的抗体群体中的抗-HER2抗体是 曲妥珠单抗。在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化的抗体群体中的抗-HER2抗 体包含包括SEQIDNO: 1的重链。在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化的抗体群 体中的抗-HER2抗体包含包括SEQIDN0:2的轻链。在一些实施方案中，所述具有高水平半 乳糖基化的抗体群体中的抗-HER2抗体包含包括SEQIDN0:1的重链和包括SEQIDN0:2 的轻链。在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化的抗体群体中的抗-HER2抗体包 含由SEQIDN0:1组成的重链。在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化的抗体群体 中的抗-HER2抗体包含由SEQIDN0:2组成的轻链。在一些实施方案中，所述具有高水平半 乳糖基化的抗体群体中的抗-HER2抗体包含由SEQIDN0:1组成的重链和由SEQIDN0:2 组成的轻链。在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化的抗体群体中的抗-HER2抗 体是曲妥珠单抗。
[0068]N-聚糖的生物合成不由模板调节（在蛋白质的情况下就是如此），而主要依赖于 细胞中特定糖基转移酶的表达和活性。因此，糖蛋白（如抗体的Fc域）通常以在相同蛋白 骨架上携带不同聚糖的糖型（glycoform)的异质群体存在。
[0069] 高度半乳糖基化的抗-HER2抗体群体是其中群体中的抗体的半乳糖基化水平为 至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、高达100 %的半乳糖基化的抗体群 体。在高度半乳糖基化的抗体群体的一些实施方案中，所述群体中抗体的半乳糖基化水平 为至少60%。
[0070] 本文使用的半乳糖基化水平通过以下公式确定：
[0071]
[0072]其中：
[0073] -η表示色谱图的分析的N-聚糖峰的数量，如正相高效液相色谱（NPHPLC)谱
[0074] -"Gal数量"表示在对应于峰的聚糖的触角上，半乳糖基序的数量，和
[0075] _"A的数量"对应于与峰对应的聚糖形式的触角上，N-乙酰葡糖胺基序的数量（排 除核心结构的两个N-乙酰葡糖胺基序），和
[0076] -" ％相对面积"对应于在对应峰下的面积的％
[0077] 抗体群体中抗体的半乳糖基化水平可以通过例如从所述抗体释放N-聚糖，在色 谱图上分析N-聚糖，鉴定对应特定峰的N-聚糖的单糖基序，确定峰强度并将数据应用于上 文提供的公式来确定（也见本文提供的实验部分）。
[0078] 半乳糖基化的抗-HER2抗体包括单半乳糖基化的N-聚糖和双半乳糖基化的N-聚 糖的抗体。
[0079] 在一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，所述群体包含包括单半乳糖基 化的N-聚糖的抗体，其可以是或者不是唾液酸化的。在一些高度半乳糖基化的抗体群体的 实施方案中，至少1%，至少5%，至少10%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至 少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，高达100 %的抗体N-聚糖包含单半乳 糖基化的N-聚糖。在一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，至少25%的抗体包含 单半乳糖基化的N-聚糖。
[0080] 在一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，所述群体包含包括双半乳糖基 化的N-聚糖的抗体，其可以是或者不是唾液酸化的。在一些高度半乳糖基化的抗体群体的 实施方案中，至少1%，至少5%，至少10%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至 少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，高达100 %的抗体N-聚糖包含双-半 乳糖基化的N-聚糖。在一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，至少25%的抗体包 含双-半乳糖基化的N-聚糖。
[0081] 在一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，所述群体包含包括单半乳糖基 化的N-聚糖的抗体，其可以是或者不是唾液酸化的，和包括双半乳糖基化的N-聚糖的抗 体，其可以是或者不是唾液酸化的。在一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，在一 些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，至少1%，至少5%，至少10%，至少20%，至 少25%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，高达 99 %的抗体N-聚糖包含单-半乳糖基化的N-聚糖，并且至少1 %，至少5 %，至少10 %，至 少20 %，至少25 %，至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少 90 %，高达99 %的抗体N-聚糖包含双-半乳糖基化的N-聚糖。在一些高度半乳糖基化的 抗体群体的实施方案中，至少25%的抗体N-聚糖包含单-半乳糖基化的N-聚糖并且至少 25%的抗体包含双-半乳糖基化的N-聚糖。
[0082] 在一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，所述群体包含高度岩藻糖基化 的抗体。高度岩藻糖基化的抗体群体是其中群体中的抗体N-聚糖的岩藻糖基化水平为至 少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，高达100 %岩藻糖基化的抗体群体。在 一些高度半乳糖基化的抗体群体的实施方案中，所述抗体N-聚糖的岩藻糖基化水平为至 少 50%。
[0083] 本文使用的岩藻糖基化水平通过以下公式确定：
[0084] 岩藻糖数目
[0085]
[0086] 其中：
[0087] -η表示色谱图的分析的N-聚糖峰的数量，如正相高效液相色谱（NPHPLC)图，和
[0088] - "岩藻糖数量"表示在对应于峰的聚糖上的岩藻糖基序的数量，和
[0089] - "％相对面积"对应于在含有岩藻糖基序的对应峰下的面积的％。
[0090] 岩藻糖基化的抗体包括在其Ν-聚糖之一中具有至少一个岩藻糖单糖的抗体。岩 藻糖基化的抗体包括在其每一个Ν-聚糖中具有岩藻糖单糖的抗体。
[0091] 在一些实施方案中，本文公开的抗-HER2抗体的群体指其中群体中的抗体Ν-聚 糖的半乳糖基化水平为至少50%并且所述群体中抗体的岩藻糖基化水平为至少50%的群 体。在一些实施方案中，本文公开的抗体涉及其中群体中的抗体Ν-聚糖的半乳糖基化水平 为至少50 %并且所述群体中抗体N-聚糖的岩藻糖基化水平为至少50%，至少60%，至少 70 %，至少80 %，至少90 %，高达100 %的群体。在一些实施方案中，本文公开的抗体群体涉 及其中群体中的抗体N-聚糖的半乳糖基化水平为至少60 %并且所述群体中抗体N-聚糖的 岩藻糖基化水平为至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，高达100 %的群 体。在一些实施方案中，本文公开的抗体群体涉及其中群体中的抗体N-聚糖的半乳糖基化 水平为至少70%并且所述群体中抗体N-聚糖的岩藻糖基化水平为至少50%，至少60%，至 少70%，至少80%，至少90%，高达100%的群体。在一些实施方案中，本文公开的抗体群 体涉及其中群体中的抗体N-聚糖的半乳糖基化水平为至少80%并且所述群体中抗体N-聚 糖的岩藻糖基化水平为至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，高达100 % 的群体。在一些实施方案中，本文公开的抗体群体涉及其中群体中的抗体N-聚糖的半乳 糖基化水平为至少90%并且所述群体中抗体N-聚糖的岩藻糖基化水平为至少50%，至少 60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，高达100 %的群体。在一些实施方案中，本文公开的 抗体群体涉及其中群体中的抗体N-聚糖的半乳糖基化水平为高达100%并且所述群体中 抗体N-聚糖的岩藻糖基化水平为至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，高 达100%的群体。
[0092] 在一个方面，本公开涉及包含抗-HER2抗体群体的组合物，所述抗-HER2抗体群体 具有所述群体中在Fc-γ-糖基化位点处半乳糖基化的抗体N-聚糖的百分比与所述群体中 在Fc-γ-糖基化位点处岩藻糖基化的抗体Ν-聚糖的百分比的特定比率。在一些实施方案 中，本公开涉及包含抗体群体的组合物，其中所述群体中抗体Ν-聚糖的半乳糖基化的水平 与所述群体中抗体Ν-聚糖的岩藻糖基化的水平的比率在0. 5和2. 5之间，在0. 6和2. 0之 间，在0.7和1.8之间，在0.8和1.6之间，或者在1.0和1.4之间。在一些实施方案中，本 公开涉及包含抗体群体的组合物，其中所述群体中抗体Ν-聚糖的半乳糖基化的水平与所 述群体中抗体Ν-聚糖的岩藻糖基化的水平的比率在1. 0和1. 4之间，例如1. 2。
[0093] 在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化的抗-HER2抗体群体在非人哺乳 动物的乳腺上皮细胞中产生。在一些实施方案中，所述抗-HER2抗体群体在转基因非人哺 乳动物中产生。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、 兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物是山羊。
[0094] 在一些实施方案中，所述具有高水平半乳糖基化的抗HER2抗体群体在非人哺乳 动物的除乳腺上皮细胞外的细胞中产生。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体群体在非人 哺乳动物的除乳腺上皮细胞外的细胞中产生后进行修饰以增加所述抗体群体中半乳糖基 团的数量（例如，通过酶的作用，如转移酶）。
[0095] 在一个方面，本公开提供组合物，其包含具有高半乳糖基化水平的抗HER2抗体群 体。在一些实施方案中，所述包含具有高半乳糖基化水平的抗HER2抗体的组合物进一步包 含乳。在一些实施方案中，所述包含具有高半乳糖基化水平的抗HER2抗体的组合物进一步 包含药学上可接受的载体。
[0096] 抗体群体的产生
[0097] 在一个方面，本公开提供包含具有高半乳糖基化水平（例如，至少60% )的 抗-HER2抗体群体的组合物，其中所述抗体群体在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生， 并且其中所述抗体群体在与不在乳腺上皮细胞中产生的抗体群体相比时具有增加的半乳 糖基化水平。在一些实施方案中，所述不在乳腺上皮细胞中产生的抗体群体在细胞培养物 中产生。如本文所述使用的，当与在乳腺上皮细胞中产生的抗体相比时，"在细胞培养物中 产生的"抗体指代在标准生产细胞系（例如，CHO细胞）但排除乳腺上皮细胞中产生的抗 体。在一些实施方案中，当与在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化 水平相比时，不在乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平为90%或更低，80%或更 低，70 %或更低，60 %或更低，50 %或更低，40 %或更低，30 %或更低，20 %或更低，10 %或更 低。在一些实施方案中，当与在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化 水平相比时，不在乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平为50%或更低。在一些实 施方案中，当与在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平相比时， 不在乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平为30%或更低。在一些实施方案中，当 与在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平相比时，不在乳腺上皮 细胞中产生的抗体的半乳糖基化水平为10%或更低。
[0098] 在一个方面，本公开提供包含具有高岩藻糖基化水平（例如，至少60% )的 抗-HER2抗体群体的组合物，其中所述抗体群体在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生， 并且其中所述抗体群体与不在乳腺上皮细胞中产生的抗体群体相比时具有增加的岩藻糖 基化水平。在一些实施方案中，所述不在乳腺上皮细胞中产生的抗体群体在细胞培养物中 产生。如本文所述使用的，当与在乳腺上皮细胞中产生的抗体相比时，"在细胞培养物中产 生的"抗体指代在标准生产细胞系（例如，CH0细胞）但排除乳腺上皮细胞中产生的抗体。 在一些实施方案中，当与在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的抗体的岩藻糖基化水平 相比时，不在乳腺细胞中产生的抗体的岩藻糖基化水平为90%或更低，80%或更低，70%或 更低，60 %或更低，50 %或更低，40 %或更低，30 %或更低，20 %或更低，10 %或更低。在一 些实施方案中，当与在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的抗体的岩藻糖基化水平相比 时，不在乳腺细胞中产生的抗体的岩藻糖基化水平为50%或更低。在一些实施方案中，当与 在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的抗体的岩藻糖基化水平相比时，不在乳腺细胞中 产生的抗体的岩藻糖基化水平为30%或更低。在一些实施方案中，当与在非人哺乳动物的 乳腺上皮细胞中产生的抗体的岩藻糖基化水平相比时，不在乳腺细胞中产生的抗体的岩藻 糖基化水平为10 %或更低。
[0099] 在一个方面，本公开提供包含具有高半乳糖基化和岩藻糖基化水平的抗HER2抗 体群体的组合物，其中所述抗体群体在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生，并且其中所 述抗体与不在乳腺上皮细胞中产生的抗体群体相比具有增加的半乳糖基化和岩藻糖基化 水平。
[0100]抗体
[0101] 在一些实施方案中，术语"抗体"可以指包含至少两条重（H)链和两条轻（L)链的 糖蛋白。每条重链由重链可变区（本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒 定区由三个域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链是由轻链可变区（本文缩写为LCVR或VL) 和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为超变性 区，称为互补决定区（CDR)，其散布有更保守的区域，称为框架区（FR)。每个VH和VL由三 个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3， CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。在一些实施方案中，抗原 是HER2。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合到宿主组织或因子，包括免疫系统的各种 细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分（Clq)。当两种蛋白以化学计算量表达 并以适当的构造自身组装时，可以完成成熟的功能性抗体分子的形成。
[0102] 术语"抗体"也意图涵盖其抗原结合片段。用于生成抗体和抗原结合片 段的方法在本领域中是公知的（见，例如Sambrooketal,"MolecularCloning:A LaboratoryManual"（2ndEd.),ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)； Lewin，"GenesIV"，OxfordUniversityPress,NewYork, (1990)和Roittet al.，"Immunology"（2ndEd.),GowerMedicalPublishing,London,NewYork(1989)， W02006/040153,W02006/122786,和W02003/002609)。如本文所使用的，抗体的"抗原结 合片段"指代抗体中保留了特异性结合抗原（例如HER2)的能力的一个或多个部分。已 显示了抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。包括在术语抗体的"抗原 结合片段"内的结合片段的例子包括（i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价 片段；（ii)F(ab'）2片段，即包括通过铰链区的二硫化物桥相连的两个Fab片段的二价片 段；（iii)由VH和CH1±或组成的Fd片段；（iv)由抗体的单臂的VL和VH±或组成的Fv片 段，（v)由VH域组成的dAb片段（Wardetal·，（1989)Nature341:544_546);和（vi)分 离的互补决定区（CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由分开的基因编码，但是它 们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使它们能够作为单个蛋白链生成， 其中VL和VH区配对来形成单价分子（称为单链Fv(scFv)，见例如，Birdetal. (1988) Science242:423-426 ;及Hustonetal. (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)〇 这种单链抗体也意图包含在术语抗体的"抗原结合部分"中。这些抗体片段使用常规方法 (如蛋白水解片段化（proteolyticfragmentation)方法，如描述于J.Goding,Monoclonal Antibodies:PrinciplesandPractice，pp98_118(N.Y.AcademicPress1983)(其通过提 述并入本文））以及通过本领域技术人员已知的其它技术获得。以与完整抗体相同的方式 对片段筛选效果。
[0103] 在一些实施方案中，抗体属于同种型IgG、IgA或IgD。在进一步的实施方案中，抗 体选自下组：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD、IgE或具有IgGl，IgG2， IgG3,IgG4,IgM,IgAl,IgA2,IgAsec,IgD或者IgE的免疫球蛋白恒定和/或可变域。在其它 实施方案中，抗体是双特异性或多特异性抗体。根据一个可选的实施方案，本公开的抗体可 以经修饰以成为双特异性抗体，或多特异性抗体的形式。术语"双特异性抗体"意图包括具 有两个不同结合特异性的任何药剂（例如蛋白、肽、或蛋白或肽复合物），其与（a)细胞表面 抗原和（b)效应细胞表面上的Fc受体结合或相互作用。术语"多特异性抗体"意图包括具 有多于两个不同结合特异性的任何药剂（例如蛋白、肽，或蛋白或肽复合物），其与（a)细胞 表面抗原、（b)效应细胞表面上的Fc受体，和（c)至少一个其它组分结合或相互作用。相应 的，本公开包括但不限于针对细胞表面抗原以及效应细胞上的Fc受体的双特异性、三特异 性、四特异性，以及其它多特异性抗体。术语"双特异性抗体"进一步包括双抗体（diabody)。 双抗体是二价的，双特异性的抗体，其中VH和VL域表达在一条多肽链上，但使用接头，该接 头太短从而不允许同一条链上的两个域间的配对，因此迫使各域与另一条链上的互补域配 对并创造两个抗原结合位点（见例如，Holliger，P.，etal. (1993)Proc.Natl.Acad.Sci. USA90:6444-6448 ;Poijak，R.J.，etal· (1994)Structure2:1121-1123)。
[0104] 术语"抗体"也包含不同类型的抗体，例如重组抗体，单克隆抗体，人源化抗体或嵌 合抗体，或这些的混合物。
[0105] 在一些实施方案中，抗体是重组抗体。如本文中使用的，术语"重组抗体"意图包 括通过重组手段制备、表达、创造或分离的抗体，如从在另一物种的免疫球蛋白基因方面转 基因的动物分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的组 合抗体库分离的抗体，或通过任意涉及免疫球蛋白基因序列剪接为其它DNA序列的其它手 段制备、表达、创造或分离的抗体。
[0106] 在其它实施方案中，抗体可以是嵌合或人源化的抗体。如本文所使用的，术语"嵌 合抗体"指代将非人类（例如小鼠、大鼠、兔）抗体的部分与人抗体的部分组合的抗体。如本 文所使用的，术语"人源化抗体"指仅保留与人框架区结合的来自亲本抗体的抗原结合CDR 的抗体（见，Waldmann, 1991，Science252:1657)。此类保留了鼠抗体的结合特异性的嵌合 或人源化抗体在为了根据本公开的诊断、预防或治疗应用而体内施用时预期具有减少的免 疫原性。
[0107] 在某些实施方案中，抗体是人抗体。如本文中使用的，术语"人抗体"意图包括具有 衍生于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包括不由人 种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体 内体细胞突变引入的突变）。使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分的转基因小鼠产 生人抗体。还可以通过免疫在大部分人免疫球蛋白重链和轻链基因座方面转基因的小鼠来 制备完全人单克隆抗体。见例如美国专利5, 591，669, 5, 598, 369, 5, 545, 806, 5, 545, 807, 6， 150, 584,以及其中引用的参考文献，其内容通过提述并入本文。这些动物已经经过遗传修 饰，使得在内源性（如鼠）抗体的产生中存在功能缺失。这些动物经进一步修饰以含有人 种系免疫球蛋白基因座的全部或部分，使得免疫这些细胞导致针