于细胞周期因子Y的氨基酸序列中段，进而，该单克隆抗体可以特异性地与细胞周期因子 Y结合。
[0023]抗体与抗原的结合被称为"特异性结合"，这意味着：（1)抗原抗体之间显示出结合 活性的阈水平，（2)特异性结合的表现在于单克隆抗体仅识别并结合细胞周期因子Y中段氨 基酸序列，不能识并结合别细胞周期因子Y其他位点的氨基酸，（3)单克隆抗体结合在细胞 周期因子Y中段的氨基酸后，其他抗体不能再结合此位点，抗原或抗体不与已知的相关多肽 分子发生显著的交叉反应。本领域的普通技术人员可以很方便地使用某种技术测定抗体的 结合亲合力，如通过Scatchard分析（ScatchardG·Theattractionsofproteinsfor smallmoleculesandions[J].Ann.NYAcad.Sci.，1949;51:660_672·)。本发明的抗体与 细胞周期因子Y的结合极显著高于其它细胞周期因子Y相关蛋白。在本发明的一些实施例 中，本发明的抗体不与已知的相关的多肽分子特异性结合，例如，使用标准的 Westemblotting分析，它们与细胞周期因子Υ结合的同时不与已知的相关多肽结合.其它本 领域众所周知的分析的典型例子包括:放射性免疫分析(RIA)、放射免疫沉淀法、酶联免疫 吸附分析(ELISA)、点杂交或抑制或竞争分析和三明治分析法。
[0024] 本文所述"多克隆抗体"，简称"多抗"，指通过多次皮下（sc)、腹腔内（ip)或肌内 (im)注射相应抗原和助剂，在动物中产生的离散抗体的混合物。本文所用的术语"单克隆抗 体"，简称"单抗"，指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，