一种单克隆抗体及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体含有SEQ ID No.2所示的重链和SEQ ID No.4所示的轻链。用其制备的猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)敏感性好、特异性高，便于更准确地检测感染猪瘟病毒的猪只；用其制备的猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(竞争法)检测用时短，可用于快速初筛感染猪瘟病毒的猪只，为猪瘟病毒的进一步净化提供支持；该单克隆抗体还具有中和活性，还可用于制备预防和/或治疗猪瘟相关疾病的药物。
【专利说明】
一种单克隆抗体及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种抗猪瘟病毒单克隆抗体，以及含单克隆抗体制备的抗体检测试剂 盒和药物组合物，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 猪痕（Classical swine feve，CSF)是由猪痕病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触传染性疾病，以发病急、高热稽留、组织和器官的广泛性 出血坏死为特征;被国际兽医局确定为A类病，被我国列为一类动物传染病。该病在多个国 家和地区广泛流行，造成了巨大的经济损失。即便如此，我国虽控制了烈性猪瘟的发生和流 行，但目前仍以新的特点与形式在我国持续存在，严重威胁了我国养猪业(黄文峰，杨惠超. 猪瘟的流行特点及防控措施.养殖与饲料，2016，（ 1): 47-48)。
[0003] 猪瘟诊断技术历来为国际畜牧兽医界所重视，检测猪瘟抗体作为猪瘟诊断技术之 一在临床广泛应用。目前，国内外猪瘟抗体的检测方法包括体外病毒中和试验、体内病毒中 和试验，操作繁琐，需要有专业化的实验室及技术人员;现在使用的猪瘟正相间接血凝试验 (IHA)，其试验结果需用肉眼判定受主观人为因素影响极大;琼脂扩散试验(AGP)，但其单敏 感性低。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种抗猪瘟病毒单克隆抗体，可以有效地 诊断猪瘟病毒及其感染、预防和/或治疗猪瘟病毒所引发的感染;含所述抗猪瘟病毒单克隆 抗体的检测试剂盒，可快速、简便、准确地检测猪瘟病毒抗体。
[0005] 本发明涉及一种特异性结合猪瘟病毒的单克隆抗体的可变区序列，其中，1)重链 可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添 加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突 变获得的保守性变异体。
[0006] 本发明还涉及具有上述重链可变区序列和/或轻链可变区序列的抗体或抗体的片 段，所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪瘟病毒的能力。
[0007] 本发明还涉及抗体检测试剂盒，其中，所述抗体检测试剂盒包括固定在支持介质 上的猪瘟病毒抗原、有效量的标记的所述的抗体或所述抗体的片段，以及检测猪瘟病毒抗 原抗体反应进行检测的检测试剂。
[0008] 本发明涉及所述抗体检测试剂盒在用于非诊断目的的猪瘟病毒抗体检测中的应 用，其中，所述非诊断目的的猪瘟病毒抗体检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性和 定量猪瘟病毒抗体的检测、国际生猪贸易、进出口检疫检验。
[0009] 本发明涉及一种抗猪瘟病毒药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的所 述的抗体或所述抗体的片段，以及药学上可接受的载体。
[0010] 本发明涉及所述抗猪瘟病毒药物组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病毒感染相关 疾病的药物中的应用。
[0011] 本发明的有益效果在于：
[0012] (1)本发明抗体检测试剂盒当用阻断法进行猪瘟抗体检测时，含酶标记的本发明 的抗猪瘟病毒单克隆抗体作为竞争抗体，提高了检测猪瘟病毒抗体的准确性；
[0013] (2)本发明抗体检测试剂盒当用竞争法进行猪瘟抗体检测时，可用于快速初筛感 染猪瘟病毒的猪只；
[0014] (3)本发明的抗猪瘟病毒单克隆抗体具有中和猪瘟病毒的特性，可用于预防和/或 治疗猪瘟病毒所引发的感染，弥补了现有疫苗单一预防和/或治疗的作用。
【具体实施方式】
[0015] 以下，对本发明的实施方式进行说明。
[0016] 术语"猪痕病毒"（Classical swine fever virus，CSFV)在分类上属黄病毒科痕 病毒属，是一种正链单股RNA病毒，猪感染后以高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗 塞为特征。
[0017] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个 体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该抗体的性质不 是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合 抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗 原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、猪源化抗体以及抗体的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类;也可以是包含抗原结 合结构域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1;和双链抗体((1丨3130(1丨68)。融合至另一多肽的、包 含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产 生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋 白可变区或互补性决定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区， 参见EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细 胞进行遗传突变或其它改变，这可以不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的"单克 隆抗体"也可用基因工程方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术 人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而 也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后， 在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟 知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的 多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别（同型物）。 重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三 个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区（不同于重链的可变区）和单个恒定区（不同于重 链的恒定区）。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
[0018] 术语"重链可变区"是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相 应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语"轻链可变 区"是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从 轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体 公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程 和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保 守性变异体，而仍能够保持与猪瘟病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性 片段或保守性变异体。
[0019] 术语"中和活性"是指中和抗体具有中和病毒的作用，其中"中和抗体"在本文以最 广义使用，指的是抑制猪瘟重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举 例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体 直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion) 表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和 细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生 中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。
[0020] 本发明涉及一种特异性结合猪瘟病毒的单克隆抗体的可变区序列，其中，1)重链 可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添 加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突 变获得的保守性变异体。
[0021 ]优选地，所述单克隆抗体特异性结合猪瘟病毒的E2蛋白。
[0022]本发明还涉及一种由所述单克隆抗体可变区序列中重链可变区序列或其保守性 变异体，和/或所述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体或所述 抗体的片段;所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体;其中，所述基因工程抗体包括单 链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或双特异性抗体;所述抗体或 所述抗体的片段仍保持特异性结合猪瘟病毒的能力。
[0023]作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体15A9,所述单克隆抗体15A9 重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2,和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4。 [0024]作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体15A9,所述单克隆抗体15A9 重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列或其简并序列编码，和轻链可 变区的氨基酸序列由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或其简并序列编码。
[0025]所述单克隆抗体15A9为抗猪瘟病毒单克隆抗体15A9,其中和活性效价为1:6400， 具有良好的中和活性;IPMA(免疫过氧化物酶单层细胞试验)效价为1:12800,与猪瘟病毒具 有良好的反应性。
[0026]术语"有效量"当理解为"诊断有效量"时，是指能够利用所述单克隆抗体有效检测 样品中是否存在猪瘟病毒抗体的量。根据已知的免疫化学检测方法，本领域技术人员能够 知晓，所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方法的不同而不同，根据公知文献的教 导，本领域技术人员知晓如何选择适当的本发明所述单克隆抗体用量，以用于诊断样品中 是否存在猪瘟病毒。
[0027]术语"酶"是包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的任一种。
[0028]术语〃磷酸盐缓冲液〃是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学 研宄中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限 于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢 二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓 冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pHl0的范围，优选约pH5至pH9 的范围，更优选约pH6至约pH8的范围，最优选pH7.2至pH7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓 冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
[0029] 本发明还涉及一种抗体检测试剂盒，其中，所述抗体检测试剂盒包括固定在支持 介质上的猪瘟病毒抗原、有效量的标记的所述的抗体或所述抗体的片段，以及检测抗原抗 体反应的试剂;所述支持介质包括微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜;所述标记的 所述抗体或所述抗体的片段的标记物包括酶、胶体金、荧光；以及所述检测抗原抗体反应的 试剂为与所述标记物发生颜色反应的底物，包括酶显色试剂、荧光试剂、胶体金试剂、化学 发光试剂。
[0030] 作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中所述抗体为单克隆抗体 15A9〇
[0031] 作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒包括包被猪瘟病毒抗原的微滴 定板、有效量的酶标记的所述单克隆抗体15A9、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性 对照、阳性对照;所述猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒E2蛋白。
[0032] 作为本发明的一种实施方式，所述洗涤液为含吐温的磷酸盐缓冲液，所述稀释液 为磷酸盐缓冲液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为2mol/l的浓 H2S04溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为猪瘟病毒感染猪的阳性血清。 [0033]优选地，所述磷酸盐缓冲液pH为7.2-7.4。
[0034] 术语"方法"可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、胶体金检测、化学发光 免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法及类似检测方法。
[0035] 术语"样品"包括但不限于动物或患者的血清等。
[0036] 本发明还涉及所述抗体检测试剂盒检测样品中猪瘟病毒抗体的检测方法，所述检 测方法包括:步骤（1)将检测样品、阴性对照、阳性对照分别加入包被猪瘟病毒抗原的反应 孔，检测样品中的猪瘟病毒抗体与包被的猪瘟病毒抗原发生抗原抗体反应;步骤(2)将标记 的所述抗体或所述抗体的片段加入反应孔，所述抗体或所述抗体的片段与包被的猪瘟病毒 抗原抗体发生反应;其中，所述步骤（1)中猪瘟病毒抗原附着在支持介质上，所述支持介质 优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜中的任一种;其中，所述方法步骤(2)中 所述反应可通过酶显色、荧光、胶体金、化学发光中的任一种方法进行测定;其中，所述步骤 (2)中的所述抗体或所述抗体的片段为所述单克隆抗体15A9;步骤(3)根据阴性对照和检测 样品的测定值计算是否为检测样品阳性。
[0037] 本发明还涉及所述抗体检测试剂盒检测样品中猪瘟病毒抗体的检测方法，所述检 测方法包括:步骤（1)将检测样品、阴性对照、阳性对照分别与所述标记的所述抗体或所述 抗体的片段共同加入包被猪瘟病毒抗原的反应孔;步骤(2)所述抗体或所述抗体的片段与 检测样品、阴性对照、阳性对照中的猪瘟病毒抗体共同竞争结合包被的猪瘟病毒抗原以发 生抗体抗体反应;其中，所述步骤（1)中猪瘟病毒抗原附着在支持介质上，所述支持介质优 选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜中的任一种;其中，所述方法步骤(2)中所 述反应可通过酶显色、荧光、胶体金、化学发光中的任一种方法进行测定；其中，所述步骤 (2)中的所述抗体或所述抗体的片段为所述单克隆抗体15A9;步骤(3)根据阴性对照和检测 样品的测定值计算是否为检测样品阳性。
[0038]本发明还涉及所述抗体检测试剂盒在用于非诊断目的的猪瘟病毒抗体检测中的 应用，其中，所述非诊断目的的猪瘟病毒抗体检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性 和定量猪瘟病毒抗体的检测、国际生猪贸易、进出口检疫检验。
[0039]术语"免疫量"是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量，或能够对受 试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述免疫量随免疫接种的 方式、时机、治疗方案、病程、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本 领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用 单克隆抗体的免疫量。
[0040] 术语"药学上可接受的载体"是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和 特性的载体或者稀释剂。
[0041] 本发明还涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的所述抗体或 所述抗体的片段，以及药学上可接受的载体。
[0042] 作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆抗体 15A9，以及药学上可接受的载体。
[0043]作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体15A9 的重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
[0044] 作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体15A9 的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
[0045] 术语"预防和/或治疗"在涉及猪瘟病毒感染时是指抑制猪瘟病毒的复制、抑制猪 痕病毒的传播或防止猪痕病毒在其宿主体内定居，以及减轻猪痕病毒感染的疾病或病症的 症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗 达到了治疗效果。
[0046] 术语"猪"是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。
[0047] 本发明还涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病毒感染相关疾病的药 物中的应用。
[0048]作为本发明的一种方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体15A9的药物 组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病毒感染相关疾病的药物中的应用。
[0049] 作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体15A9的 重链可变区制备的单链抗体的药物组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病毒感染相关疾病的 药物中的应用。
[0050] 作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体15A9的 重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体的药物组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病 毒感染相关疾病的药物中的应用。
[0051] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0052]本发明实施例中所用的包被液为PH9.6的碳酸盐缓冲液，其1L体积配方为:Na2C031.59g、NaHC〇3 2.93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0053]本发明实例中所用的样品稀释液为pH7.2的磷酸缓冲液(简称PBS)，其1L体积配方 为:Na2HP〇4· 12H20 39.7g;NaH2P〇4,2H2〇 6.72g;NaCl 9g，充分溶解后，121°C30min高压灭 菌;样品洗涤液为含〇. 05 % V/V的Tween-20的roS溶液，但该实施方式无论在任何情况下均 不构成对本发明的限定。
[0054]本发明实施例中所用的阴性对照为PBS，阳性对照为猪瘟病毒抗体阳性血清的稀 释液，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0055]本发明实施例中所用的底物显色液包括A和B，其中A为将200mg四甲基联苯胺TMB 加入100ml无水乙醇(或DMS0)中，并用双蒸水定容至1000ml;B为将无水Na2HP〇4 28.2g、一水 朽1檬酸21g、0.75%过氧化氢尿素6.4ml混合后，用双蒸水定容至1000ml，调至pH4.5-5.0，置 4°C备用，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0056]本发明实施例中所用的终止液为2M的H2S〇4溶液，将21 . 7m 1浓硫酸逐滴加入 178.3ml蒸馏水中，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0057]本发明实施例中的酶标抗体以辣根过氧化物酶(HRP)为例进行标记，但该实施方 式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0058]本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
[0059]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说 明，均为常规方法;所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0060]实施例1抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 [0061 ] 1.1猪瘟病毒抗原的制备及含量的测定
[0062]参考何艳(何艳.猪瘟病毒E2蛋白在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体检测方法 的建立.2008，南京农业大学硕士学位论文)文献的操作方法制备猪瘟病毒抗原即E2蛋白； 按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司）说明书测定E2蛋白的浓 度，测定浓度为1. lmg/ml。
[0063] 1.2抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备和纯化
[0064] 将猪瘟病毒E2蛋白按照100yg/只200μ1的量免疫小鼠，按照HarlowE等(Harlow E， Lane D.Antibodies:a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998,139-312)文献的操作方法制备获得小鼠杂交瘤细胞，进一步分别制备并纯化 以获得抗猪瘟病毒单克隆抗体15A9。
[0065] 1.3抗猪瘟病毒单克隆抗体的鉴定
[0066] 1.3.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
[0067]运用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit(购自Pierce公司）并参照 说明书对抗体的亚型进行鉴定。鉴定结果见表1:
[0068]表1单克隆抗体类型的鉴定
[0069]
[0070] ~注:+表示阳性反应，示阴性反应。
' ' ' ' '
[0071 ]由表1可知，单克隆抗体15A9重链亚型为IgG2b，轻链类型为kappa。
[0072] 1.3.2单克隆抗体特异性的鉴定
[0073] 参考许保疆(许保疆等.抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定.华北 农学报，2009,24(3):64-68)采用间接ELISA法测定。分别将猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖 与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Sf9细胞培养上清抗 原（阴性对照）、猪瘟病毒（阳性对照）依次作为包被抗原，将制备的单克隆抗体15A9作为一 抗进行检测，用酶标仪在450nm处测定吸光值0D，根据P/N值（即阳性对照0D值/阴性对照0D 值)判定制备的单克隆抗体与其它抗原的交叉反应性，以P/N值2 2.0为阳性，以判断其特异 性。
[0074] 表2单克隆抗体特异性的鉴定结果
[0075]
[0076] 注:+表示阳性反应，-表示阴性反应。
[0077]测定结果显示：单克隆抗体15A9与其他病毒和阴性对照均不反应，仅与猪瘟病毒 发生反应，表明单克隆抗体15A9为针对猪瘟病毒的特异性单克隆抗体。
[0078] 1.3.3单克隆抗体IPMA效价的测定
[0079] 参照李晶梅(李晶梅等.IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量.中国兽药杂 志，2013,47(10):5-38)所述建立猪瘟病毒的1?1^检测方法对单克隆抗体1549进行1?1^效 价测定。结果表明：单克隆抗体15A9的IPMA效价为1:12800。
[0080] 1.3.4单克隆抗体中和活性的测定
[0081] 参照李素(李素等.阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较. 动物医学进展，2007，28(10): 40-43)中所述中和试验方法，对单克隆抗体15A9进行中和效 价的测定。结果显示:单克隆抗体15A9的中和效价为1:6400，有很好的中和病毒的能力，可 应用于制备预防和/或治疗猪瘟相关疾病的药物中。
[0082] 1.3.5单克隆抗体15A9可变区序列的测定
[0083] 根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计15A9重链可变区引物序列：
[0084] PI：GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYff
[0085] P2：CCAGGGRCCARKGGATARACNGRTGG
[0086] 设计15A9轻链可变区引物序列：
[0087] P3：ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCT
[0088] P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA
[0089] 按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗⑶分子单克隆抗体轻、重链可变 区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001，15(2):65-68)建立的可变区序列测 定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体15A9的可变区序列，选取对应的克隆质粒 送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体15A9的重链可变区、轻链可 变区的基因序列分别如SEQ ID No. 1、SEQ ID No.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID Νο·4〇
[0090]实施例2猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)的制备及检测方法及应用 [0091 ] 2.1酶标记的单克隆抗体15A9的制备与含量测定
[0092]避光条件下，采用改良过碘酸钠法HRP标记单克隆抗体:称取20mg辣根过氧化物酶 (HRP)溶于lml超纯水中，加入lml新鲜配制的NaI〇4溶液(具体为20mg NaI〇4溶于lml超纯水 中），混匀，4°C避光作用30分钟；在上述溶液中加入20μ1乙二醇溶液，4°C避光作用30分钟； 将lmg实施例1纯化的单克隆抗体15A9加入100μΙ上述混合液中，将两者混匀后，加入到透析 袋中混匀，并用碳酸缓冲液透析6小时；将透析后的混合液转移至1.5ml ΕΡ管中，加入10μ1 新鲜配制的NaBH4溶液(具体为1 Omg NaBH4溶于lml超纯水中），室温作用2小时，每隔30分钟 混匀一次;加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后，4°C作用15分钟，12000r/min离心10分钟，弃 上清;将沉淀用与纯化单克隆抗体等体积的ro(0.02m〇l/L，pH值7.4)与甘油的混合液(乂1 =1:1)吹悬即可获得酶标记的单克隆抗体15A9。
[0093]采用紫外分光光度计检测并计算酶标记的单克隆抗体15A9中单克隆抗体15A9的 浓度，结果表明：酶标记的单克隆抗体15A9中单克隆抗体15A9的浓度为6mg/m 1。
[0094] 2.2猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)的制备
[0095]用包被液稀释实施例1制备的猪瘟病毒E2蛋白至2.5μg/ml，100yl/孔包被于ELISA 反应板的反应孔中，于4°C孵育12h，用洗涤液洗涤后拍干反应板；用含5%m/v脱脂奶的PBS 在4 °C下封闭12h，干燥后真空封装，置4 °C备用。
[0096] 将实施例2.1制备的酶标记的单克隆抗体15A9用roS进行1:8000V/V稀释，即为酶 标试剂。
[0097]依次制备样品稀释液、阴性对照、阳性对照(其猪瘟抗体IPMA效价为1:3200)、底物 显色液A和B、终止液，并将包被过的ELISA反应板、酶标试剂组装以制备猪瘟病毒ELISA抗体 检测试剂盒(阻断法）。
[0098] 2.3猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)检测方法的建立
[0099] 将ELISA反应板平衡至室温，分别在反应板上的检测孔、阴性对照孔、阳性对照孔 中加入50μ1样品稀释液;再在各个检测孔中加入50μ1被检样品，同时在阴性对照孔中加入 50μ1阴性对照、阳性对照孔中加入50μ1阳性对照；于振荡器振荡使反应板中的各孔溶液混 匀;将反应板置于37°C湿箱中孵育1小时;弃去反应板内各孔溶液并用洗涤液洗3次，1分钟/ 次，拍干反应板;分别将1〇〇μ1实施例2.2制备的酶标试剂加入各孔中，于37°C湿箱中孵育30 分钟;弃去反应板内各孔溶液并用洗涤液洗3次，1分钟/次，拍干反应板;分别将50μ1的底物 显色液Α、Β加入各孔中，于避光、室温条件下放置15分钟；在各孔中加入50μ1终止液以终止 反应;用酶标仪在450nm处测定吸光值0D，并计算样品的阻断率：
[0100]
[0101] 当阻断率2 40%时，样品为阳性；当阻断率<30%，样品为阴性；当阻断率为30%- 40%时，样品为可疑，需重新检测。
[0102] 2.4猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)的质量研究
[0103] 灵敏度检验:采集并按实施例1.3.3方法测定IPMA效价为1:12800的猪瘟抗体阳性 血清，进行一系列稀释，稀释后对应IPMA效价依次为1:6400、1:3200、1:1600、1:800、1:400、 1:200。将实施例2.2制备的猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)按照实施例2中2.3的 方法进行检测，结果见表3。
[0104] 表3猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)灵敏度检验结果
[0105]
[0106] 注:+表示阳性;-表示阴性。
[0107]由表3可知:猪瘟抗体的IPMA效价为1:800时，猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒（阻 断法)检测仍为阳性。
[0108] 特异性测定：用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)对10份特异性样品进行 检测，特异性样品包含猪伪狂犬病毒抗体阳性血清、猪蓝耳病病毒抗体阳性血清、猪细小病 毒抗体阳性血清、猪圆环病毒2型抗体阳性血清及6份猪瘟病毒抗体阴性血清检测，结果均 为阴性，表明该试剂盒有良好的特异性。
[0109] 重复性测定:按实施例2.2制备五个猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法），并 对IPMA效价为1:1600的猪瘟抗体阳性血清进行重复性检测，检测结果均为阳性，且变异系 数为5.0 %，低于15 %。说明该试剂盒有良好的重复性。
[0110] 2.5猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)的应用
[0111] 2.5.1猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)与现有试剂盒比对试验
[0112] 将IPMA效价为1:12800的临床猪瘟病毒抗体的阳性血清，进行一系列稀释，稀释后 对应IPMA效价依次为 1:6400、1:3200、1:1600、1:800、1:400、1: 200，然后用猪瘟病毒ELISA 抗体检测试剂盒(阻断法)与IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒(简称IDEXX试剂盒，购自IDEXX 公司)分别进行检测(其中IDEXX试剂盒按照说明书进行），结果见表4。
[0113] 表4不同试剂盒的检验结果
[0114]
[0115] 注:+表示阳性;-表示阴性。
[0116] 由表4可知:猪瘟抗体的IPMA效价为1:800时，猪瘟病毒ELI SA抗体检测试剂盒（阻 断法)仍能检测为阳性，而IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测为阴性。
[0117] 2.5.2猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)与现有试剂盒的临床应用
[0118] 用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)及IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒(购 自IDEXX公司）同时检测324份临床样品，结果（见表5):两者共同检出阳性样品128份、阴性 样品173份；另外对猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)检测为阳性而IDEXX试剂盒检 测为阴性的23份样品，用李素(李素等，阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗 体的比较，动物医学进展，2007,28(10) :40-43)中所述中和试验方法进行检测，结果23份样 品均为阳性。
[0119] 表5猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)与IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒 检测临床样品的比较
[0120]
[0121] 综上所述，猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(阻断法)在猪瘟抗体血清IPMA效价为 1:800时检测仍为阳性，优于现有商品化的IDEXX试剂盒的;检测样品时的准确性也高于商 品化IDEXX试剂盒的。
[0122] 实施例3猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(竞争法)的制备及检测方法、质量研究
[0123] 3.1猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(竞争法)的制备
[0124] 按照实施例2.2制备猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，作为猪瘟病毒ELISA抗体检 测试剂盒(竞争法）。
[0125] 3.2猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(竞争)检测方法的建立
[0126] 分别将50μ1被检样品和50μ1实施例3.1制备的酶标试剂，以及50μ1的阴性对照与 50μ1实施例3.1制备的酶标试剂、50μ1阳性对照与50μ1实施例3.1制备的酶标试剂加入实施 例3.1制备的ELISA反应板的各孔中，于37°C温箱中孵育30分钟;弃去反应板各孔溶液并用 洗涤液洗3次，1分钟/次拍干反应板;分别将50μ1的底物显色液A、B加入反应孔中，于避光、 室温条件下放置15分钟;在每个反应孔中加入50μ1终止液以终止反应；用酶标仪在450nm处 测定吸光值0D，并计算样品的阻断率：
[0127]
[0128] 当阻断率2 40%时，样品为阳性；当阻断率<30%，样品为阴性；当阻断率为30%- 40%时，样品为可疑，需重新检测。
[0129] 猪瘟病毒抗体检测试剂盒(竞争法)检测时仅需45分钟，可用于快速初筛感染猪瘟 病毒的猪只，为猪瘟病毒的进一步净化提供支持。
[0130] 实施例4基因工程抗体的制备
[0131] 应用S0E-PCR(重叠延伸多聚酶链式反应)方法，将单克隆抗体15A9的重链可变区 和轻链可变区的基因序列（依次见SEQ ID No. 1、SEQ ID No.3)通过一条连接肽连接，得到 完整的单链抗体基因 ScFv-15A9。将ScFv-15A9基因通过基因工程手段插入到pCDNA-3.1载 体(购自武汉淼灵生物科技有限公司）中，构建P⑶NA-ScFv-15A9真核表达系统。
[0132] 将pCDNA-ScFv-15A9转染至MDCK细胞，24小时后收集上清，参照李素(李素等.阻断 ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较.动物医学进展，2007，28(10): 40- 43)中所述中和试验方法，对上清进行中和效价的测定。
[0133] 结果显示:单链抗体可以和猪瘟病毒发生特异性反应，其上清的中和效价为1:32， 具有中和猪瘟病毒的特性，据专利文献CN104651378A报导，中和效价为1:32的抗体即能有 效进行攻毒保护。
[0134] 以上结果显示SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3可用于猪瘟病毒基因工程抗体的制备， 且所制备的基因工程抗体可用于猪瘟病毒感染的预防和/或治疗。
[0135] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽 然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种特异性结合猪瘟病毒的单克隆抗体的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸 序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或 修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守 性变异体;优选地，所述单克隆抗体特异性结合猪瘟病毒的E2蛋白。2. -种由权利要求1所述可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述 的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体或所述抗体的片段;所述抗 体可以为单克隆抗体、基因工程抗体;其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆 抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或双特异性抗体;所述抗体或所述抗体的片段仍保 持特异性结合猪瘟病毒的能力。3. 根据权利要求2所述的抗体或所述抗体的片段，所述抗体为单克隆抗体15A9,所述单 克隆抗体15A9重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2,和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4。4. 一种抗体检测试剂盒，其中，所述抗体检测试剂盒包括固定在支持介质上的猪瘟病 毒抗原、有效量的标记的权利要求2所述的抗体或所述抗体的片段，以及检测抗原抗体反应 的试剂;所述支持介质包括微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜;所述标记的所述抗 体或所述抗体的片段的标记物包括酶、胶体金、荧光；以及所述检测抗原抗体反应的试剂为 与所述标记物发生颜色反应的底物，包括酶显色试剂、荧光试剂、胶体金试剂、化学发光试 剂。5. 根据权利要求4所述抗体检测试剂盒，其中，所述抗体为单克隆抗体15A9。6. 根据权利要求5所述抗体检测试剂盒，其中，所述抗体检测试剂盒包括包被猪瘟病毒 抗原的微滴定板、有效量的酶标记的所述单克隆抗体15A9、洗涤液、稀释液、底物显色液、终 止液、阴性对照、阳性对照;所述猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒E2蛋白。7. 根据权利要求6所述抗体检测试剂盒，其中，所述洗涤液为含吐温的磷酸盐缓冲液， 所述稀释液为磷酸盐缓冲液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为 2mol/l的浓H 2S04溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为猪瘟病毒感染猪的 阳性血清;优选地，所述磷酸盐缓冲液pH为7.2-7.4。8. -种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述抗体或所述抗 体的片段，以及药学上可接受的载体;优选地，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆抗 体15A9,以及药学上可接受的载体;优选地，所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体 15A9的重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体;更优选地，所述药物组合物 包括免疫量的所述单克隆抗体15A9的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体，以及 药学上可接受的载体。9. 如权利要求4-7任一项所述抗体检测试剂盒在用于非诊断目的的猪瘟病毒抗体检测 中的应用;其中，所述非诊断目的的猪瘟病毒抗体检测包括流行病学分析、对离体组织进行 定性和定量猪瘟病毒抗体的检测、国际生猪贸易、进出口检疫检验。10. 如权利要求8所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病毒感染相关疾病的药物 中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK105837686SQ201610365636
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】田克恭, 郝丽影
【申请人】洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司