一种单克隆抗体q411及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体Q411及应用。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒是迄今为止人类所知的最致命传染性病毒之一，平均病死率高达50% 左右。由于埃博拉出血热的高致死率，以及目前尚未有任何预防或治疗方法可在临床上广 泛使用。埃博拉病毒被列为生物安全第四级(Biosafety Level 4)病毒，同时被视为是生物 恐怖主义的工具之一。
[0003] 2014春季年开始在西非各国暴发的埃博拉疫情引起了全世界的广泛关注。截止至 2015年2月27日，埃博拉病毒确诊和疑似病例已经达到23825人，死亡人数达到9660人，美国 和一些欧洲国家已经有输入性的传播，并有死亡病例。因此，防控埃博拉病毒是全球所有国 家的头等大事。然而令所有人焦虑的是:到目前为止还没有一个被批准的埃博拉病毒疫苗 和药物上市。由美国和加拿大联合开发的应急性治疗药物ZMapp是目前唯一在模式动物和 小规模病人临床验证有效的药物。我国目前尚没有类似的应急药物，一旦有中国公民感染 埃博拉病毒，后果不堪设想。紧急研制埃博拉病毒抗体对于我国乃至全球埃博拉病毒疫情 的防控具有重要的意义，同时对社会的稳定和谐有着深远的影响。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种单克隆抗体Q411及应用。
[0005] 本发明保护的单克隆抗体Q411，为一种IgG抗体，由轻链和重链组成;所述重链中 的重链可变区中的⑶R1、⑶R2和⑶R3依次为序列表的序列3自N末端第45-52位氨基酸残基、 第70-79位氨基酸残基和第118-135位氨基酸残基；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、 CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N末端第45-53位氨基酸残基、第71-73位氨基酸残基和 第110-123位氨基酸残基。
[0006] 所述重链可为如下（a)或(b): (a)序列表的序列3自N末端第20-474位氨基酸残基 组成的蛋白质；（b)序列表的序列3所不的蛋白质。
[0007] 所述轻链可为如下（C)或(d):(c)序列表的序列5自N末端第20-237位氨基酸残基 组成的蛋白质；（d)序列表的序列5所不的蛋白质。
[0008] 本发明还保护编码所述IgG抗体的基因，其特征在于：
[0009]编码所述重链的基因为如下（1)或(2)或(3):
[0010] ⑴序列表的序列4自5'末端第889-2313位核苷酸所示的DNA分子；
[00?1 ] (2)序列表的序列4自5'末端第946-2313位核苷酸所不的DNA分子；
[0012] (3)序列表的序列4所示的DNA分子；
[0013] 编码所述轻链的基因为如下(4)或(5)或(6):
[0014] (4)序列表的序列6自5'末端第889-1602位核苷酸所不的DNA分子；
[0015] (5)序列表的序列6自5'末端第946-1602位核苷酸所不的DNA分子；
[0016] (6)序列表的序列6所示的DNA分子。
[0017] 本发明还保护所述IgG抗体在制备用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应 用。
[0018] 本发明还保护一种用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为所述 IgG抗体。
[0019] 本发明还保护所述IgG抗体在制备用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应 用。
[0020] 本发明还保护一种用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为所述 IgG抗体。
[0021] 本发明还保护所述IgG抗体在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引 起的埃博拉出血热的药物中的应用。
[0022] 本发明还保护一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起的埃博拉出血 热的药物，其活性成分为所述IgG抗体。
[0023]埃博拉病毒扎伊尔亚型又称扎伊尔埃博拉病毒，英文缩写为EB0V。
[0024]本发明利用EB0V的GPAm蛋白作为钓饵，从免疫猴的外周血单个核细胞中筛选抗 体生成的记忆B细胞，得到可同GPAm蛋白特异结合的单克隆抗体。通过EB0V假型病毒侵染 模型，筛选得到了具有中和活性同时具有良好的特异性的的单克隆抗体。
[0025]本发明对于扎伊尔埃博拉病毒的防控具有重大的应用价值，将产生深远的社会意 义。
【附图说明】
[0026]图1为抗体对EB0V的中和活性的结果。
[0027]图2为抗体对VSV的中和活性的结果。
[0028]图3为抗体对HIV的中和活性的结果。
[0029]图4为抗体对SUDV的中和活性的结果。
【具体实施方式】
[0030] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0031] 质粒PCDNA3 · 1 ( + ): Invi trogen公司，产品目录号V790-20。293T细胞：盖德，CRL-11268。恒河猴:蓝岛生物。PMD18T载体:Takara，产品目录号DlOlAJeroEe细胞:vircell公 司，产品目录号VCV6。
[0032] 质粒pNL4-3R-E-luciferase(骨架质粒）：参考文献：He J，Choe S，Walker R，Di Marzio P,Morgan D0,Landau NR.J Virol 69:6705-6711,1995.〇
[0033] 实施例1、抗体的发现
[0034] 一、GP Am蛋白的制备
[0035] 1、构建重组质粒
[0036] (1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0037] 序列表的序列2所示的双链DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质，其中开放 阅读框为序列2自5'末端第18-1451位核苷酸。序列表的序列1中，自N末端第1至19位氨基酸 残基组成信号肽，第472至477位氨基酸残基组成His 6标签。序列表的序列1所示的蛋白质的 预期分子量为200kDa。
[0038] (2)用限制性内切酶BamHI和Not I双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0039] (3)用限制性内切酶BamHI和Notl双酶切质粒pcDNA3.1( + )，回收约5400bp的载体 骨架。
[0040] (4)将步骤2回收的酶切产物和步骤3回收的载体骨架连接，得到重组质粒 pcDNA3.1 -GP Am。根据测序结果，对重组质粒pcDNA3.1 -GP Am进行结构描述如下：在质粒 pcDNA3.1 ( + )的BamHI和No t頂每切位点之间插入了序列表的序列2自5 '末端第11至1453位核 苷酸所示的双链DNA分子。
[0041 ] 2、构建重组细胞
[0042]将步骤1得到的重组质粒转染293T细胞，得到重组细胞。
[0043] 3、制备GP Am蛋白
[0044] (1)取步骤2得到的重组细胞，在含2 %胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后 4000rpm离心30min，收集上清液。
[0045] (2)亲和层析
[0046]亲和层析的层析柱规格:长度3cm，内径lcm;
[0047] 亲和层析的柱填料:镍柱beads(购自Qiagen公司，产品目录号为30230);
[0048]操作步骤:①将300mL步骤（1)得到的上清液上样于亲和层析柱，4°C孵育3小时;② 用100mL含20mM咪唑的上样缓冲液洗涤柱子;③用30mL含500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的 蛋白，收集过柱后溶液。上样缓冲液即HEPEs buffer。
[0049] (3)取步骤(2)得到的过柱后溶液，用30kD浓缩管（购自Merck公司，产品目录号为 UFC800396)进行浓缩，得到体积为lml的浓缩液。
[0050] (4)凝胶过滤层析
[0051]凝胶过滤层析的层析柱规格:长度24cm，内径2cm;
[0052]凝胶过滤层析的柱填料：superdex200increase 10/300GL(购自 GEHealthcare公 司，产品目录号为28-9909-44);
[0053] 操作步骤：上样0.5ml步骤（3)得到的浓缩液，用流速为0.5ml/min的PBS缓冲液 (pH7.2、10mM)洗脱，收集保留体积为1 lml的峰对应的过柱后溶液，即为GPAm蛋白溶液。 [0054] 二、从与GPAm蛋白特异结合的menory B细胞中分离抗体可变区基因
[0055] 1、将GPAm蛋白作为免疫原免疫恒河猴，然后取外周血并分离单个核细胞(PBMC)。
[0056] 2、采用流式细胞仪分选能够特异性识别GPAm蛋白的B细胞（CD3-CD16-CD235a- CD19+CD27+CD38-IgG+GPAm BCR+)。
[0057] 3、取步骤2得到的B细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。
[0058] 4、以步骤3得到的cDNA为模板，进行巢式PCR，将PCR扩增产物进行测序。
[0059] 获得重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列。
[0060] 三、获得抗体基因
[0061] 将重链可变区上游与CMV片段、重链可变区下游与人IgGl的恒定区以及ployA片 段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的DNA片段。
[0062] 将抗体轻链可变区上游与CMV片段、抗体轻链可变区下游与轻链κ/λ的恒定区以及 ployA片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的DNA片段。
[0063] Q411全长重链的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4 所示。序列表的序列3中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽（引导蛋白分泌到细胞外），第20 至144位氨基酸残基组成重链可变区，第145至474位氨基酸残基组成重链恒定区。序列表的 序列4中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889至2313位核苷酸编码序列表的序列3所 示的全长重链，第2314至2511位核苷酸为ployA片段。
[0064] Q411全长轻链的氨基酸序列如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列6 所示。序列表的序列5中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽（引导蛋白分泌到细胞外），第20 至131位氨基酸残基组成轻链可变区，第132位至237位氨基酸残基组成轻链恒定区。序列表 的序列6中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889至1602位核苷酸编码序列表的序列5 所示的全长轻链，第1603至1750位核苷酸为ployA片段。
[0065]实施例2、抗体的制备 [0066] 一、重组质粒的构建
[0067] 将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入PMD18T载体，得到重链表达载体。
[0068] 将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入PMD18T载体，得到轻链表达载体。
[0069] 二、重组细胞的构建
[0070]将重链表达