抗人ror1单克隆抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗人R0R1单克隆抗体及其制备方法与应用，具体涉及一种人源 化的抗人R0R1单克隆抗体及其制备方法，以及所述单克隆抗体在癌细胞治疗的示踪和靶 向应用。
【背景技术】
[0002] 受体酪氨酸激酶样孤儿受体 _1(receptortyrosinekinase-likeorphan rec印tor，R0R1)蛋白最初是在20世纪90年代发现的，之所以被称为孤儿受体，是因为其 功能未知。之后有研宄人员发现R0R1能在胚胎发育过程中高水平表达，并在胚胎肌肉和骨 骼发育调控中扮演了重要的角色。但是在接下来的胎儿发育过程中，这种蛋白的表达被关 闭了，成人正常细胞和组织中通常并不表达R0R1。但是，癌细胞是一个例外。
[0003] 在2008年，Kipps博士研宄组发现Wnt5a配体和R0R1相互作用可以提高白血病 细胞的生存能力。R0R1应答产生的抗体可以阻碍机体生存信号，而且可以特异性地将这种 白血病细胞作为毁灭靶目标。这项研宄还指出R0R1抗原仅仅在白血病细胞中被发现，它可 以开发为一种癌症没有被检测到的时候，白血病的鉴别或监控治疗后细胞存在状态的特异 性标记。
[0004] 在2012年，Kipps研宄组发表研宄报告在胚胎发育过程中表达的蛋白R0R1在许 多不同类型的癌症中存在，但在正常产后组织中不表达。在这一基础上，研宄人员进行了 沉默实验，他们在人类乳腺癌细胞中沉默了R0R1蛋白，结果发现这减缓了癌细胞的生长速 度，并在实验室和动物实验中都得到了证实。
[0005]目前没有针对R0R1的特异性抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种对人R0R1特异性的单克隆抗体。
[0007] 本发明的另一目的在于提供分泌表达抗R0R1的单克隆抗体的细胞株。
[0008] 本发明的另一目的在于提供所述抗R0R1的单克隆抗体的制备方法。
[0009] 本发明的另一目的在于提供所述抗R0R1的单克隆抗体的应用。
[0010] 本案发明人经大量实验研宄，制得了一种抗人R0R1的单克隆抗体。本发明的单克 隆抗体是人源化的，其亲和力已经达到〇.InM的水平。这种高亲和力的单克隆抗体在临床 上具有重要的价值。
[0011] 具体而言，一方面，本发明提供了一种抗R0R1的人源化单克隆抗体，该抗体具有 重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)，所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定 区（CDR)，其中：重链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQIDN0:21或SEQIDN0:27,重链可 变区的0)1?2的氨基酸序列为5￡〇10勵:22或5￡〇10勵 :28，重链可变区的0)1?3的氨基酸 序列为SEQIDNO: 23或SEQIDNO: 29,轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQIDNO: 24 或SEQIDNO: 30,轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQIDNO: 25或SEQIDNO: 31，轻 链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQIDN0:26或SEQIDN0:32。
[0012] 根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体，所述重链可变区的CDR1~ 〇)1?的氨基酸序列分别为3￡0 10勵:21、3￡0 10勵:22、3￡0 10勵:23，或者分别为3￡0 10 N0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0:29 ;所述轻链可变区的CDR1~CDR3的氨基酸序列分别 为SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0:26,或者分别为SEQIDN0:30、SEQIDN0:31、 SEQIDN0:32。在本发明的一具体实施方案中，本发明的单克隆抗体，所述重链可变区的 〇?1~〇)1?3的氨基酸序列分别为5￡0 10勵:21、5￡0 10勵:22、5￡0 10勵:23，所述轻链 可变区的CDR1~CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0:26。 在本发明的另一具体实施方案中，本发明的单克隆抗体，所述重链可变区的CDR1~CDR3的 氨基酸序列分别为SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0:29;所述轻链可变区的CDR1~ CDR3 的氨基酸序列分别为SEQIDNO: 30、SEQIDNO: 31、SEQIDNO: 32。
[0013] 根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体，重链可变区的氨基酸序列如 SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDN0 :2或SEQID NO:8所示。根据本发明的一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序 列如SEQIDN0 :1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示；本发明中，将该单 克隆抗体命名为1G8单克隆抗体。根据本发明的另一具体实施方案，本发明的单克隆抗体 的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDN0 :7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDN0: 8所示；本发明中，将该单克隆抗体命名为3F4单克隆抗体。
[0014] 本发明中，进一步地，在所述的重链可变区的氨基酸和轻链可变区的氨基酸序列 基础上，在重链可变区（VH)的N端加上针对重链分泌表达优化的信号肽序列，在VH的C端 加上人IgGl-Fc恒定区序列（CH1-CH3)，构造出了重链全长的氨基酸序列。同时在轻链可变 区（VL)的N端加上轻链分泌表达优化的信号肽序列，在VL的C端加上人Kappa恒定区序 列，构造出轻链的全长氨基酸序列。即，根据本发明的一具体实施方案，本发明的单克隆抗 体的重链恒定区为人IgGl-Fc恒定区，轻链恒定区为人k链恒定区。
[0015] 根据本发明的一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列 分别如SEQIDN0 :4和SEQIDN0 :6所示；该抗体为本发明的抗R0R1的人源化单克隆抗体 1G8的一具体示例。根据本发明的另一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链和轻链的 氨基酸序列分别如SEQIDN0 :10和SEQIDN0 :12所示；该抗体为本发明的抗R0R1的人源 化单克隆抗体3F4的一具体示例。
[0016]另一方面，本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述的单克 隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者编码所述单克隆抗体的重链和/或轻链。
[0017] 另一方面，本发明还提供了一种分泌表达本发明所述的抗R0R1的人源化单克隆 抗体的细胞株。
[0018] 根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体表达细胞系是采用UC0E载体 技术及ClonePix单克隆筛选技术筛选得到的。更具体地，所述的分泌抗R0R1的人源化单 克隆抗体的细胞株是按照以下方法制备得到的：将带有编码本发明所述的抗体的重链的抗 体基因的表达载体、带有编码本发明所述的抗体的轻链的抗体基因的表达载体分别转入大 肠杆菌DH5a菌株，进行扩增培养，抽提纯化质粒DNA;其中，所述的表达载体优选为UC0E 载体，构建带有抗体基因的表达载体的具体操作可以参照现有技术进行；将所得纯化的质 粒DNA转染CHO细胞；转化的CHO细胞使用嘌呤霉素进行筛选，并在半固体选择培养基上进 行稀释，使用ClonePixFL进行克隆挑选。优选地，挑出多个单克隆细胞系在FreeStyle? CHO培养基中进行悬浮化扩大培养，对上清进行ELISA检测抗体表达量，从中挑选培养过程 中抗体最高表达量在200mg/L以上的克隆，即为所述的细胞株。
[0019] 在本发明的一具体实施例中（参见实施例4)，本发明筛选得到多株能够高表达 抗R0R1单克隆抗体的克隆作为本发明的细胞株，其中，这些细胞株分别命名为：1G8_5(本 发明中亦命名为 1G8-5C3)、1G8-2D1、1G8-6H4、1G8-2E10、1G8-3B9、3F4-2G7、3F4-5A6、 3F4-3D4、3F4-2C4、3F4-2A10。其中，1G8-5C3、1G8-2D1、1G8-6H4、1G8-2E10、1G8-3B9 能高 效地分泌表达本发明的抗R0R1的人源化单克隆抗体1G8 ; 3F4-2G7、3F4-5A6、3F4-3D4、 3F4-2C4、3F4-2A10能分泌表达本发明的抗R0R1的人源化单克隆抗体3F4。特别是，细胞株 1G8-5C3经过简单流加工艺培养后，单克隆抗体产量可高至2.lg/L，且抗体纯度高（可达 100%)，并具有很高的亲和力（达到O.lnM级别），极具产业化应用前景和价值。本发明的 细胞株1G8-5C3已于2015年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所），保藏 编号：CGMCCNo. 10583 ;分类命名：受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1人乳腺癌细胞。
[0020] 另一方面，本发明还提供了所述的抗R0R1的人源化单克隆抗体的制备方法，其包 括：培养本发明所述的分泌表达所述抗R0R1的人源化单克隆抗体的细胞株，收集细胞培养 液，离心，上清液经0. 45ym过滤后进ProteinA柱亲和纯化，得到抗R0R1的人源化单克隆 抗体。
[0021] 实验证明，本发明的方法所制备得到的抗R0R1的人源化单克隆抗体，其产量高， 极具产业化应用前景和价值；且纯度高（可高达98%以上）、亲和力强（亲和力可达到纳米 级别甚至〇.InM级别），在临床上具有重要的价值。
[0022] 具体地，细胞株的培养过程可以参照所属领域中的相关现有技术进行。本发明中 优选采用Feedbatch补料流加培养方式。
[0023] 综上所述，本发明采用UC0E载体技术及ClonePix单克隆筛选技术，筛选出一些单 克隆抗体表达细胞系，并据此提供了一种抗R0R1的人源化单克隆抗体及其制备方法与应 用，本发明的单克隆抗体纯度高、是人源化的，其亲和力已经达到〇.InM的水平，在临床上 具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0024] 图1 :1G8和3F4重链可变区与