抗人crp抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的涉及两种抗人c-反应蛋白（CRP)抗体及其制备 方法以及上述抗体在人c-反应蛋白检测中的应用。
【背景技术】
[0002] C-反应蛋白（C reactive protein，CRP)是蛋白质家族中的一员，是一种急性期反 应蛋白，在组织损伤和细菌感染时血浆浓度急剧升高，是机体重要的防御分子，主要由肝脏 产生并分泌。CRP由五个完全相同的球形单体以非共价键结合组成稳定的盘状结构，属于正 五聚体家族。CRP在结构上为对称的五面体，其单体由206个氨基酸组成，分子量约为23KDa， CRP的总分子量约为118KDa<XRP参与体内的各种炎症及免疫反应，是冠状动脉粥样硬化性 心脏病(冠心病）的重要标志物。大量研究表明：高水平的CRP是周围性血管病、心肌梗死、脑 血管病及血管性死亡的独立风险预测因子。
[0003] 在正常人血清中CRP含量极少，浓度为0.062-8.2mg/L，半衰期约为15小时。当发生 细菌感染2小时后即开始升高，平均8小时增加1倍，48小时达高峰，其在病毒感染时则不会 升高。CRP持续升高则提示机体存在慢性炎症或自身免疫性疾病。CRP变化不受病人的个体 差异、机体状态及治疗药物的影响。另外，CRP在其他领域亦发挥着重要的作用:①在由慢性 炎症引发心血管疾病的独立危险因素中CRP的作用已被证实，及时监测CRP的水平变化对心 血管疾病的干预及预后起重要作用。有些学者甚至认为CRP可作为心血管危险评估的金标 准，且CRP水平越高，发生心脑血管的危险性就越大;②CRP可用来评价急性胰腺炎的严重程 度，当发生广泛坏死性胰腺炎时血清中CRP的水平可高达250mg/L;③如将CRP与甲胎蛋白联 合应用，可用来鉴别肝脏恶性肿瘤与良性疾病，为临床治疗方案制定提供指导；另外，CRP测 定对肿瘤的治疗和预后亦有积极的意义，恶性肿瘤患者CRP水平大都升高，手术切除肿瘤后 CRP水平则会下降，且进行放疗、化疗和皮质激素治疗对血清CRP的影响非常小，所以测定血 清CRP的水平变化有助于临床估测各个器官系统中恶性肿瘤的进展过程。④评估患者预后： CRP水平越高，提示疾病控制不佳，预后不良。
[0004] 鉴于CRP在众多领域中的重要作用，制备CRP抗体并用于制备CRP定量检测试剂盒 具有重要的临床应用价值。CRP通常是通过抗体浊度法或免疫比浊法测定的，而他们的检测 能力在3-5mg/L以上，这个水平仅仅适用于对感染的预测，而对于冠脉及脑血管的危险预测 是远远不够的。除上述技术以外，使用胶体金和荧光定量检测技术的CRP试纸卡，可满足快 速检测及床旁检测的需求。其中荧光定量检测具备较高的检测性能，因此适用于检测精密 度要求较高的检验中心或大型医院临床科室的应用需求。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人C-反应蛋白的抗体。更 具体地说：
[0006] 本发明的第一目的在于提供两种抗人C-反应蛋白抗体。
[0007]第一种抗人c-反应蛋白抗体(记为P24)，
[0008] 其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0:2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0:3所示的HCDR3;
[0009] 以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0010] 优选的是本发明中的抗体P24的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，轻 链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0011] 第二种抗人c-反应蛋白抗体(记为P03)，
[0012] 其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:9所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0:10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0:11所示的HCDR3;
[0013]以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 12 所示的!^0)1?1、如序列3￡〇10从)：13所示的10)1?2和/或如序列5￡〇10从)：14所示的10)1?3。 [0014]优选的是本发明中的抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，轻链可 变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0015]本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体P24的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示;所述单链抗体P03的氨基酸序列如SEQ ID N0:21所示。
[0016] 本发明第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体 ?24的核苷酸序列如3￡〇10勵：18所示，和编码单链抗体?03的核苷酸序列如3￡〇10勵:20 所示。
[0017] 本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
[0018] 本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞 可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。
[0019] 本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：
[0020] 1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；
[0021] 2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
[0022]本发明的第七个目的在于提供上述抗人C-反应蛋白抗体在检测人C-反应蛋白含 量中的应用。
[0023]本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人C-反应蛋白的抗体对组 合;该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。
[0024]本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人C-反应蛋白抗体检测人C-反应 蛋白的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡，包括样品垫、荧光结合垫、反应膜和吸水垫;所 述荧光结合垫喷涂有荧光微球标记的抗体P03,所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位 置包被有抗体P24,质控带位置包被抗His标签抗体或Protein L。所述反应膜优选硝酸纤维 素膜。所述抗Hi s标签抗体优选鼠抗Hi s抗体。
[0025]本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的 抗体组合(P24及P03);同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗 体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可 满足人临床样本检测的人C-反应蛋白的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡。
【附图说明】
[0026] 图1 ?抗体重链及轻链可变区基因电泳图。Lane 1和Lane4为200bp DNA Ladder; Lane 2为抗体P24重链可变区DNA; Lane 3为抗体P24轻链可变区DNA; Lane5为抗体P03重链 可变区DNA;Lane 6为抗体P03轻链可变区DNA。
[0027] 图2.单链抗体结构示意图。VH表示重链可变区序列，Vl表示轻链可变区序列，His标 签为六个组氨酸。
[0028] 图3.单链抗体PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0029] 其中，图3-a.为单链抗体P24基因PCR产物;图3-b为单链抗体P03基因PCR产物。
[0030] 图4.重组单链抗体毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液鉴定图。
[0031] 其中，图4-a为重组单链抗体P24重组毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液SDS-PAGE 电泳鉴定图；图4-b为重组单链抗体P03重组毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液SDS-PAGE电 泳鉴定图。
[0032]图5. SDS-PAGE电泳鉴定单链抗体纯化效果图。
[0033] 其中，图5-a为SDS-PAGE电泳鉴定单链抗体P24纯化效果图；图5-b为SDS-PAGE电泳 鉴定单链抗体P03纯化效果图
[0034] 图6.为本发明时间分辨免疫荧光层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反 应膜、3为吸水垫、4