高度半乳糖基化的抗her2抗体及其用图
【专利说明】高度半乳糖基化的抗HER2抗体及其用途
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C§ 119(e)要求2013年2月13日提交的标题为"高度半乳糖 基化的抗HER2抗体及其用途"的美国临时申请系列号61/764, 488的权益，其全部公开通过 提述并入本文。 发明领域
[0003] 本发明部分涉及抗HER2抗体领域。
[0004] 发明背景
[0005]HER2 (人上皮生长因子受体2)，也称为HER2/neu或ErbB2,是上皮生长因子受体 家族的成员。HER2是一种质膜结合受体酪氨酸激酶，其可以与自身和上皮生长因子受体家 族的其它成员（HER1，HER2，HER3和HER4)二聚化。二聚化继而导致多种细胞内途径的活 化。HER2是一种癌基因，其在多种癌症中过表达，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌和子宫癌。癌症 ("HER2+"癌症）中的HER2过表达与不良预后相关。
[0006] HER2是结合HER2/neu受体胞外段的域IV的单克隆抗体曲妥珠单抗 (trastuzumab) (Herceptin)的革巴标。曲妥珠单抗由FDA在1998年批准并已经用于治疗 HER2+乳腺癌和HER2+胃癌。然而，在大量患有HER2+癌症的患者中，曲妥珠单抗并不是治 疗有效的。另外，使用曲妥珠单抗治疗与心功能障碍和另外不想要的副作用相关。因此，需 要具有改进的治疗特性的抗HER2抗体。
[0007] 发明简述
[0008] 在一个方面，本公开涉及高度半乳糖基化的抗HER2抗体及其组合物。在一个方 面，本公开涉及具有高半乳糖基化水平的抗HER2抗体群体，及其组合物。在一个方面，本公 开涉及产生和使用高度半乳糖基化的抗HER2抗体和具有高半乳糖基化水平的抗HER2抗体 群体的方法。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
[0009] 在一个方面，本公开提供抗HER2抗体，其中所述抗体为高度半乳糖基化的。在一 些实施方案中，所述抗体为高度岩藻糖基化的。在一些实施方案中，所述抗体包含单半乳糖 基化的N-聚糖。在一些实施方案中，所述抗体包含双半乳糖基化的N-聚糖。在一些实施方 案中，所述抗体的重链包含SEQIDN0:1，而所述抗体的轻链包含SEQIDN0:2。在一些实 施方案中，所述抗体是曲妥珠单抗。在一些实施方案中，所述抗体在非人哺乳动物的乳腺上 皮细胞中产生。在一些实施方案中，所述抗体在转基因非人哺乳动物中产生。在一些实施 方案中，所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛（bison)、骆驼、母牛（cow)、猪、兔、水牛、马、 大鼠、小鼠或羊驼（llama)。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊。
[0010] 在一个方面，本公开提供本文公开的任意抗体的组合物，其中所述组合物进一步 包含乳。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
[0011] 在一个方面，本公开提供组合物，其包含抗体群体，其中所述抗体是抗HER2抗体， 而其中所述群体中抗体的半乳糖基化水平至少为50%。在一些实施方案中，所述群体中抗 体的半乳糖基化水平至少为60%。在一些实施方案中，所述群体中抗体的半乳糖基化水平 至少为70%。在一些实施方案中，所述群体中抗体的岩藻糖基化水平至少为50%。在一些 实施方案中，所述群体中抗体的岩藻糖基化水平至少为60%。在本文提供的任意组合物的 一些实施方案中，所述群体包含抗体，其包含单半乳糖基化的N-聚糖。在本文提供的任意 组合物的一些实施方案中，所述群体包含抗体，其包含双半乳糖基化的N-聚糖。在本文提 供的任意组合物的一些实施方案中，所述群体中抗体的半乳糖基化水平与群体中抗体的岩 藻糖基化水平的比率在1. 〇和1. 4之间。在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，群 体中至少25 %的抗体包含双半乳糖基化的N-聚糖，而群体中至少25%的抗体包含单半乳 糖基化的N-聚糖。在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 1，而抗体的轻链包含SEQIDNO:2。在本文提供的任意组合物的一些实施方案中， 所述抗体是曲妥珠单抗。在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，所述抗体在非人哺 乳动物的乳腺上皮细胞中产生。在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，所述抗体在 转基因非人哺乳动物中产生。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、 骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山 羊。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含乳。在一些实施方案中，所述组合物进一步 包含药学上可接受的载体。
[0012] 在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与不在乳腺上皮细胞中产生的抗 体群体比较时，所述抗体群体具有增加的补体依赖性细胞毒性（CDC)活性水平。
[0013] 在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与不在乳腺上皮细胞中产生的抗 体群体比较时，所述抗体群体具有增加的抗体依赖性细胞性细胞毒性（ADCC)活性水平。
[0014] 在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与不在乳腺上皮细胞中产生的抗 体群体比较时，所述抗体群体具有增加的抑制受试者中HER2活性的能力。
[0015] 在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与不在乳腺上皮细胞中产生的抗 体群体比较时，所述抗体群体具有增加的结合HER2的能力。
[0016] 在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与不在乳腺上皮细胞中产生的抗 体群体比较时，所述抗体群体具有增加的抑制HER2二聚化的能力。
[0017] 在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，所述不在乳腺上皮细胞中产生的抗 体在细胞培养物中产生。
[0018] 在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与在乳腺上皮细胞中产生的抗体 的半乳糖基化水平比较时，所述不在乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平为50% 或更低。在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与在乳腺上皮细胞中产生的抗体 的半乳糖基化水平比较时，所述不在乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平为30% 或更低。在本文提供的任意组合物的一些实施方案中，当与在乳腺上皮细胞中产生的抗体 的半乳糖基化水平比较时，所述不在乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平为10% 或更低。
[0019] 在一个方面，本公开提供用于产生抗体群体的方法，其包含：在非人哺乳动物的乳 腺上皮细胞中表达抗体群体，使得抗体群体产生，其中所述抗体是抗HER2抗体，其中所述 群体中的抗体的半乳糖基化水平为至少50%。在一些实施方案中，所述乳腺上皮细胞在培 养物中并使用包含编码所述抗体的序列的核酸转染。在一些实施方案中，所述乳腺上皮细 胞在非人哺乳动物中，所述动物经工程化来在其乳腺中表达包含编码所述抗体的序列的核 酸。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQIDNO:3和SEQIDNO:4.在一些实施方案中， 所述乳腺上皮细胞是山羊、绵羊、野牛、骆盤、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼乳腺 上皮细胞。在一些实施方案中，所述乳腺上皮细胞是山羊乳腺上皮细胞。
[0020] 在一个方面，本公开提供乳腺上皮细胞，其产生本文公开的抗体、抗体群体，或组 合物中的任一种。
[0021] 在一个方面，本公开提供转基因非人哺乳动物，其包含本文公开的任意乳腺上皮 细胞。
[0022] 在一个方面，本公开提供方法，其包含将本文公开的抗体、抗体群体，或组合物中 的任一种施用到有此需要的受试者。在一些实施方案中，所述受试者患有癌症。在一些实 施方案中，所述癌症为HER2+癌症。在一些实施方案中，所述HER2+癌症为乳腺癌、卵巢癌、 胃癌或子宫癌。
[0023] 在一个方面，本公开提供单克隆抗HER2抗体组合物，其包含在Fc糖基化位点 (Asn297,EU编号）上具有聚糖结构的单克隆抗HER2抗体，其中所述聚糖结构具有多于 60%的半乳糖含量。
[0024] 附图简述
[0025] 首先描述附图。应当理解附图为示例性的而对于启用本发明不是必需的。
[0026] 图1A和图1B示出了来自山羊#2的高度半乳糖基化的曲妥珠单抗抗体群体的 N-聚糖的代表性寡糖标签（signature)。
[0027] 图2示出了在泌乳的第7天，来自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠单抗抗体群 体的N-聚糖的寡糖标签。
[0028] 图3示出了在泌乳的第15天，来自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠单抗抗体 群体的N-聚糖的寡糖标签。
[0029] 图4示出了在泌乳的第30天，来自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠单抗抗体 群体的N-聚糖的寡糖标签。
[0030] 图5示出了在泌乳的不同天数，来自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠单抗抗体 群体的N-聚糖寡糖的百分比的汇总。
[0031]图6示出了在首次泌乳的第7天，来自山羊#2的高度半乳糖基化的曲妥珠单抗抗 体群体的N-聚糖的寡糖标签。
[0032]图7示出了在首次泌乳的第7天，来自山羊#2的高度半乳糖基化的曲妥珠单抗抗 体群体的N-聚糖寡糖百分比的汇总。
[0033] 图8示出了在首次泌乳的第15、49、84、112天，来自山羊#2的高度半乳糖基化的 曲妥珠单抗抗体群体的N-聚糖寡糖百分比的汇总。
[0034] 图9示出了来自泌乳第7天的山羊#3和泌乳第3/4天的山羊#4的高度半乳糖基 化的曲妥珠单抗群体的N-聚糖寡糖百分比的汇总。
[0035] 图10示出了来自泌乳第3天的山羊#5和泌乳第5、6和7天的山羊#6的高度半 乳糖基化的曲妥珠单抗群体的N-聚糖寡糖百分比的汇总。
[0036] 图11示出了在第二次泌乳的第8、15和29天，来自山羊#2的高度半乳糖基化的 曲妥珠单抗群体的N-聚糖寡糖百分比的汇总。
[0037] 图12示出了商业的Herceptiii? /曲妥珠单抗的N-聚糖寡糖百分比的汇总。
[0038] 图13示出了比较首次泌乳（NL1)或第二次泌乳（NL2)的不同天数时由山羊#2产 生的曲妥珠单抗的唾液酸和甘露糖修饰以及主要形式的汇总。
[0039] 图14示出了山羊#1-6中产生的曲妥珠单抗的唾液酸和甘露糖修饰以及主要形式 的汇总。
[0040] 图15示出了转基因产生的曲妥珠单抗结合已知表达HER2的SK-BR-3细胞。
[0041] 图16示出了与商业的:/曲妥珠单抗相比，转基因产生的曲妥珠单抗 具有相似的对SK-BR-3细胞的结合亲和力。
[0042] 图17示出了转基因产生的曲妥珠单抗与NK细胞上表达的⑶16相互作用。
[0043] 图18示出了与商业的Herceptin?/曲妥珠单抗相比，转基因产生的曲妥珠单抗 具有增强的抗体依赖性细胞性细胞毒性（ADCC)。
[0044] 图19示出了转基因产生的曲妥珠单抗抗体减少了BT-474细胞的增殖。
[0045] 发明详述
[0046] 在一个方面，本公开提供抗HER2抗体，其中所述抗体是高度半乳糖基化的。抗 HER2抗体结合HER2,并且抗HER2抗体已用作以HER2过表达为特征的多种癌症（HER2+癌 症）的治疗剂。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
[0047] 在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗体包括包含SEQIDNO: 1的 重链。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗体包括包含SEQIDN0 :2的轻 链。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗体包括包含SEQIDNO: 1的重链 和包含SEQIDNO:2的轻链。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗体包括 由SEQIDNO: 1组成的重链。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗体包括 由SEQIDN0 :2组成的轻链。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗体包括 由SEQIDN0 :1组成的重链和由SEQIDN0 :2组成的轻链。在一些实施方案中，所述高度 半乳糖基化的抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
[0050] 应当进一步理解在一些实施方案中，本公开也包括基于曲妥珠单抗序列但包括突 变的抗体，所述突变给所述抗体提供与生物利用度、稳定性等相关的额外的有益的所需特 性。
[0051] 在一个方面，本公开提供抗HER2抗体，其中所述抗体是高度半乳糖基化的。在一 些实施方案中，本公开提供抗HER2抗体，其中所述抗体是高度岩藻糖基化的。在一些实施 方案中，本公开提供抗HER2抗体，其中所述抗体是高度半乳糖基化和高度岩藻糖基化的。 在一些实施方案中，本公开提供抗HER2抗体，其中所述抗体是高度半乳糖基化和高度岩藻 糖基化的。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗体包含一个或多个单半乳糖基化 的N聚糖。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗体包含双半乳糖基化的N聚糖。
[0052] 在一个方面，本公开提供单克隆抗HER2抗体组合物，其包含在Fc糖基化位点（Asn 297,EU编号）上具有聚糖结构的单克隆抗体，其中所述聚糖结构具有多于60%的半乳糖 含量。在一个实施方案中，所述抗HER2单克隆抗体是纯化的。当提及免疫球蛋白重链恒 定区中的残基时，通常使用"EU编号系统"或"EU索引"（例如，Kabatetal.，Sequences ofProteinsofImmunologicalInterest, 5thed. ,PublicHealthService,National InstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)中报道的EU索引，通过提述明确并入本文）。 抗体中典型的糖基化残基位置是根据EU编号系统在位置297处的天冬酰胺（〃Asn297〃）。
[0053] 应当理解本文公开的任意抗HER2单克隆抗体可以是部分或完全纯化的。
[0054] 抗体可以在Fc区重链中的Fc-γ糖基化位点（Asn297)使用N-聚糖糖基化。通 常来说，抗体包括两条重链，因此每个抗体可以具有两个Fc-γΝ-聚糖。在Fc-γ糖基 化位点已观察到了多种糖基化模式，而在该位点发现的寡糖包括半乳糖、N-乙酰葡糖胺 (GlcNac)、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神经氨酸（NeuAc或NANA)、N-羟乙酰神经氨酸（NGNA)和 岩藻糖。在Fc-γ糖基化位点发现的N-聚糖通常具有共同的核心结构，其由第一个N-乙 酰葡糖胺（GlcNAc)的不分支的链（其附接到抗体的天冬酰胺），附接到第一个GlcNac的 第二个GlcNAc和附接到第二个GlcNac的第一个甘露糖组成。另外两个甘露糖附接到 GlcNAc-GlcNAc-甘露糖链的第一个甘露糖以完成核心结构并提供两条"臂"用于额外的糖 基化。另外，岩藻糖残基可以附接到N-连接的第一个GlcNAc。
[0055] 双臂核心结构也称为"触角"。在血浆抗体中发现的N-聚糖基序的"臂"的最常见 糖基化类型是复合类型的，例如，由多于一种类型单糖组成。在通向该聚糖基序的生物合成 途径中，几种GlcNAc转移酶将GlcNAc残基附接到聚糖核心的甘露糖，其可以由半乳糖、唾 液酸和岩藻糖残基进一步延伸。这种糖基化基序称为"复合"结构。
[0056] 在N-聚糖核心结构的"臂"上发现的第二种糖基化基序是"高甘露糖"基序，其特 征为另外的甘露糖（作为分支或不分支链附接）。
[0057] 第三种糖基化基序是杂合结构的，其中一条臂是甘露糖取代而另一条臂是复合 的。
[0058] "半乳糖基化的"抗体，用于本文指代在其一个N-聚糖中具有至少一个半乳糖单 糖的任意抗体。半乳糖基化的抗体包括两个N-聚糖在N-聚糖基序的每一条臂上各具有复 合类型基序的抗体，两个N-聚糖在N-聚糖基序的仅一条臂上具有复合类型基序的抗体，具 有一个在N-聚糖的每一条臂上具有一个复合类型基序的N聚糖的抗体，以及具有一个在 N-聚糖基序的仅一条臂上具有复合类型基序的N聚糖的抗体。包括至少一个半乳糖单糖的 抗体包括具有如G1(-个半乳糖），G1F(-个半乳糖，一个岩藻糖），G2(两个半乳糖）和 G2F(两个半乳糖，一个岩藻糖）等N-聚糖的抗体。另外，包括至少一个半乳糖单糖的N-聚 糖可以是唾液酸化的或不是唾液酸化的。应当进一步理解所述N-聚糖还可以在复合聚糖 基序的一条或多条臂中含有另外的半乳糖残基，如α-半乳糖，潜在产生具有四个半乳糖 部分的Ν-聚糖。
[0059] "高度半乳糖基化的"抗体用于本文指代在N-聚糖基序中包括至少两个半乳糖单 糖的抗体。高度半乳糖基化的抗体包括两个N-聚糖的每一个在N-聚糖基序的每一条臂上 具有复合类型基序的抗体，两个N-聚糖在N-聚糖基序的仅一条臂上具有复合类型基序的 抗体，以及具有一个在N-聚糖的每一条臂上具有复合类型基序的N-聚糖的抗体。因此，高 度半乳糖基化的抗体包括其中两个N-聚糖每一个在聚糖基序（例如，G1或GIF)中包括一 个半乳糖的抗体，包括至少一个在聚糖基序（例如，G2或G2F)中具有两个半乳糖的N-聚糖 的抗体，以及在聚糖基序中具有3或4个半乳糖的抗体（例如，⑴一个具有G1聚糖基序 的N-聚糖和一个具有G2或G2F聚糖基序的N-聚糖，或（ii)两个具有G2或G2F的N-聚 糖）。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗体在聚糖基序中包括至少三个半乳糖单 糖。在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗体在聚糖基序中包括至少四个半乳糖单 糖。
[0060]N-聚糖的糖基化模式可以通过本领域已知的多种方法确定。例如，分析蛋白上的 碳水化合物的方法已描述于美国专利申请US2006/0057638和US2006/0127950。分析蛋 白上的碳水化合物的方法通过提述并入本文。
[0061] 在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗体在非人哺乳动物的乳腺细胞中产 生。在一些实施方案中，所述抗体在转基因非人哺乳动物中产生。在一些实施方案中，所述 非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。在一些实 施方案中，所述非人哺乳动物是山羊。
[0062] 在一些实施方案中，所述高度半乳糖基化的抗体在非人哺乳动物的除乳腺上皮细 胞外的细胞中产生。在一些实施方案中，所述抗体在非人哺乳动物的除乳腺上皮细胞外的 细胞中产生，并在产生后经修饰来增加N-聚糖上半乳糖基团的数量（例如通过酶的作用， 如转移酶）。
[0063] 在一个方面，本公开提供组合物，其包含高度半乳糖基化的抗体。在一些实施方案 中，所述包含高度半乳糖基化的抗体的组合物进一步包括乳。在一些实施方案中，所述包含 高度半乳糖基化的抗体的组合物进一步包含药学上可接受的载体。
[0064] 在一个方面，本公开提供包含单克隆抗-HER2抗体组合物，其在Fc糖基化位点 (Asn297,EU编号）上具有聚糖结构，其中所述单克隆抗体的聚糖结构具有多于60%的半 乳糖含量。在一些实施方案中，所述包含单克隆抗-HER2的抗体组合物的组合物进一步包 含乳。在一些实施方案中，所述包含单克隆抗-HER2的抗体组合物的组合物进一步包含药 学上可接受的载体。
[0065] 抗体群体
[0066] 在一个方面，本公开提供包含抗体群体的组合物，其中所述抗体是抗-HER2抗体， 并且其中所述群体中抗体的半乳糖基化水平为至少50%。在一些实施方案中，所述群体中 抗体的半乳糖基化水平为至少60%。在一些实施方案中，所述群体中抗体的半乳糖基化水 平为至少70%。在一些实施方案中，所述群体中抗体的岩藻糖基化水平为至少50%。在一 些实施方案中，所述群体中抗体的岩藻糖基化水平为至少60 %。在一些实施方案中，所述 群体包含包括单半乳糖基化的N-聚糖的抗体。在一些实施方案中，所述群体包含包括双半 乳糖基化的N-聚糖的抗体。在一些实施方案中，所述群体中抗体的半乳糖基化的水平与所 述群体中抗体的岩藻糖基化水平的比率为1. 〇和1. 4之间。在一些实施方案中，群体中至 少25 %的抗体包含双半乳糖基化的N-聚糖，而群体中至少25 %的抗体包含单半乳糖基化 的N-聚糖。
[0067] 在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化