专利名称：识别cd3或4－1bb的抗体或基因介导的肿瘤反应性淋巴细胞活化的制作方法
技术领域：
本发明涉及产生肿瘤反应性T淋巴细胞的方法，肿瘤疫苗及其相关组合物，制备这类疫苗及其相关组合物的方法，以及使用这些疫苗及其相关组合物的方法，例如体内治疗应用。
背景技术：
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人体肿瘤会表达多种肿瘤抗原，其中大多数抗原也存在于一些正常的组织中，尽管其表达水平很低(Hellstrom and Hellstrom，AdvCancer Res，12，167-223，1969；Cheever et al.，Immunol Rev，145，33-59，1995；Finn et al.，Immunol Rev，145，61-89，1995；Boon et al.，ImmunolToday，18，267-8，1997；Hellstrom and Hellstrom，Handbook ofExperimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。许多这些抗原在患肿瘤患者体内是具有免疫原性的。例如，SEREX技术可以检测多种肿瘤相关抗原的IgG抗体(Old and Chen，J.Exp.Med.，187，1163-1167，1998)，通过使用四聚物法能证实T细胞识别肿瘤抗原(Cassian et al.，J.Immunol.，162，1999)，通过在体外产生肿瘤选择性T细胞克隆同样可以证实这种识别(Boon，Coulie et al.，Immunol Today，18，267-8，1997)。这便为患者提供了进行多种免疫治疗的机会，包括给患者使用在体外扩增的免疫T淋巴细胞(Rosenberg，Biologic Therapy of Cancer(Chapter 19)，487，1995)和治疗性的肿瘤疫苗(Nestle et al.，Nat Med，4，328-32，1998；Rosenberget al.，Nat Med，4，321-7，1998；Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Melief and Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Pardoll，Curr Opin Immunol，8，619-21，1996；Hellstrom and Hellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。
小鼠肿瘤为开发更加有效的免疫治疗提供了实用的疾病模型。它们会表达肿瘤破坏性免疫应答的反应对象，尽管这需要通过特定的实验操作来获得能够抵抗多数自发肿瘤的有效免疫应答。(Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Ken-and Mule，J.Leuko.Biol.，56，210-214，1994；Cheever，Disis et al.，Immunol Rev，145，33-59，1995；Finn，Jerome et al.，Immunol Rev，145，61-89，1995；Meliefand Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Pardoll，Cun-Opin Immunol，8，619-21，1.996；Boon，Coulie et al.，Immunol Today，18，267-8，1997；Hellstrom and Hellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。
T淋巴细胞(CD8+和CD4+)在肿瘤破坏性的免疫应答产生(通常也在完成)过程中发挥着关键的作用，自然杀伤细胞和抗体，巨噬细胞也同样参与了这个过程(Hellstrom and Hellstrom，Adv CancerRes，12，167-223，1969；Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Meliefand Kast.Immunol Rev，145，167-77，1995；Hellstrom andHellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。由骨髓中的造血干细胞和血液中的单核细胞分化而来的树状突细胞(DC)的抗原递呈是正常的(Huangct al..Science，264，961-5，1994)，在特定的情况下，这种抗原递呈也可以由肿瘤细胞自身来完成(Chen et al..Cell，71，1093-102，1992；Schoenberger et al..Cancer Res，58，3094-100，1998)。促进树状突细胞(DC)表达肿瘤抗原的操作步骤对获得有效的肿瘤免疫至关重要，最近的数据表明，这种免疫使得对特定的人类肿瘤进行更有效的治疗成为了可能(参见，例如，(Kugler et al..Nature Medicine，6，332-，2000))。有着体外细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的CD8+T淋巴细胞，与生成淋巴因子的辅助性T细胞的结合，对多数肿瘤的清除都是必要的(Hellstrom and Hellstrom，Handbook of ExperimentalPharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。尽管Th1和Th2应答都是有利的(Rodolfo et al.，T Immunol，163，1923-8，1999)，但是Th1应答在肿瘤的免疫清除方面仍旧扮演着主要的角色(Hu etal.，J Immunol，161，3033-41，1998)。
要诱导免疫应答，就要进行共刺激，特别是通过抗原递呈细胞(APC)上的CD80和/或CD86，和T淋巴细胞上的CD28之间的相互作用，是这种诱导过程所必需的(Schwartz，Cell，57，1073-81，1989；June et al.，Immunol Today，11.211-6，1990；Linsley and Ledbetter，Annu Rev Immunol，11，191-212，1993)。这导致白介素-2，干扰素-γ和其他促进免疫应答的淋巴因子持续生成(Thompson et al.，Proc NatiAcad Sci USA，86，1333-7，1989)，用编码淋巴因子的基因转染肿瘤细胞可以达到上述相同的目的(Pardoll，Curr Opin Immunol，8，619-21，1996)。没有通过CD28产生的二级信号，即便T细胞受体(TCR)与抗原相接触，也不会诱发免疫应答，甚至会导致无反应。多数肿瘤不表达CD80或CD86(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992；Yang et al.，J Immunol，154，2794-800，1995)，在抗原达到肿瘤转移的淋巴结，并被表达CD80和CD86的树状突细胞(DC)识别、加工并递呈之前，不会诱发有效的免疫应答(Huang，Golumbek et al..Science，264，961-5，1994；Yang et al.，J Immunol，158，851-8，1997)。这便可以解释为什么肿瘤在长成团块之前通常在“在不被察觉的情况下通过”免疫系统的监控。CD80和CD86不仅能与CD28结合，其与被激活的T细胞上的CTLA4之间的亲和力更高。后面的这种结合会诱发一种能中止免疫应答的负性信号(Thompson，Lindsten et al.，ProcNati Acad Sci USA，86，1333-7，1989；Walunas et al.，Immunity，1，405-13，1994；Krummel and Allison，J Exp Med，183，2533-40，1996；Leach et al..Science，271，1734-6，1996；Walunas et al.，J Exp Med，183，2541-50，1996；Allison et al.，Novartis Found Symp，215，92-8，1998)，这说明其与CD28的结合是有治疗意义的，与CTLA4的结合则没有。
尽管免疫系统有诱导抗肿瘤免疫性的潜能，但它对消除已经形成的肿瘤还是相对无效的。通过常规肿瘤疫苗，或通过在体外转化的、具有抗肿瘤活性的免疫T细胞诱导的免疫应答，很难破坏数百万个肿瘤细胞。已证实这种现象与一些逃避机制有关，这些逃避机制可以保护肿瘤细胞免受免疫系统的攻击(Hellstrom and Hellstrom，Handbookof Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999；Kiessling et al..Cancer Immunol.Immunother.，48，353-362，1999)。这些机制包括肿瘤抗原决定簇(Maeurer et al.，J Clin Invest，98，1633-41，1996)和/或可将这些抗原递呈给肿瘤杀伤性T淋巴细胞(CTL)的I类主要组织相容性抗原(MHC)分子(Restifo，1993；Maeurer，1996；Hellstrom，1997；Garrido，1997；Johnsen，1998)的丢失，和通过细胞凋亡实现的肿瘤反应性淋巴细胞的消除(Hahne et al.，Science，274，1363-1366，1996；Shirald et al.，Proc Nati Acad Sci USA，94，6420-5，1997；Bennett et al.，J Immunol，160，5669-75，1998；Kume etal.，Int J Cancer，84.339-43，1999)(Chappell and Restifo，CancerImmunol Immunother，47，65-71，1998)。然而，能够表达免疫原性肿瘤抗原，且未诱导反应性淋巴细胞发生凋亡的肿瘤，通常会从免疫监控下逃脱。这归功于各种由肿瘤和/或宿主细胞产生的“阻断因子”，直接地，或者通过有、或没有抗原决定簇选择的抗原递呈细胞(APC)，间接地作用于T细胞发挥作用。这些阻断因子包括可溶性的肿瘤抗原和免疫复合物，以及转化生长因子-β(TGF-β)，前列腺素，一氧化氮(NO)等等(Hellstrom and Hellstrom，Adv Immunol，18，209-77，1974；Kehrl et al..J Exp Med，163，1037-50，1986；Sulitzeanu，AdvCancer Res，60，247-267，1993；Kiessling et al..Springer Semin.Immunopathol.，18，227-242，1996；Kiessling，Wasserman et al..CancerImmunol.Immunother.，48，353-362，1999)。在从发生能破坏肿瘤的Th1反应(Hu.Urba et al.，J Immunol，161，3033-41，1998)向发生Th2反应(Fiorentino et al.，J Exp Med，170，2081-95，1989)转变的过程中，由肿瘤细胞释放的抗原单独或与抗体形成免疫复合物所导致免疫应答的下调，并可能会伴随产生TGF-β，继而产生例如IL-10这样的Th2淋巴因子(Wilbanks et al.，Eur J Immunol，22，165-73，1992；D′Orazioand Niederkom，J Immunol，160，2089-98，1998)。被激活的T淋巴细胞上的CTLA4与APC上的CD80/CD86或被激活的T细胞之间的相互作用也会导致这种下调(Leach，Krummel et al.，Science.271，1734-6，1996；Allison，Chambers et al.，Novartis Found Symp，215，92-8，1998)，TGF-β也可以介导这种下调(Chen et al.，J Exp Med，188，1849-57，1998)。已证实巨噬细胞在下调过程中所扮演的角色是生成一氧化氮(NO)和前列腺素(Kiessling，Wasserman et al..CancerImmunol.Immunother.，48，353-362，1999)。
许多报告中指出，在肿瘤浸润的T淋巴细胞中，T细胞信号传导机制通常会发生缺陷，这反应了T细胞反应性被抑制(Mizoguchi etal.，Science，258，1795-8，1992；Nakagomi et al..Cancer Res，53，5610-5612，1993；Kiessling，Wasserman et al..Cancer Immunol.Immunothcr.，48，353-362，1999)，把淋巴细胞从体内取出后这种抑制可以恢复。
这里列举了一些很大的肿瘤被免疫系统排斥时情况的图解，例如，关于使用T细胞活化分子4-1BB治疗小鼠肿瘤的报告(Melero etal.，Nat Med，3，682-5，1997；Melero et al.，Eur J Immunol，28，1116-21，1998)。但是，更惊人的实例可能来自对肾移植早期的观测，在一些接受肾移植患者体内，由取自尸体肾脏的肿瘤细胞发展而来的大转移灶在去除免疫抑制之后完全痊愈了(Wilson et al.，N Engi J Med，278，479-83，1968；Matter et al.Transplantation，9，71-4，1970)。
细胞表面分子4-1BB，在活化的、而不是在天然的T细胞上表达(DeBenedette et al.，J Exp Med，181，985-92，1995；Shuford et al.，J ExpMed，186，47-55，1997)。4-1BB的参予可以放大已经被诱导的免疫应答。有报道说4-1BB与抗4-1BB的单克隆抗体相接触后可以刺激被抗原激活的、有肿瘤特异性杀伤活性的CD8+T淋巴细胞增殖，刺激干扰素-γ(IFN-γ)和其他Th1型的细胞因子(白介素-2(IL-2)，肿瘤坏死因子(TNF-α))的生成/释放，并刺激对抗细胞凋亡的T细胞的保护(Hurtadoet al.，J Immunol，158，2600-9，1997；Kirn et al.，Eur JImmunol，28，881-90，1998；Natoli et al.，Biochem Pharmacol，56，915-20，1998；Takahashi et al.，J Immunol，162，5037-40，1999；Tsushima et al.，Exp Hematol，27，433-40，1999)。另外，4-1BB有免疫调节效应，包括对NK 1.1细胞的调节(Melero et al..Cell Immunol，190，67-72，1998)。
也有报道指出，4-1BB的单克隆抗体有对抗小鼠体内，包括低免疫原性的肿瘤在内的已经长成的肿瘤(直径大约10毫米)的活性，用抗4-1BB单克隆抗体治疗的小鼠的淋巴细胞已经生成了溶细胞活性增高的CD8+肿瘤特异性杀伤T细胞(Melero，Shuford et al.，NatMed，3，682-5，1997)。淋巴细胞与被转染整合4-1BB配体(4-1BBL)的肿瘤细胞相接触，该配体与4-1BB相结合，也可以显著放大CD8+T淋巴细胞的应答，将4-1BBL转染的肿瘤细胞当作疫苗用于小鼠模型时是有治疗活性的。然而，用抗4-1BB的单克隆抗体进行治疗的疗效明显优于用表达4-1BBL的肿瘤细胞做疫苗治疗的效果。抗体治疗对于治疗非免疫原性的肉瘤Ag104是非常有效的(Melero，Shuford etal.，Nat Med，3，682-5，1997)，将Ag104细胞转染并表达4-1BBL，再与表达CD80的细胞结合，便可获得对抗这种肿瘤的疗效(Melero，1998)。
有一种可选择的增加肿瘤免疫性的方法，就是给患者使用一次抗-CD3单克隆抗体，这样可以使多克隆T细胞活化，包括激活任何肿瘤反应性T淋巴细胞，已报道在一些用小鼠模型进行的研究中，有一些采用这种方法治疗的成功经验(Ellenhom et al.，Science，242，569-71，1988)。
肿瘤反应性T淋巴细胞可以在体外生成后用于体内，通过淋巴细胞实现的肿瘤免疫性的转移，预防来自各个肿瘤新生物的移植细胞过度生长(Klein et al.，Cancer Res，20，1561-1572，1960)。以前曾有有关在免疫淋巴细胞过继转移之后排斥小的、已形成肿瘤的报道(Hellstrom et al.，Transplant Proc，1，90-4，1969)。过继转移的淋巴细胞会优先定位在肿瘤周围(Mule*et al.，J.Immunol.，123，600-606，1979)，将已被赋予免疫性的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)用于治疗这项发明已扩大了其体外应用范围(Rosenberg，Biologic Therapy ofCancer(Chapter 19)，487，1995)。尽管已经在少数患者身上看到了激动人心的临床反应，但在治疗小鼠体内的直径超过几毫米的肿瘤，以及对人进行治疗时，成功的程度通常不够理想(Greenberg，AdvImmunol，49，281-355，1991；Chen，Ashe et al..Cell.71，1093-102，1992；Meliefand Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Hellstrom andHellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。这种失败是由于先前讨论的“逃逸”机制和/或浸入肿瘤实体的淋巴细胞错误定位导致的。
因此需要对包括构建能够诱导更强免疫应答的肿瘤疫苗和生成用于治疗肿瘤患者的T淋巴细胞在内的方法进行。
发明概要本发明涉及体外生产肿瘤反应性T淋巴细胞的方法，在体内治疗性应用的肿瘤疫苗以及相关的组合物。
一种方法是将取自外周血或肿瘤的单核淋巴细胞，例如取自肿瘤患者的单核淋巴细胞，在特异性CD3和CD28固相化抗体存在下与自体肿瘤细胞共同培养。经过一个4-5天的周期便可完成这样的培养。可将细胞扩增至能够用于治疗的水平，例如在去除附着有固相化抗体的磁珠之后在10μl/ml的白介素-2中。这些方法对促进用于治疗肿瘤的肿瘤反应性淋巴细胞的生产是很有用的。在没有被任何特别的理论或机制束缚的情况下，可以将该发明的操作理解为下述过程表达低水平CD3的T淋巴细胞被多克隆激活，增生旺盛，产生Th1型淋巴因子，并迅速破坏肿瘤细胞，释放肿瘤抗原。还可以认为，多克隆T淋巴细胞的激活使培养基中的单核细胞成熟为树突状细胞，它会吞噬死亡的肿瘤细胞，加工并提呈肿瘤抗原，诱导肿瘤特异性T细胞，包括CTL的持续扩增。
本发明还提供，例如，编码在肿瘤细胞表面表达的抗CD3或抗4-1BB单链Fv(scFv)分子的基因以及用这些基因转染的细胞，用于体内癌症的治疗。在没有被任何特别的理论或机制束缚的情况下，可以认为在肿瘤细胞表面表达的抗-CD3 scFv诱导多克隆T淋巴细胞激活，并破坏了肿瘤细胞，释放肿瘤抗原，促进抗原特异性的肿瘤免疫的转换，即我们可检测到相同肿瘤对“野生型”(非转染)细胞的排斥。也可以认为在肿瘤细胞表面的表达的抗4-1BB scFv分子通过不断使肿瘤反应性T淋巴细胞扩增和/或通过保护它们不发生凋亡，从而生成肿瘤反应性淋巴因子，例如干扰素-γ，诱导肿瘤反应性T淋巴细胞的激活/扩增。在用被转染的、能够在细胞表面表达抗4-1BB scFv分子的肿瘤细胞免疫之后，在没有任何特别的理论或机制束缚下，可以认为来自同一肿瘤的野生型细胞可以通过包括自然杀伤细胞和CD4+细胞激活在内的机制被排斥。在细胞表面表达抗4-1BB scFv分子的肿瘤细胞在治疗已经长成的野生型肿瘤时是有活性的。
本发明使两种新的治疗肿瘤的方法成为可能。首先，其可以通过例如附着有抗-CD3/抗-CD28/抗-CD40(或抗-CD3/CD28)固相化抗体的磁珠，使“被抑制的”淋巴细胞激活，并使它们增生，生成Th1淋巴因子，同时变得对TGF-β抑制更不敏感。在没有任何特别的理论或机制束缚下，可以认为活化的淋巴细胞会破坏肿瘤细胞，从而提供肿瘤抗原，并诱导抗原递呈细胞的成熟。可以认为这种方法会使肿瘤反应性CD8+和CD4+T淋巴细胞和自然杀伤细胞在一定时间内扩增，这便更好地适应了将它们过继转移给肿瘤患者的需要。其次，这种方法可以提供基因或多核苷酸，其编码例如，肿瘤表面的抗-CD3或抗4-1BBscFv，这些分子能有效诱导对抗来自同一肿瘤的野生型细胞的肿瘤破坏性免疫应答。
这项发明的其他方面在下列权利要求中进行了阐述，此处完整引用作为参考。
附图简述尽管这项发明的应用范围广泛，并不局限于这里所描述或提到的实施例，参照附图可以对发明的一些方面有更多的了解。
图1.取自晚期卵巢癌(OV44)患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的体外增殖。A显示了用对照磁珠加自体肿瘤细胞刺激淋巴细胞的扩增。B显示了用抗-CD3/CD28/CD40偶联磁珠加自体肿瘤细胞共同刺激后淋巴细胞的扩增。C显示了用不加肿瘤细胞的抗-CD3/CD28/CD40磁珠刺激后淋巴细胞的扩增。
图2.自体的，而非同种异体的肿瘤细胞和由CD3与CD28组合刺激的磁珠结合诱导取自结肠癌患者的外周血单核细胞增殖。这张图显示了在存在有自体(1C)或同种异体(4007)的卵巢癌细胞的情况下，体外刺激五天后，取自肿瘤患者外周血淋巴细胞的扩增。所用的刺激物为A＝对照磁珠；B＝抗-CD28/CD40偶联磁珠；C＝抗-CD3/CD28偶联磁珠；D＝抗-CD3/CD28/CD40偶联磁珠；E＝抗-CD3/CD40偶联磁珠。
图3.取自患有结肠癌患者的外周血单核细胞在磁珠存在的情况下，在4小时51Cr释放分析中显示其可裂解自体的肿瘤细胞，所述磁珠刺激CD3与CD28，或CD3与CD28和CD40的组合，。这张图显示了取自患者1C的外周血淋巴细胞表现出的细胞介导的细胞毒性，在外周血淋巴细胞被自体的肿瘤细胞加抗-CD3/CD28磁珠(A)或被自体的肿瘤细胞加抗-CD3/CD28/CD40磁珠(B)激活之后，在被标记的靶细胞上进行检测。
图4.取自患有头颈部肿瘤患者的外周血单核细胞，在与自体肿瘤细胞和能刺激CD3与CD28的磁珠共同培养后会产生干扰素-γ。这张图显示了取自晚期头颈部肿瘤患者的外周血淋巴细胞生成干扰素-γ。培养上清液中干扰素-γ的水平是如所示通过单独使用抗-CD3/CD28(A)，抗-CD3/CD28磁珠加自体肿瘤细胞(B)，或对照磁珠加自体肿瘤细胞(C)刺激后，在不同时间测定得出的。
图5.CD83是在用磁珠刺激的CD3与CD28刺激之后，在取自结肠癌患者的外周血单核细胞上表达的。这张图显示了取自晚期肿瘤(38C)患者外周血单核细胞上CD83的表达。将细胞用抗-CD83抗体在刺激之前(0天)直接与藻红蛋白(PE)偶联，或在刺激之后1天用抗-CD3/CD28磁珠偶联。
图6.通过CD3与CD28共同刺激取自结肠癌患者的外周血单核细胞两天后所表达的CD83水平，比用CD3与CD28再加CD40共同刺激后CD83的表达水平高。这张图显示了取自晚期肿瘤(38C)患者的外周血单核细胞，这些细胞没有被激活，或用抗-CD3/CD28/CD40磁珠刺激两天，或如所示用抗-CD3/CD28磁珠刺激两天。将细胞同时用与抗-CD3偶联的荧光染料和与抗-CD83偶联的藻红蛋白染色。
图7.经转染能够在细胞表面表达抗-CD3scFv(500A2)的K1735黑色素瘤细胞与表达小鼠CD80的K1735细胞及野生型K1735细胞相比有所消退。
图8.移植到同源小鼠的K-1735野生型细胞的消退，所述小鼠反复免疫以抵抗K1735-500A2细胞。用K1735M2/500A2(2×106/只小鼠)细胞对C3H/HeN小鼠进行三次免疫，每次免疫间隔七天，再给小鼠以1×106/只小鼠(蓝线)的浓度接种K1735M2/500A2野生型细胞。用PBS对C3H/HeN小鼠进行免疫，然后用相同剂量的K1735M2给小鼠接种(红线)。
图9.抗-人CD3scFv基因序列，即抗-人CD3scFv-hIgGl-CD80TM合成多核苷酸的序列，能编码一种在细胞表面表达的产物，能够用于转染。
图10.在逆转录病毒基因转导之后，抗-人CD3 scFv在两种人体细胞系的细胞表面表达。抗-人CD3 scFv(G19-4)在Reh和T51细胞系的细胞表面通过逆转录病毒基因转导得到表达。在细胞表面表达的G19-4 scFv基因产物可以用相应的荧光抗-人IgG进行检测，后者可检测基因产物IgG中的CH2和CH3结构域。在每一个图面中，与野生型细胞发生的反应用虚线表示，与转染细胞发生的反应用实线表示。
图11.与在细胞表面表达抗-CD3 scFv的人细胞系共同培养的人T淋巴细胞的扩增。这张图显示了与在表面表达抗CD3 scFv的Reh或T51细胞(而非野生型Reh或T51细胞)培养后所诱导的T细胞增殖。在一个持续三天的培养周期的最后八小时向培养的细胞中加入3H-胸腺嘧啶可以对扩增进行测定。
图12.静止的人外周血单核细胞裂解来自两个在细胞表面表达抗CD3 scFv人细胞系的细胞。这张图显示了静止的外周血单核细胞可快速杀死在肿瘤细胞表面表达抗-人CD3 scFv的Reh和T51细胞，但不会杀死野生型的Reh或T51细胞。51Cr-标记的细胞系与外周血单核细胞按照所示比率孵育8小时(一式三份)，然后测定被释放的51Cr。可用经典的公式计算特异性杀伤的百分比(实验释放量减去自发释放量，再除以最大释放量减去自发释放量)。
图13.当K1735M2/500A2细胞与野生型K-1735细胞的比例为1∶10时，在细胞表面表达抗-人CD3 scFv的K1735-500A2细胞会抑制与之混合在一起的野生型K-1735细胞形成肿瘤，这证实了“旁观者效应”。这张图显示了在有免疫活性的自体(C3H)小鼠体内，K1735M2/500A2细胞与野生型K-1735细胞的混合物(比例为1∶10)的生长晕被抑制。单独免疫野生型K1735细胞，或将野生型K-1735细胞与转染的K1735M2/500A2细胞以10∶1的比例相混合使未转染的细胞被转染。将2×106个野生型K1735细胞与2×106个K1735M2/500A2细胞相混合，再将混合后的细胞用于皮下免疫C3H小鼠。每隔5天对肿瘤的生长情况进行检测。
图14.取自用K1735-500A2细胞免疫的小鼠的脾细胞在与经照射的野生型K1735细胞结合后会扩增，但在与Ag104细胞结合时则不会。
图15.被移植入自体小鼠体内的K1735-1D8细胞会被排斥，这是因为CD4+细胞和自然杀伤细胞共同产生的排斥机制所致。这张图显示了被移植入C3H小鼠的K1735-1D8细胞被CD4+细胞和自然杀伤细胞所产生的作用机制排斥。a)含有抗-小鼠4-1BB杂交瘤1D8 scFvDNA的病毒载体结构；b)用与藻红蛋白偶联的F(ab′)2山羊抗人的免疫球蛋白可检测出1D8 scFv的表达，这种免疫球蛋白可以识别在K1735-1D8细胞上(阴影区域)表达的免疫球蛋白尾部，但不能识别野生型K1735细胞上的免疫球蛋白(实线)；c)K1735-1D8(○)细胞和野生型K1735细胞(■)细胞在天然小鼠体内的成长动力学；d)小鼠体内的K1735-1D8细胞被CD4+(■)，CD8+(□)，CD4+和CD8+(○)或自然杀伤细胞(△)耗尽的生长动力学，在这个实验中，给对照组(●)的小鼠注射的是纯化后的小鼠IgG。
图16.用K1735-1D8细胞，而不用经放射线照射的野生型K1735细胞进行免疫，可以对抗被移植的野生型K1735细胞的生长，相信这是由于免疫的记忆和特异性的机制造成的。a)通过用K1735-1D8(○)或经放射线照射的野生型K1735细胞(□)进行皮下移植的方法，或用磷酸盐缓冲液(PBS)(■)每隔十天对小鼠(10只/组)皮下免疫两次。在最后一次免疫十天之后给这些小鼠注射野生型K1735细胞，并在两个月之后给具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠再次用野生型细胞进行第二次免疫(▲)；b)将Ag104细胞以3×105/只小鼠的浓度移植给已经具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠(■)，并注射两次野生型K1735细胞，给对照组小鼠注射磷酸盐缓冲液(PBS)(○)；c)给已经具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠注射野生型K1735细胞后，其背部皮肤会脱色。
图17.可以将K1735-1D8细胞作为疫苗进行皮下移植，对已经在皮下或肺里生长形成的野生型K1735肿瘤进行治疗。这张图显示了用K1735-1D8作为免疫源对已经形成的野生型K1735肿瘤进行治疗。a)用皮下注射法，给野生型K1735肿瘤面积达到30平方毫米的小鼠，在移植的前六天，在肿瘤的对侧面接种K1735-1D8(○)或经放射线照射的野生型K1735细胞进行免疫(□)；皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS)(■)的小鼠被视为对照组小鼠。在给定的(↓)时间点也要做相同的治疗；b)在给未经治疗的小鼠移植野生型K1735细胞20天之后(左图)，或在接受野生型K1735细胞之后第8天时首次接受K1735-1D8免疫时(中图)，在接受野生型K1735细胞之后第8天时首次注射1D8单克隆抗体时(右图)要对收集到的肿瘤进行免疫组化分析。每张照片的上、下两个区域分别代表了同一肿瘤结节中的CD4+和CD8+细胞；c)接受静脉注射野生型K1735细胞小鼠的肿瘤肺转移灶。上图显示了对照组小鼠的肺脏，下图显示了反复移植K1735-1D8细胞进行免疫的小鼠的肺脏。
图18.来自经K1735-1D8免疫小鼠的脾细胞在与野生型K1735细胞结合时会扩增，但与抗原性不同的Ag104细胞结合时则不会扩增。这张图显示了经K1735-1D8免疫小鼠脾细胞的扩增。a)用取自两次分别用K1735-1D8或经放射线照射的野生型K1735细胞免疫小鼠的脾细胞，与经放射线照射的野生型K1735(“K1735”)或Ag104(“Ag104”)共同培养三天；将取自天然小鼠的脾细胞作为对照。对氚标记脾细胞的扩增进行测定；b)对已经用CFDA SE标记的CD4+和CD8+的脾细胞进行流式细胞计数分析。
图19.取自用K1735-1D8免疫小鼠的脾细胞能分泌干扰素-γ，并具有细胞毒性淋巴细胞的活性。这张图显示了干扰素-γ的分泌和细胞毒性活性。a)在用K1735-1D8细胞两次免疫天然小鼠后第10天，直接对取自天然小鼠的脾细胞进行干扰素-γ的ELISPOT分析。将最后一次免疫后10天时收集到的脾细胞加入到干扰素-γELISPOT培养皿中，孵育24小时；将来自天然小鼠的脾细胞和来自携带有野生型K1735肿瘤小鼠脾细胞的检测结果进行比较；b)在用野生型K1735细胞进行免疫之后的30天时，将在实验中在体外受到刺激的(■)和未受刺激的(□)脾细胞分泌干扰素-γ的情况归纳于表1中。下列每组(三只用同样方法处理的)小鼠平均的斑点数目(从上至下)都显示出来用K1735-1D8细胞处理1天前，或用野生型细胞处理4或8天后；用1D8的单克隆抗体处理1天前，或用野生型细胞处理4或8天后。下面两行给出了取自天然小鼠的对照组脾细胞的ELISPOT数据；c)取自用K1735-1D8细胞免疫小鼠的脾细胞和经放射线照射的野生型K1735细胞共同培养5天，并检测裂解的野生型K1735细胞(■)，Ag104(□)和YAC-1(○)细胞的4小时51Cr释放试验，d)要做一个与图5c相似的实验，以除外已经与抗asialo GM1抗体和兔补体共同孵育过的脾细胞，这样可在与经放射线照射的野生型K1735细胞共同培养和检测之前去除自然杀伤细胞。它们的能抵抗野生型K1735细胞(■)的细胞裂解活性被I类抗主要组织相容性抗原的单克隆抗体(▲)所抑制。在YAC-1(○)细胞没有被裂解的时候，可以检测到抗Ag104(□)较低的溶细胞活性。
图20.在细胞表面表达抗-4-1BB scFv的K1735-1D8细胞，可以在1D8和野生型细胞的比例为1∶10时抑制混合有野生型K1735细胞的混合物形成肿瘤，这被证实是一种“旁观者效应”。这张图显示了在具有免疫活性的自体(C3H)小鼠体内，K1735-1D8细胞与野生型K1735细胞混合物(比例为1∶10)的生长被抑制。用野生型K1735细胞单独进行免疫，或将野生型K1735细胞与用K1735-1D8转染的细胞以未转染肿瘤细胞与转染肿瘤细胞的比例，即10∶1的比例混合免疫。将2×106个野生型K1735细胞与2×105个K1735-1D8细胞相混合，用来皮下免疫C3H小鼠。每隔5天对肿瘤的生长进行监测。
图21.5B9抗人4-1BB scFv序列。这张图显示了预测的细胞表面表达5B9Ig的核苷酸和氨基酸序列。
图22.表1.
图23.表2.
图24.表3.
图25.表4.
发明详述除非特别说明，此项发明可能采用了分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的多种技术，这些均是包含在所属技术领域中的技术。各种有用的技术在文献中均有解释，例如，分子克隆实验室手册，第二版(Sambrook etal.，1989)和分子克隆实验室手册，第三版(Sambrook and Russel，2001)，(在此共同和分别参考作为″Sambrook″)；寡核苷酸合成(M.J.Gait，ed.，1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney，ed.，1987)；实验免疫学手册(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.)；哺乳类动物细胞基因转移载体(J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；分子生物学最新操作手册(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括2001年全年增刊)；PCR聚合酶链反应(Mullis et al.，eds.，1994)；免疫学最新操作手册(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；免疫测定手册(D.Wild，ed.，Stockton Press NY，1994)；生物结合技术(Greg T.Hermanson，ed..Academic Press，1996)；免疫分析方法(R.Masseyeff，W.H.Albert，和N.A.Staines，eds.，WeinheimVCH Verlags gesellschaftmbH，1993)；Harlow and Lane(1988)抗体，实验室手册，冷泉港出版社，纽约，and Harlow and Lane(1999)应用抗体实验室手册，纽约冷泉港出版社，(在此共同和分别参考文献作者为Harlow和Lane)，Beaucage et al.eds，核酸化学最新操作手册，John Wiley &Sons，Inc.，New York，2000)；and Agrawal，ed.，寡核苷酸及其类似物合成操作手册和特性Humana Press Inc.，美国新泽西州，1993)。
本发明涉及能够从抗肿瘤或抗癌剂获益的疾病、失常和病症的治疗、预防和/或缓解，还涉及其中所用的制剂。
本发明提供了，例如，用于产生抗肿瘤免疫的多种方法和组合物。
一方面，这项发明提供了一种新方法，可在体外获得肿瘤反应性T淋巴细胞群，这种细胞群通过用固相化CD3与单独CD28或者与CD28加CD40共同组合来刺激共培养的PBMC和肿瘤细胞PBMC，后者来自癌症患者，包括晚期癌症患者(总体免疫抑制)。在另一方面，例如，这项发明提供组合物，其包括编码在细胞表面表达的抗CD3 scFv或抗4-1BB scFv的基因或其他多核苷酸。另一方面，这项发明提供了能够表达这些基因并用于诱导抗肿瘤免疫的转染细胞。
用固相化在磁珠上的抗CD3和CD28抗体刺激与活化T细胞，均可导致多克隆T细胞的生长和多种细胞因子的产生(Levine et al.，JImmunol，159，5921-30，1997；Garlie et al.，J Immunother，22，336-45，1999)。而从多克隆繁殖到经过抗CD3和CD28抗体刺激后的抗原特异性T细胞的产生和/或增殖的转换在先前没有描述。
如此处所述，例如，通过在培养物，尤其是在最初的培养物中加入自体肿瘤细胞可以完成这种转换。试验显示肿瘤细胞在48-72小时之内被活化的T细胞破坏，并且培养物中的单核细胞在同一时期发育成熟为CD83+的树突状细胞。这被认为是其暴露在淋巴因子中的结果，这类因子包括由活化的T细胞分泌的干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。树突状细胞吞噬被消灭的肿瘤细胞，并且递呈肿瘤抗原给活化的T细胞，促进肿瘤特异性T细胞不断的增殖和生长。
另一方面，本发明提供编码抗CD3 scFv的基因或其他多核苷酸，这种抗体片段可能对CD3是特异性的。这种基因或者多核苷酸可以被转染，用于在诸如人或小鼠肿瘤细胞系的表面进行表达。在这两种情况下，这种转染的细胞可以活化T淋巴细胞，使其增殖，产生淋巴细胞因子并杀伤肿瘤细胞。
另外进行的体内试验显示，在细胞表面表达抗小鼠CD3的小鼠肿瘤细胞会被具有免疫活性的小鼠排斥，并且诱导出现对同一肿瘤野生型细胞的系统免疫力。因此，尽管由抗小鼠或抗人CD3基因编码的scFv在肿瘤细胞表面表达时可以诱导T细胞活化，本发明证实当将上述基因产物作为一种肿瘤疫苗在体内应用，且体内出现肿瘤细胞时，这种疫苗会诱导体内免疫向抗原特异性免疫转变。
另一方面，本发明中构建的基因或者其他的多核苷酸可以编码例如抗4-1BB scFv，对4-1BB具有特异性，例如可以将它们转染至人和小鼠的肿瘤细胞中，并在这些细胞表面表达。这种被转染的肿瘤细胞可以活化来自各自种属的T淋巴细胞。用抗小鼠4-1BB scFv基因转染的小鼠肿瘤细胞会被具有免疫活性的小鼠排斥，这种基因可作为一种疫苗诱导肿瘤特异性免疫，排斥来自相同肿瘤的野生型细胞。这种免疫反应显示出了记忆性和抗原特异性，对被研究的生长在皮下或肺转移的肿瘤细胞(K1735黑色素瘤)具有治疗效果。由于K1735表达的I类主要组织相容性抗原分子水平非常低，并缺乏II类主要组织相容性抗原分子，且大多数的人类肿瘤细胞情况也很类似，具有非常低的免疫原性，所以这些结果具有重要的生物学意义。
我们已经制造出了与小鼠和人的CD3和4-1BB可以发生反应的编码scFv分子的基因。每个基因均包括跨膜结构域和人CD80的细胞质尾。另外，每个基因均编码铰链区和人IgG1的CH2和CH3结构域，位于scFv结合位点和跨膜结构域之间。这些基因和这些基因转染的细胞对于治疗肿瘤都是有用的。
例如，正如下面的实验中指出的那样，编码在细胞表面表达的抗CD3或者抗4-1BB scFv分子的cDNA可以作为一种DNA质粒转导给肿瘤患者，或者可以在诸如病毒或者细菌载体中进行转导。在体外，编码在细胞表面表达的抗CD3或者抗4-1BB scFv分子的cDNA可以被导入肿瘤细胞，转染后的肿瘤细胞可以用于治疗。可以使用自体的或同种异体的肿瘤细胞。细胞表面表达的scFv基因编码分子的结合源于其编码基因的结合，所表达的scFv分子与T细胞表面的受体结合，提供活化或共刺激信号。本发明中还设想了另外一种在体内传导多克隆活化信号给T细胞的方法，包括给患者注射包含由T细胞表达的表面受体的抗体或配体的缓释聚合体。
本发明还提供了一种新的方法，在体外生成/扩增肿瘤选择性T淋巴细胞，通过活化出现自体肿瘤细胞中的这些细胞和CD3和共刺激分子介导的信号，用于例如继受性转移给肿瘤患者。本发明有利于在体外产生能够递呈肿瘤细胞释放抗原的树突状细胞，以扩大已经存在的肿瘤反应性T细胞群，并有利于产生先前未被认识的针对抗原的免疫反应。在体外生成的T细胞，如发明中描述的那样，对TGF-β的抑制作用更不敏感，并有较长的生命周期。
本发明还描述了两种通过转染编码抗体衍生分子的scFv基因产生的新型人类肿瘤疫苗，它们可以识别CD3或4-1BB，在检验它们抵抗免疫原性较低、且仅少量表达I类主要组织相容性抗原分子而不表达II类主要组织相容性抗原分子的小鼠黑色素瘤时，显示这些疫苗可以诱导产生肿瘤破坏性免疫反应。本发明中描述的这种方法可用于转染人类肿瘤细胞，表达抗人CD3或抗人4-1BB scFv用于基于细胞的免疫。另外，其可以较容易地被用于构建基于基因的肿瘤疫苗，其中基因编码的肿瘤表位可以与基因编码的抗CD3 scFv或/和抗4-1BBscFv相结合。通过结合可以识别其他的或不同的免疫刺激物受体的scFv和/或编码上调抗肿瘤免疫反应的淋巴细胞因子的基因可以使本发明的应用范围扩大。
本发明将参照特定的实验被进一步讨论，这些实验可能仅采用实施例的方式，不以任何方式对本发明进行限制。
实施例1来自晚期癌症患者的CD3介导的肿瘤反应性淋巴细胞的活化外周血单核细胞(PBMC)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，在偶联了与CD28单克隆抗体或者CD28和CD40单克隆抗体结合的CD3单克隆抗体的磁珠存在的情况下，与自体肿瘤细胞共同培养。对培养中发生的一些情况进行表征，包括培养的肿瘤细胞被破坏，淋巴细胞增殖和淋巴细胞因子的产生，CD83+抗原递呈细胞的产生和肿瘤反应性细胞毒性淋巴细胞的活化/扩增，以及淋巴细胞对TGF-β抑制作用的敏感性下降。
取自患者的材料。肿瘤取自IV期癌症患者的手术或者恶性渗出物(多数为腹水)。肿瘤和外周血样品均在知情同意下获得。大多数的研究采用8名患者，其中5名(1OV，3OV，8OV，44OV，48OV)患卵巢癌，2名(1C，22C)患结肠癌，一名(1HN)患有头颈部肿瘤。实验还使用了来自卵巢癌细胞系4007的细胞。
肿瘤和血液样品的准备。将实体肿瘤悬于培养基中，去除渗出物中的液体部分，然后将细胞垂悬。用Ficoll-Hypaque(PharmaciaBiotech，Upsala，Sweden)去除红细胞，利用Percoll梯度(Sigma，St Louis，MO)从肿瘤浸润淋巴细胞中分离肿瘤细胞。淋巴细胞样本可以直接使用或储存在液氮中以备日后使用。使用标准的操作步骤将肿瘤样本移植到体外并建立细胞系。外周血单核细胞包括T淋巴细胞，单核细胞和B细胞，用Ficoll-Hypaque对它们进行纯化。在很多最初的实验中，使用了CD8+T淋巴细胞(纯度＞90％)，这些细胞是应用VarioMac磁珠(Miltenyi Biotech公司，Auburn，CA)从肿瘤浸润淋巴细胞中筛选出来的。
结合淋巴细胞、抗体偶联的磁珠和肿瘤细胞的培养物的制备。在最初的实验中，每个肿瘤细胞中加入了5个淋巴细胞，然后混合物在装有RPMI培养基和10％胎牛血清(Atlanta Biological，Norcross，GA)的Costar(3513)的12-孔培养板(Coming Inc.，Coming，NY)中，在37℃的环境中孵育。随后，使用一种公开的技术(Levine，Bernstein et al.，J Immunol，159，5921-30，1997；Gariie，LeFever et al.，J Immunother，22，336-45，1999)，将外周血单核细胞或肿瘤浸润淋巴细胞与或不与被偶联在磁珠(Dynal Inc.，Lake Success，NY)上的自体肿瘤细胞共同培养，磁珠上偶联有CD3，CD28，和/或CD40的单克隆抗体；将没有偶联单克隆抗体(或偶联有不相关的单克隆抗体)的磁珠作为对照。偶联的单克隆抗体分别是64.1(Martin et al.，JImmunol，136，3282-7，1986)(Martin，Ledbetter et al.，J Immunol，136，3282-7，1986)、9.3(Martin，Ledbetter et al.，J Immimol，136，3282-7，1986)和G28-5(Ledbetter et al.，J Immunol，138，788-94，1987)，它们分别多克隆地刺激淋巴细胞(抗CD3)，共刺激(抗CD28)，或者活化抗原递呈细胞(抗CD40)。当使用自体肿瘤细胞时，细胞(40,000-75,000/孔)首先需要通过过夜孵育吸附到Costar 24孔培养板上，培养板中加有含有10％胎牛血清的2ml IMDM培养基。然后加入单克隆抗体偶联磁珠(3×106/ml)，再加入悬浮在含10％胎牛血清RPMI中的淋巴细胞(106/ml)。培养板在37℃含有6％CO2的空气中孵育4-5天。使用磁铁除去磁珠，将淋巴细胞置于一个新的含有10U/ml的白介素-2(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的培养板中，然后当浓度达到2×106个细胞/ml后将培养基移至细颈瓶中。观察培养基寻找肿瘤细胞被破坏的证据。通过细胞计数确定淋巴细胞的扩增情况。从培养基中取样，分别用WEHI细胞(Espevik and Nissen-Meyer，J Immunol Methods，95，99-105，1986)应用一种生物分析法测量产生的肿瘤坏死因子，用ELISA(EH-EFNG，Endogen，Wobum，MA)法测量干扰素-γ。TGF-β1购自Sigma公司(St Louis，MO)。所有试验中都会使用TGF-β1，即便是在去除了单克隆抗体偶联的磁珠之后，这些分子仍然留在培养基中。
细胞毒性淋巴细胞的检测。使用经典的4-小时51Cr释放法进行检测。为了给效应细胞定性，在实验时向细胞中加入可以识别I类主要组织相容性抗原分子的框架决定簇(Research Diagnostics Inc.，Flanders，NJ)的单克隆抗体w6/32(10ug/ml)抑制细胞毒性。也可使用自然杀伤细胞标志抗原CD16和CD56的单克隆抗体(BeckmanCoulter，Brea，CA)，抗CD8单克隆抗体HIT8a(BD Pharmingen，Lexington，KY)，和抗整合素-β2(CD18)的单克隆抗体60.3(Beattyet al.，J Immunol，131，2913-8，1983)。
淋巴细胞的FACS分析。通过FACS(Epics XL，Coulter，Miami，FL)方法评估CD的表达密度，使用PE标记的单克隆抗体，并在细胞达到预设的最小亮度时将它们计为阳性。为了研究淋巴细胞在体外活化之后CD3表达密度增加是否是由于最初CD3高表达细胞选择性增殖的造成的，用染料CFDA对从肿瘤患者收集的外周血淋巴细胞(den Haan et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)(MolecularProbes，Eugene，OR)进行标记。随后，在附着有抗CD3/CD28/CD40磁珠的培养液中培养5天，然后去除磁珠，将扩增后的淋巴细胞移至含有10U白介素-2/ml的培养基中。在去除磁珠后的两个时间点(4小时和3天)时进行FACS分析，分析每个孔的CFDA亮度和CD3的表达。将培养后被标记的淋巴细胞与对照磁珠共同培养用于比较研究。
抗体偶联磁珠刺激T细胞低反应水平。开始进行了6项实验，从肿瘤浸润淋巴细胞中纯化的CD8+的T淋巴细胞与肿瘤细胞共同培养，对悬浮液进行肿瘤坏死因子或干扰素-γ的分析。在一个有代表性的实验中，将取自一名结肠癌患者，1C，的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞，与1C肿瘤细胞共同培养15天，然后将淋巴细胞取出，并加入一组新鲜的1C细胞中或加入取自一名肺癌患者的肿瘤细胞--3L中。当1C淋巴细胞与1C结合而没有与3L结合时，仅测得少量的肿瘤坏死因子(1.2pg/ml)，但是当来自3L的肿瘤浸润淋巴细胞与3L肿瘤细胞结合，但没有单独培养时，产生了肿瘤坏死因子和干扰素-γ(1.5pg/ml)。没有淋巴细胞增殖的证据。在随后的实验中，将除CD8+淋巴细胞之外，还包含有单核细胞，CD4+T细胞和B细胞的肿瘤浸润淋巴细胞细胞群，与自体肿瘤细胞共同培养10-15天。在13名患者中，有8名患者的培养悬液中检测到了约10倍高水平的肿瘤坏死因子(4.5-48pg/ml)和干扰素-γ(高达150pg/ml)。仍然没有淋巴细胞增殖。
在自体肿瘤细胞和抗CD3偶联磁珠共同培养时，T细胞增殖和肿瘤细胞破坏的论证。最初的实验之后进行一项系统实验，即使用单克隆抗体偶联的磁性磁珠通过各种淋巴细胞受体(Levine，Bernstein etal.，J Immunol，159，5921-30，1997；Garlie，LeFever et al.，JImmunother，22，336-45，1999)诱导产生信号。在偶联有CD3单克隆抗体，和CD28和/或CD40单克隆抗体磁珠存在的培养基中，将外周血单核细胞或肿瘤浸润淋巴细胞与自体肿瘤细胞共同培养。还包括含有淋巴细胞但不含有肿瘤细胞的相同分组。作为对照，含有或不含有肿瘤细胞的淋巴细胞与未经偶联的对照磁珠共同培养。3-5天后，去除磁珠，将淋巴细胞和肿瘤细胞在10U/ml的白介素-2中分别孵育2-21天。
图1显示OV44患者肿瘤浸润淋巴细胞在抗CD3/CD28/CD40偶联磁珠中培养4天时旺盛增殖的实验结果。缺乏CD3信号刺激的淋巴细胞不会增殖，使用抗CD28和/或CD40磁珠培养的淋巴细胞也不会增殖(未显示数据)。自体肿瘤细胞最初与通过CD3诱导信号的磁珠共同培养时增殖较多(图面B)。抗CD3/CD28偶联磁珠诱导的增殖与抗CD3/CD28/CD40偶联磁珠相同(数据未显示)。
图2显示来自患者1C的外周血淋巴细胞和各种单克隆抗体偶联磁珠与自体肿瘤细胞或同种异体(4007)细胞培养5天的实验结果。当CD3/CD28(图面C)或抗CD3/CD28/CD40(图2D)活化的淋巴细胞与1C肿瘤细胞共同培养时，每个培养孔中淋巴细胞的数量比其与4007细胞共同培养时要高，结果与图1中所示相同。FACS分析显示，＞90％的活化的淋巴细胞表达CD3，大约70％是CD8+，少于5％表达CD16或CD56。另一方面，在磁珠不提供任何CD3介导的信号的情况下(图2A和B)，加入异源肿瘤细胞后增殖水平较高，可能是由于对在4007细胞上表达的异体抗原产生免疫反应。
大多数肿瘤细胞在与存在抗CD3/CD28或抗CD3/CD28/CD40偶联磁珠的情况下培养的自体淋巴细胞接触24-48小时之内被破坏，常常会留下含有完全由有着淋巴细胞形态细胞构成的培养基。为了研究这种肿瘤破坏是否具有免疫特异性，进行了四项实验，首先对来自肿瘤患者的外周血淋巴细胞(106-105/份样本)进行梯度稀释，将它们与自体肿瘤细胞或来自同种异体供者的肿瘤细胞或纤维母细胞共同培养。在两项实验中，与自体肿瘤共同培养的细胞悬液中存在大约10倍多的肿瘤坏死因子，但是自体或同种异体肿瘤细胞或同种异体纤维母细胞共同培养基之间在杀伤细胞的数据上没有差异。由此推断，在淋巴细胞活化24-72小时之后出现的肿瘤细胞的破坏不具有抗原特异性，或许是由于大量活化的T淋巴细胞和淋巴细胞因子不能辨别特异性的组分。
肿瘤选择性细胞毒性淋巴细胞的产生。I类主要组织相容性抗原限制性的细胞毒性淋巴细胞是由肿瘤细胞加上抗CD3/CD28或抗CD3/CD28/CD40磁珠活化的淋巴细胞产生的。图3显示用取自患者1C的外周血淋巴细胞(在图2显示的实验中已被活化)所做的一个实验，在经肿瘤细胞和单克隆抗体偶联磁珠活化之后，将磁珠去除，并将淋巴细胞在缺乏肿瘤细胞和磁珠的10U白介素-2/ml培养基中扩增培养超过3周。被1C和抗CD3/CD28磁珠活化的外周血淋巴细胞对1C细胞有着很强的细胞溶解性，CD8单克隆抗体和I类主要组织相容性抗原单克隆抗体w6/32可以抑制这种溶解作用(图3A)。50∶1的E/T仅仅能杀死20％的同种异体4007细胞，相比之下98％的1C细胞会被50∶1的E/T溶解(图3A)。图3B提供了被抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激的外周血淋巴细胞的类似数据。4007细胞的溶解与存在有单克隆抗体w6/32时培养的1C处于同样低的水平。相比之下，抗CD3/CD28/CD40磁珠活化的外周血淋巴细胞可以杀伤1C和4007两种细胞，这种情况也出现在CD8单克隆抗体或单克隆抗体w6/32存在的情况下(数据未显示)。图3B中显示在实验中使用的从细胞群中浓缩得到的CD8+细胞以20/1的E/T比率溶解了25％的1C细胞，相比较来自4007细胞系溶解了0％的细胞，来自同种异体B细胞系也溶解了0％的细胞。在这项实验中，使用单克隆抗体w6/32培养1C细胞的溶解率为5％，使用抗CD18单克隆抗体60.3培养时的溶解率为5％，使用CD16和CD56单克隆抗体联合培养时，溶解率仅仅从25％减少到18％。通过与4007细胞和任何一种磁珠联合培养活化的淋巴细胞并不会选择性的溶解1C或4007细胞。重复细胞毒性淋巴细胞分析法两次，均获得同样的结果。
Th1型淋巴因子的产生。CD3介导活化的淋巴细胞培养上清中可见检测到大量的干扰素-γ。图4中对此进行了说明，这也说明在培养开始的4-5天期间还存在自体肿瘤细胞时产生的干扰素-γ较高。
表1显示了六个额外的，有代表性的实验，表明外周血淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和淋巴细胞因子的产生在取自患者的细胞或在一轮的体外磁珠活化之后均可被检测出来。抗CD3，抗CD3/CD28，抗CD3/CD40和抗CD3/CD28/CD40磁珠均能强烈地促进淋巴细胞的增殖，它们之间的效果并没有差别。相比较而言，单独使用抗CD28，抗CD40和抗CD28/CD40磁珠，并不比对照磁珠更能增加淋巴细胞的增殖和淋巴因子的产生，这表明CD3介导的信号非常重要。肿瘤坏死因子和干扰素-γ的产生有相关性。当淋巴细胞在没有肿瘤细胞和磁珠的情况下生长3-5天时，它们的含量降低到背景水平。如图1和4所示，诱导有效的淋巴细胞增殖和淋巴因子产生需要CD3信号。
通过单克隆抗体-偶联磁珠活化的淋巴细胞上CD3和其他标志物的上调。在与肿瘤细胞和抗CD3/CD28/CD40磁珠一起培养3到5天之前和之后，用FACS测量在淋巴细胞群上CD抗原的表达密度，然后的3到7天则为不加磁珠培养的扩增期。为了反应CD受体表达密度的变化，报告每一群细胞的百分比，它们的密度等于选定的设定值亮度，或者高于设定值(表2)；分析来自6名健康供者(年龄在30到65岁)未被刺激的外周血淋巴细胞作为比较。来自肿瘤患者的未被刺激的外周血淋巴细胞的CD3，CD4和CD28的水平较低。5名患者中的4名CD3密度也较低，而CD86的密度高于健康供者未被刺激的外周血淋巴细胞水平。与对照磁珠共同培养的外周血淋巴细胞CD3表达部分增加，但CD28的表达增加不明显。相比较之下，使用抗CD3/CD28/CD40磁珠培养的细胞CD3和CD28的表达量都能恢复到正常的水平，并且使高CD8表达密度的细胞数量加倍。对5名患者的TIL研究CD3的表达密度。分别为2.9％，40.2％，96％，42.8％和40.1％，显示也更为多变，并且通常高于外周血单核细胞。肿瘤浸润淋巴细胞的CD3表达高于外周血单核细胞，并且从61.4％增加到87.3％。肿瘤浸润淋巴细胞中CD28表达的相应值为39.3％和52.8％。
为了研究淋巴细胞在体外活化之后CD3表达密度的增加是否是由于最初高CD3表达的细胞选择性增值的结果，可使用染料CFDA(Molecular Probes，Eugene，OR)对从肿瘤患者浓缩得到的外周血淋巴细胞进行标记。使用肿瘤浸润淋巴细胞进行实验，40.2％最初表达CD3，应用染料CFDA(den Haan，Lehar et al，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)进行标记。通过抗CD3/CD28/CD40磁珠活化之后，CD3表达增加至95％。使用CFDA和PE-标记的抗CD3作为探针进行FACS分析，结果显示没有最初CD3高表达外周血淋巴细胞亚群的选择性增殖。
在使用抗CD3/CD28磁珠活化之后培养细胞的CD83的表达。为了研究使用抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激外周血单核细胞(发现其中10-20％表达单核细胞标志物CD14)是否可以促进树突状细胞的成熟，在刺激之后的不同时间点对CD83的表达进行了测量。CD83是由成熟之后的树突状细胞表达的，未成熟的树突状细胞和血单核细胞并不表达。图5说明了一个典型的实验，显示早在应用抗CD3/CD28磁珠刺激PBMC之后的24小时，在35％的细胞中就可以检测到CD83的表达。在刺激外周血单核细胞的第0天(刺激之前)未检测到CD83的表达。
为了确定外周血单核细胞刺激之后什么细胞表达CD83，在使用抗CD3/CD28磁珠或抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激之后的第2天，使用荧光素标记的抗CD3对PE-标记的抗CD83两种颜色进行染色。图6显示在缺乏磁珠刺激的细胞没有CD83的表达，抗CD3/CD28偶联磁珠诱导CD3阴性细胞群(13.9％)CD83的表达，且CD3阳性细胞中也有相当的比例表达CD83。相比之下，抗CD3/CD28/CD40偶联磁珠可以活化诱导CD83的表达，但是所诱导的CD3阴性细胞和CD3阳性细胞表达CD83的水平比抗CD3/CD28磁珠的诱导要低。这些结果显示，表达树突状细胞标志物CD83的细胞是在经过抗CD3和抗CD28单克隆抗体偶联磁珠刺激之后从外周血单核细胞快速诱导而来的。抗CD3，抗CD28，和抗CD40单克隆抗体偶联磁珠的刺激作用，没有抗CD3和抗CD28单克隆抗体偶联磁珠单独用于刺激CD83的表达那样有效。
通过单克隆抗体偶联磁珠产生的活化信号增加对TGF-β1抑制作用的抗性。表3显示了5个有代表性的实验，研究TGF-β1对淋巴因子产生和淋巴细胞增殖的抑制效果是否可以通过与可以诱导CD3介导信号的磁珠共同培养而被改变。使用对照磁珠，肿瘤坏死因子和干扰素-γ水平很低，并且它们的水平被TGF-β1进一步抑制。相比之下，使用抗CD3/CD28/CD40磁珠时，他们的水平增加到了没有TGF-β1时出现的水平。同样，当使用抗CD3/CD28/CD40磁珠时，TGF-β1对于淋巴细胞增殖的抑制作用更小，在患者1HN甚至根本未发现抑制作用。当TGF-β1的剂量增加到20ng/ml，且当淋巴细胞的浓度减少到105/样本时(数据未显示)，也可以见到T细胞的增殖和淋巴因子的产生出现相对排斥。当磁珠通过CD28，CD40单独或共同进行刺激时，并不会抵抗TGF-β1的作用(数据未显示)。
因此，伴随着肿瘤细胞的杀伤，与肿瘤细胞共同培养的淋巴细胞活化导致了抗原的释放。培养基中的单核细胞吞噬肿瘤抗原，分化成CD83阳性的抗原递呈细胞递呈抗原决定簇，使肿瘤反应性T细胞选择性增殖。治疗疫苗可以基于同样的原理，活化和增殖肿瘤携带个体中的受抑制的淋巴细胞，也可以促进针对亚显性抗原决定簇的免疫反应的产生。总体而言，产生肿瘤反应性T细胞的培养体系将包括四部分。它们是1)来源于癌症患者的T细胞，2)来自患者的抗原递呈细胞，3)与抗CD3和抗CD28抗体，或抗CD3，抗CD28和抗CD40抗体偶联的磁珠，和4)来自患者的肿瘤细胞这些组成部分可以有很多种变化，这下变化可被预测或进行评价。包括任何四种组成部分加入时间的变化，还有四种组成部分来源的不同。例如，患者T细胞可以从外周血或肿瘤浸润淋巴细胞中分离。抗原递呈细胞，在实施例中是存在于外周血单核细胞部分中的，但是可以有其他来源，例如骨髓。实施例中在培养基中使用的是自体肿瘤细胞，但是也可以加入同种异体肿瘤细胞或肿瘤抗原或用其替代自体肿瘤细胞，这是因为肿瘤抗原是通过自体抗原递呈细胞来递呈的。抗CD3和抗CD28抗体偶联磁珠可以被其他途径固相化的抗体替代，也可以由针对其他细胞表面受体所产生的固相化抗体或者特异性的配体组成，促进多克隆T细胞的活化和肿瘤反应性T细胞的增殖。
这些操作方法也使CD3阳性淋巴细胞的产生成为可能，持续在体外培养超过10周，即可用于过继免疫治疗。这可能是由于通过CD28的联合刺激减少了淋巴细胞凋亡的可能性(Boise et al..Immunity，3，87-98，1995；Daniel et al.，J Immunol，159，3808-15，1997)，在体外的生命周期延长(Levine，Bernstein et al.，J Immunol，159，5921-30，1997)。与在高剂量白介素2存在的情况下淋巴细胞存活期延长有所不同，共刺激的淋巴细胞在转导回患者自体之后存活周期也会延长(Ranga et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，95，1201-1206，1998)。值得注意的是，CD3介导的T细胞的刺激作用是与CD28单独结合或与CD24一起结合完成的，可以防止大约50％的TGF-β1介导的对淋巴细胞增殖和肿瘤坏死因子及干扰素-γ产生的抑制作用，即使当使用的TGF-β1在培养液中的浓度处于20ng/ml的饱和水平时也是如此。
实施例2含有编码抗人和抗小鼠CD3 scFv的载体的构建，转染，并且证实在细胞表面表达抗CD3 scFv可诱导T细胞的多克隆刺激，使其增殖，并产生Th1型淋巴因子，具有体内溶细胞性及抗肿瘤活性的上面描述的实验显示，在含有自体肿瘤细胞和外周血单核细胞或肿瘤浸润淋巴细胞的培养基中，由抗CD3单克隆抗体偶联磁珠提供的信号使肿瘤反应性淋巴细胞活化并扩增。这里提到的基因是指构建的用于肿瘤治疗的基因，可以在肿瘤细胞表面表达具有活性的抗CD3单克隆抗体scFv(scFv)衍生物。用杂交瘤500A2构建了与小鼠CD3具有反应性的抗CD3 scFv，用杂交瘤G19-4构建了与人CD3具有反应性的抗CD3 scFv(Ledbetter et al.，J.Immunol.，136，3945-3952，1986)。
scFv的构建。通过克隆来自杂交瘤RNA(Hayden et al.，TherImmunol，1，3-15.1994；Gilliland et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996)的抗体可变区轻链和重链构建scFv(scFvs)的细胞表面构型。杂交瘤生长在RPMI溶液[10％胎牛血清，4mM谷氨酸盐，1mM丙酮酸钠，和50u/ml青链霉素，(均购自Life Technologies，Gaithersburg MD)]中，在收获细胞前保持对数生长方式数天。通过离心悬浮培养液收集细胞，应用Trazol或使用QIAGEN RNA柱抽提的方法(LifeTechnologies，Gaithersburg MD，and QIAGEN，Valencia，CA)按照生产商提供的说明，或者使用一种改良的NP-40溶解技术(Gilliland，Norris et aL，Tissue Antigens，47，1-20，1996)，从2×107个细胞中提取RNA。使用Superscript II反转录酶(Life Technologies)和随机六聚体(Takara Shuzo，Otsu Shiga，Japan)，及1微克的总RNA进行随机引物法合成cDNA第一链。在逆转录后，用dGTP和末端转移酶使cDNA片段具有多聚G尾，这种酶可以催化三磷酸脱氧核苷酸在一条DNA链末端的3′-OH基团加上一个脱氧核苷酸。cDNA具有锚定尾，可增加在一端具有未知前导肽的mRNA克隆的效率。如所述，5′端引物是一个修饰的ANCTAIL引物，包括一个多聚C尾，用于T细胞受体核酸链序列的聚合酶链扩增反应(Loh et aL，Science，243，217-20，1989)，其还具有SacI，XbaI，和EcoRI位点，方便进行克隆。这一序列如下5’-cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatgagtccccccccccccc-3’cDNA的3’端引物来自重链或轻链的恒定区，并结合跨越J-C连接区的大约50个碱基。每个3’端引物包含有HindIII，BamHI，和SalI克隆位点。因此，用于起始片段亚克隆的限制性位点作为这些起始PCR扩增引物的一部分，消化扩增的PCR片段并亚克隆到pUC19，pSL1180，或TOPO载体(Invitrogen，San Diego，CA)用于测序。使用pUC，T7，或Ml3通用和反向引物，以及BigDye末端中止循环测序试剂盒(PE Biosystems，Foster City，CA)，用ABI Prism 310(PE Biosystems)测序仪对miniprep DNA(QIAGEN.Valencia，CA)进行DNA测序。
一旦分离到可变区并且在至少三个相同的克隆得到了相同的序列，便可使用重叠寡聚核苷酸通过PCR扩增构建scFv，致使编码轻链和重链可变区的cDNA融合。加入一种(gly4ser)3连接子作为重叠寡聚核苷酸的一部分的方法，使得轻链和重链可变区在这种缝合聚合酶链反应期间连接到一起(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996)。将装配完毕的scFv分子亚克隆到按照阅读框融合人CD80跨膜区和细胞质尾的人IgG1铰链区，CH2，和CH3结构域的上游(Winberg et al.，Immunol Rev，153，1996)。完整的表达盒编码轻链V区域的天然的引导肽链，或来自能与scFv可变区的SalI位点融合的L6VK轻链的分泌性信号肽。scFv由HindIII-BclI，或SalI-BclI盒编码，其第一个限制性位点与开放型阅读框相符，与此同时，第二个限制性位点在与融合蛋白相关的编码框之外。然后将该盒与编码区位于BstBI-ClaI区段上的人IgG1野生型Fc结构域相融合。CD80的跨膜区域和细胞质中的尾部均可通过聚合酶链反应(PCR)的方法从人扁桃体RNA扩增而来，其编码区位于BstBI-ClaI区段上，其中包括一个恰处于ClaI位点上游的终止密码子。将每一个亚片段都用亚克隆的方法插入人工的多连接子/多克隆位点当中，这些位点事先已被插入至经修饰的pCDNA3载体当中。一旦编码细胞表面scFv的完整融合蛋白结构组装完毕，便可将整个表达盒作为一种HindIII-ClaI片段转移至逆转录表达载体pLNCX当中去(Miller and Rosman，Biotechniques，7，980-2，984-6，989-90，1989)(图9)。
转染。质粒DNA是由重组的反转录载体制备而来的，并用CaPO4沉淀技术(Winberg，et aL，(1996)Immunol Rev.153209-223.)转染PT67双嗜性包装细胞(Clontech，Palo Alto，CA)。简言之，将细胞以约25％的融合度，加入含有10％胎牛血清、4mM谷氨酸盐、2倍浓度的DMEM非必须氨基酸和青霉素-链霉素的DMEM培养基(这种配方在下文中被称为DMEM-C，所有的试剂均购自LifeTechnologies公司)中，在转染之前培养过夜。将质粒DNA加入0.5ml浓度为0.25M的CaCl2溶液中，再逐滴加入0.5ml 2倍浓度的HEBS缓冲液(pH 7.1)。在37℃的环境下，5分钟后会析出沉淀，然后将溶液逐滴加入生长在加有DMEM-C培养基(8ml)的、直径为100mm的培养皿内的细胞中。将经转染的细胞孵育过夜，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两遍，再倒入新鲜的培养基。从被转染的细胞中收集病毒上清，并在24小时之后将其用于转导。或者，将经转染的，能够表达细胞表面scFv的贴壁PT67细胞与B细胞系的细胞在悬浮液中共同培养。几次传代之后，将培养基中的包装细胞稀释，用固相化在培养瓶上的山羊抗人IgG1对细胞表面表达scFv的B细胞系进行陶选。表达高水平细胞表面scFv的细胞在培养瓶上的固定程度较为牢靠，不能表达该抗体的或抗体表达水平较低的细胞会被从培养瓶上洗脱。用在培养瓶表面刮拭的方法将高水平表达的细胞分离，在用于生物学分析之前重新培养数日。
小鼠和肿瘤细胞系。购买了6到8周的老年雌性C3H/HeN小鼠(Taconic，Germantown，New York)。K1735是一种C3H/HeN发生的恶性黑色素瘤，选择了一种转移克隆M2(Fidler and Hart，CancerRes，41，3266-3267，1981)。与先前的发现一致，发现其MHC I类表达非常低(数据未显示)。动物设施是经过ALAC认证的并且实验方法是经过相应的公共动物协会认可的。
抗体。R-藻红蛋白(PE)-偶联单克隆抗体GK1.5(抗小鼠CD4)，53-6.7(抗小鼠CD8a)和纯化的AF3-12.1(抗H-2KK)购自Pharmingen公司(San Diego，California)，R-PE偶联的山羊F(ab′)2抗人IgG购自Biosource International公司(Camarillo，California)。单克隆抗体169-4(抗CD8)来自R.Mittler博士(Emory University，Atlanta，Georgia)。GK1.5(抗CD4)是来自ATCC杂交细胞瘤产生的。
载体和K1735细胞的转染。描述了可变区克隆，scFv构建，和scFv表达产生的方法(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996；Hayden et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。本发明采用来自抗CD3杂交瘤500A2或者抗4-1BB杂交瘤1D8可变区的基因来使得细胞结合500A2 scFv或者1D8 scFv在细胞表面表达(Hayden，Grosmaire et al..Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，ImmunolRev，153，1996)。为了表达scFv，使用了来自CD80的跨膜结构域和细胞质尾，因为其介导了细胞骨架的附着和细胞与细胞接触时的交联(Doty and dark，J Immunol，157，3270-9，1996；Doty and Clark，JImmunol，161，2700-7，1998)。将scFv基因融合到pLNCX中，通过CaPO4沉淀方法转染RetroPackTMPT67包装细胞(ClontechLaboratories.Inc，Palo Alto，California)。使用来自这些细胞的培养基转染K1735-WT细胞。使用PE标记的羊抗人IgG对G418抗性克隆进行标记用于scFv细胞表面的表达。
动物研究。小鼠，5或10只/组，后背一侧皮下移植2×106个野生型K1735细胞或K1735-500A2细胞或γ-射线照射的(12,000拉德)野生型K1735细胞。使用野生型K1735细胞(2×106细胞/小鼠)或Ag104(3×105细胞/小鼠)刺激免疫小鼠。通过应用测径器测量两个最大的垂直直径来评估肿瘤的大小，并报告平均肿瘤面积(mm2)±SD。将肿瘤皮下移植的部位的毛剃除有利于肿瘤的测量。
CD4+和/或CD8+T淋巴细胞和自然杀伤细胞在体内的消耗。T细胞消耗如文中所述(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992)，给小鼠腹腔注射CD4单克隆抗体(GK1.5，小鼠IgG2b)或CD8(169-4，小鼠IgG 2a)或二者的混合成分，3次剂量为0.5mg/小鼠，连续注射3天。随后每3天使用每种单克隆抗体0.5mg，以维持这种消耗。通过每4天腹腔以30ul/只小鼠的剂量注射抗asialo GM1抗体维持NK细胞的消耗。在第12天，用FACS分析每组的脾细胞来证实消耗的效率。随后，给小鼠皮下移植肿瘤细胞。
增殖方法。将脾细胞在96孔平底培养板(1×105个细胞/孔)与5×105个自体的，经射线照射后的(3,000拉德)脾细胞(作为抗原递呈细胞)和肿瘤细胞共同培养。在孵育了72小时之后，将一式三份的培养物用1μCi3[H]标记的胸腺嘧啶脉冲16-18小时(AmershamPharmacia，Biotech Piscataway，New Jersey)，并测量摄入量。
为了研究哪些T细胞在体外增殖，按照生产商提供的方法(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，将脾细胞在2μM的CFDASB(5-(和-6)-羧基荧光素双乙酸琥珀酸脂)(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)中进行了孵育标记，在野生型K1735细胞存在和不存在的情况下培养了三天，并用FACS进行分析。
细胞毒性淋巴细胞活性检测方法。K1735-1D8移植后2-4周处死小鼠，并制备脾细胞悬浮液。按照规定，使用抗asialo GM1抗体加上兔补体(Cedarane，Ontario，Canada)去除NK细胞，在一个24孔培养板中(Costar Corp.，Cambridge，Massachusetts)将5×106个脾细胞与用1×105□-照射的(12,000拉德)野生型K1735细胞细胞培养5天。应用一种4小时51Cr释放方法，在不同的E/T比率检测细胞的活性。
ELISPOT方法。按照生产商提供的方法使用小鼠IFN-γELISPOT试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)，并通过平板扫描装置对平板进行计数(Cellular Technology Ltd.，Cleveland，Ohio)。
有多克隆活性的人T细胞扩增产生Th1型淋巴因子并使细胞裂解。图10显示了抗人CD3 scFv在Reh细胞和T51细胞表面的表达，其中，前者为一种网状内皮细胞系的细胞，后者为一种淋巴细胞系的细胞。图中显示，被转染的细胞抗CD3 scFv基因产物的表达水平很高。
通过与取自正常捐献者的PBMC共同培养并检测得知，被转染的Reh和T51细胞与野生的Reh和T51细胞的能力相比，前者可以诱导T细胞的扩增。用丝裂酶素C对野生型的和被转染的细胞系进行处理，以预防它们在培养期间扩增。被转染的能够表达抗CD3 scFv的Reh和T51细胞以剂量依赖的模式诱导T细胞的扩增，野生型的Reh和T51细胞则不会(图11)。
进行试验以检测在肿瘤细胞表面表达的抗CD3 scFv是否能够刺激来自外周血单核细胞的T细胞快速地杀死被转染的细胞。将野生型的或被转染的Reh和T51细胞分别用51Cr进行标记，用取自正常捐献者的外周血单核细胞进行8小时51Cr释放试验。图12显示了静止的T细胞快速杀死被转染细胞，而非野生型细胞，并导致剂量依赖性的51Cr的显著释放。
K1735-500A2细胞被有免疫活性的自体小鼠排斥。如在图7中所见到的，已被转染并表达抗小鼠CD3 scFv的K1735-500A2细胞一过性地在小鼠体内生长，随后便遭到排斥。表达CD80的细胞生长迅速，尽管比未经转染的细胞要慢一些，但这与先前被报道的发现是一致的(Chen et al，J Exp Med，179，523-532，1994)。
有10只小鼠被移植了3次，分别间隔7天，每次用2×106个抗CD3(500A2 scFv)转染细胞进行移植(没有接种任何肿瘤)。对9只对照组小鼠仅注射磷酸盐缓冲液(PBS)。然后，对两组小鼠都用106个野生型K1735细胞进行刺激。野生型K1735细胞在所有对照组小鼠体内形成肿瘤，在10只实验组小鼠中，有6只小鼠体内没有形成肿瘤。有4只经免疫的小鼠体内形成了肿瘤，但肿瘤形成的时间比未经免疫(对照)组小鼠晚。在任何一只小鼠体内均没有出现毒性或免疫抑制的证据，包括已经重复注射抗CD3 scFv转染的肿瘤细胞的小鼠。
在将K1735-500A2细胞与野生型K1735细胞混合式出现旁观者效应的证据。为了证实表达抗CD3 scFv的肿瘤细胞，例如，作为体内转染的结果，是否会诱导也能有效抗野生型肿瘤细胞的免疫应答，共进行了两项将野生型K1735细胞与K1735-500A2细胞相混合的试验。第一项试验显示，当两种类型的细胞等量混合的时候，肿瘤会在体内经过短时间的生长后发生退化。在第二项试验中是将2×106个野生型K1735细胞与2×105个K1735-500A2细胞相混合。如图13显示，与单独移植时相比，野生型细胞的生长被抑制了。
用K1735-500A2细胞免疫导致肿瘤选择性T细胞增殖。收集拒绝移植的K1735-500A2细胞的小鼠的脾细胞。图14显示这种脾细胞的增殖，脾细胞当在体外与经放射照射的野生型K1735细胞共同培养时，比脾细胞与经放射照射的抗原性迥异的自体肉瘤Ag104细胞共同培养时增殖的程度更大。射线照射K1735-500A2细胞免疫小鼠脾细胞并不比天然小鼠脾细胞(对照)增殖旺盛。
因此，抗CD3 scFv在肿瘤细胞表面的表达诱导快速杀伤肿瘤细胞，并导致T细胞增殖。这些特性促进了肿瘤特异性免疫，因为肿瘤细胞的破坏以及T细胞的多克隆活化产生肿瘤抗原，后者由在T细胞产生的细胞因子的影响下成熟的树突状细胞吞噬。T细胞通过多克隆抗CD3激活作用首先被致敏，然后随着他们识别由抗原递呈细胞递呈的肿瘤抗原，肿瘤特异性T细胞继续增殖。活化的T细胞形成的1型淋巴因子，以及T细胞本身，可以破坏旁观肿瘤细胞，说明在体内肿瘤细胞的转染，表达抗CD3 scFv可能具有治疗效果。
实施例3抗4-1BB scFv用于癌症基因治疗为了制成能够刺激免疫系统的疫苗，要用现有的技术(Hayden，Grosmaire et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaireet al.，Immunol Rev，153，1996)构建一个能够编码来源于杂交瘤1D8(一种抗-4-1BB单克隆抗体)(Melero，Shuford et al.，Nat Med，3，682-5，1997)的细胞结合型scFv的载体。将这种载体转染至来源于K1735黑色素瘤的细胞当中(Ward et al.，J.Exp.Med.，170，1989)，这种细胞的免疫源性较低，且I型主要组织相容性抗原的表达水平较低。被转染的细胞会诱发一种强烈的Th1型免疫反应，CD4+、而非CD8+的T淋巴细胞对这种反应是必需的，自然杀伤细胞也参与了这种反应。经接种的小鼠能够排斥野生型K1735肿瘤在皮下长成结节或在肺中生长。这项发明的方法将可以有效地对抗人类患者出现微型肿瘤转移灶，包括，例如I型主要组织相容性抗原的表达水平较低的那些肿瘤。
小鼠和肿瘤细胞系。购买了6到8周龄的雌性C3H/HeN小鼠(Taconic，Germantown，New York)。K1735是一种C3H/HeN发生的恶性黑色素瘤，选择了一种稳定克隆M2(Fidler and Hart，CancerRes，41，3266-3267，1981)。与先前的发现一致，发现其MHC I类表达非常低(数据未显示)。Ag104(Ward，Koeppen et al.，J.Exp.Med.，170，1989)是长在C3H/HeN小鼠身上的一种自发性纤维肉瘤。YAC-1购自American Type Culture Collection(Rockville，Maryland)。动物设施是经过ALAC认证的并且实验方法是经过相应的公共动物协会认可的。
抗体。R-藻红蛋白(PE)-偶联单克隆抗体GK1.5(抗小鼠CD4)，53-6.7(抗小鼠CD8a)和纯化的AF3-12.1(抗H-2KK)购自Pharmingen公司(San Diego，California)，R-PE偶联的山羊F(ab′)2抗人IgG购自Biosource International公司(Camarillo，California)。单克隆抗体169-4(抗CD8)来自R.Mittler博士(Emory University，Atlanta，Georgia)。GK1.5(抗CD4)是来自ATCC杂交细胞瘤产生的。兔抗asialo GM抗体购自Wako纯化试剂工厂(Richmond，Virginia)，纯化的兔IgG购自Sigma和Rockland公司(Gilbertsville，Pennsylvania)。
载体和K1735细胞的转染。描述了可变区克隆，scFv构建，和scFv表达产生的方法(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996；Hayden et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。本发明采用来自抗CD3杂交瘤500A2或者抗4-lBB杂交瘤1D8可变区的基因来获得细胞结合500A2 scFv或者1D8 scFv的细胞表面的表达(Hayden，Grosmaire etal..Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。为了表达scFv，使用了来自CD80的跨膜结构域和细胞质尾，因为其介导了细胞骨架的附着和细胞与细胞接触时的交联(Doty and dark，J Immunol，157，3270-9，1996；Doty andClark，J Immunol，161，2700-7，1998)。将scFv基因整合到pLNCX中，通过CaPO4沉淀方法转染RetroPackTMPT67包装细胞(ClontechLaboratories.Inc，Palo Alto，California)。使用来自这些细胞的培养基转染野生型K1735细胞。使用PE标记的羊抗人IgG对G418抗性克隆进行标记，用于scFv在细胞表面的表达。
动物研究。小鼠，5或10只/组，后背一侧皮下移植2×106个野生型K1735细胞或K1735-500A2细胞或经γ-射线照射的(12,000拉德)野生型K1735细胞。使用野生型K1735细胞(2×106细胞/小鼠)或Ag104(3×105细胞/小鼠)刺激免疫小鼠。通过应用测径器测量两个最大的垂直直径来评估肿瘤的大小，并报告平均肿瘤面积(mm2)±SD。将肿瘤皮下移植的部位的毛剃除，利于肿瘤的测量。
在第一项试验中，给小鼠在尾侧静脉静脉注射3×105野生型K1735细胞，以造成肺部转移灶(Kahn et al.，J Immunol，146，3235-3241，1991)。三天之后，在小鼠背部的一侧皮下移植K1735-1D8细胞，每周移植一次，共移植四次。移植野生型细胞37天之后，将小鼠处死。给小鼠气管内注射印第安墨水(以15％的浓度溶于磷酸盐缓冲液中)，将肺脏取出，未着色的转移灶在黑色的正常组织衬托下肉眼可见(Estin et al.，Proc Nati Acad Sci USA，85，1052-6，1988)。
CD4+和/或CD8+T淋巴细胞和自然杀伤细胞在体内的消耗。T细胞消耗如文中所述(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992)，给小鼠腹腔注射CD4单克隆抗体(GK1.5，小鼠IgG2b)或CD8(169-4，小鼠IgG 2a)或二者的混合成分3次，以0.5mg/小鼠连续注射3天。随后每3天使用每种单克隆抗体0.5mg，以维持这种消耗。通过每4天腹腔以30ul/只小鼠的剂量注射抗asialo GM1抗体维持NK细胞的消耗。在第12天，用FACS分析每组的脾细胞来证实消耗的效率。随后，给小鼠皮下移植肿瘤细胞。
增殖方法。将脾细胞在96孔平底培养板(1×105个细胞/孔)与5×105个自体的，经射线照射后的(3,000拉德)脾细胞(作为抗原递呈细胞)和肿瘤细胞共同培养。在孵育了72小时之后，将一式三份的培养物用1μCi3[H]标记的胸腺嘧啶脉冲16-18小时(AmershamPharmacia，Biotech Piscataway，New Jersey)，并测量摄入量。
为了研究哪些T细胞在体外增殖，按照生产商提供的方法(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，将脾细胞在2μM的CFDASB(5-(和-6)-羧基荧光素双乙酸琥珀酸脂)(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)中进行了孵育标记，在野生型K1735细胞存在和不存在的情况下培养了三天，并用FACS进行分析。
细胞毒性淋巴细胞活性检测方法。K1735-1D8移植后2-4周处死小鼠，并制备脾细胞悬浮液。按照规定，使用抗asialo GM1抗体加上兔补体(Cedarane，Ontario，Canada)去除NK细胞，在一个24孔培养板中(Costar Corp.，Cambridge，Massachusetts)将5×106个脾细胞与用1×105□-照射的(12,000拉德)野生型K1735细胞细胞培养5天。应用一种4小时51Cr释放方法，在不同的E/T比率检测细胞的活性。
ELISPOT方法。按照生产商提供的方法使用小鼠IFN-γELISPOT试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)，并通过平板扫描装置对平板进行计数(Cellular Technology Ltd.，Cleveland，Ohio)。
免疫组化。在注射肿瘤后10-30天将组织取出，用10％福尔马林固定，封闭，制作4-6μm的切片，并用Vector ABC试剂盒(加利福尼亚，柏林盖姆，Vector实验室)染色，再按照操作手册检测CD4+和CD8+的T细胞。这部分操作也可采用H-E染色。
通过需要CD4+T细胞和自然杀伤细胞参与的机制排斥K1735-1D8细胞。将细胞结合的抗4-1BB scFv克隆至逆转录载体pLNCX中(图15a)。将这个构建体转染至取自K1735的转移M2克隆的细胞(Fidlerand Hart，Cancer Res，41，3266-3267，1981)(被称为野生型K1735细胞)。被转染的细胞系，即K1735-1D8细胞，会在其表面表达高水平的抗4-1BB scFv(图15b)。
野生型K1735细胞在皮下(s.c.)移植给天然自体(C3H)小鼠后生长迅速。尽管用与上述皮下移植相同剂量的K1735-1D8细胞已经在开始时形成面积约为30mm2的肿瘤，但在皮下移植后第20天时，这些肿瘤消退并消失了(图15c)。用以同样方法构建的，编码抗人CD28scFv的对照载体转染野生型K1735细胞，转染后的细胞在C3H小鼠体内的生长速率与野生型K1735细胞相同。
为了研究CD4+和CD8+的T淋巴细胞以及自然杀伤细胞在K1735-1D8细胞消退过程中的作用，给天然小鼠腹腔内注射单克隆抗体以去除CD8+，CD4+，或CD4+和CD8+的T细胞，或腹腔内注射抗-asialo GM1兔抗体，以去除自然杀伤细胞。给对照组的小鼠注射大鼠IgG。12天之后，在对取自相同小鼠的脾细胞进行FACS分析显示大量靶细胞已经耗尽的时候，给每个组的小鼠均皮下移植K1735-1D8细胞。在被注射抗CD8单克隆抗体或对照大鼠IgG，去除了CD4+T细胞或/和CD8+T细胞的小鼠体内，K1735-1D8细胞的生长动力学是相同的，这使得K1735-1D8细胞的生长状况与野生型K1735细胞相同。细胞可以在所有自然杀伤细胞被耗尽的小鼠体内生长，尽管这种生长的速度比在CD4被耗尽的小鼠体内的速度要慢很多(图15d)。
用K1735-1D8细胞进行免疫，利用免疫的记忆性和特异性诱导针对野生型K1735细胞的免疫。将C3H小鼠分为每组10只，每隔10天皮下移植两次K1735-1D8细胞或经放射线照射的野生型K1735细胞；给对照组的小鼠皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS)。10天之后，给小鼠注射野生型细胞。经K1735-1D8细胞免疫、但没有接受经放射线照射的野生型K1735细胞免疫的小鼠抑制了野生型细胞(图16a)。单独用K1735-1D8细胞免疫足以保护机体对抗移植的野生型K1735细胞。
抑制野生型细胞两个月后，经免疫能够排斥K1735-1D8细胞的小鼠可以再次排斥被注射移植的野生型细胞(图16a)。与此形成对比的是，来自无抗原相关性的肉瘤Ag104细胞在“排斥型”小鼠体内与在天然对照体内生长的一样好(图16b)。
在经过两次对抗K1735-1D8的免疫，并在此后能够排斥被移植的野生型细胞的小鼠中，约有20％会在长于4个月的随诊期间出现皮肤退色(图16c)。没有其他自身免疫的体征。
K1735-1D8细胞作为一种治疗用疫苗是有效的。进行了三项给已经形成野生型K1735肿瘤的小鼠体内移植K1735-1D8细胞的试验。第一项是在已有表面积约为30mm2皮下肿瘤的小鼠体内做的试验。给其中一组在每四周的第一周时在背部、野生型肿瘤的对侧注射K1735-1D8细胞。给另一组移植经照射的野生型K1735细胞，给第三组皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有对照组的小鼠和所有用经照射的野生型K1735细胞免疫的小鼠体内均形成了野生型肿瘤，与此形成对比的是，在被免疫抗K1735-1D8细胞的小鼠中，五只小鼠中的四只小鼠体内的肿瘤消退了(图17a)，在三个月之后试验终止时，这四只小鼠仍没有肿瘤，也没有中毒的体征。第五只小鼠肿瘤结节的大小也减小了，只要该小鼠接受K1735-1D8细胞移植。
在第二项试验中，是在用野生型K1735细胞移植前1天或移植后的4或8天开始，给小鼠每周皮下注射K1735-1D8细胞。在相同的用药时机给其他组别的小鼠腹腔内注射1D8单克隆抗体用作比较。给对照组腹腔内注射磷酸盐缓冲液(PBS)。如表4中所显示的，必须在接受野生型细胞移植之后49天内处死所有对照组的小鼠，因为它们体内已经出现了≥100mm2的肿瘤。与此形成对比的是，在移植野生型细胞的前一天开始用K1735-1D8细胞接种或给予1D8单克隆抗体的小鼠，在移植野生型细胞之后70天试验结束时小鼠体内没有肿瘤。在用野生型细胞移植之后的第4或第8天开始，被免疫的抗K1735-1D8的小鼠，在进行观察的前28天期间没有可检测出来的肿瘤，但在不再注射疫苗之后，这10只小鼠中的4只出现了肿瘤。WT细胞形成肿瘤后8天注射单克隆抗体的小鼠发生肿瘤的时间比相应的K1735-1D8组小鼠要早，但两组小鼠的存活率没有区别。将移植野生型细胞后20天收获的肿瘤分成几个部分，并进行H&E染色和免疫组化评估。一个取自磷酸盐缓冲液(PBS)对照组小鼠的肿瘤结节包括有许多肿瘤细胞和少量的CD4+和CD8+的T淋巴细胞，并对接受单克隆抗体注射第8天的一只小鼠进行同样的分析。与此对应的是，在取自首次进行抗K1735-1D8免疫第8天小鼠的肿瘤结节中，含有大量的CD4+和CD8+的T淋巴细胞，而仅含有极少量的肿瘤细胞(图17b)。
第三项试验也是五只小鼠/组，在这项试验中我们给小鼠静脉注射3×105个野生型K1735细胞以形成肺部转移。三天之后，每周皮下移植K1735-1D8细胞，共持续一个月；给对照组的小鼠静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)。在有一只对照组小鼠死亡，或在接受野生型K1735细胞三十七天之后试验中止。在那时，每个对照组小鼠的肺脏均有超过500个转移灶，相比较之下，经免疫的小鼠肺脏中这样的转移灶少于10个(图17c)。
用K1735-1D8细胞免疫可诱发Th1型免疫应答。通过氚标记的胸腺嘧啶的摄取进行测定，取自经免疫抗K1735-1D8小鼠的脾细胞的增殖程度大约为取自天然小鼠的或经放射线照射的野生型K1735细胞免疫的小鼠的脾细胞的两倍(图18a)。取自用K1735-1D8免疫的小鼠的脾细胞在与经放射线照射的野生型K1735细胞共同培养之后会增加大约4倍，与Ag104细胞共同培养则不能。也可以对取自天然小鼠和经免疫抗K1735-1D8的小鼠的脾细胞进行增殖实验，脾细胞在与或不与经放射线照射的野生型K1735细胞共同孵育之前用CFDA SE(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)进行标记。取自K1735-1D8免疫小鼠的CD4+和CD8+脾细胞扩增迅猛(图18b)，最强烈的扩增出现在野生型K1735细胞中。取自天然小鼠的脾细胞不出现扩增。
来自经免疫抗K1735-1D8小鼠的脾细胞比来自天然小鼠成携带K1735-WT肿瘤(图19a)的小鼠的脾细胞，在ELISPOT分析中产生IFN r的要多。在表4的试验中，用脾细胞进行的ELISPOT分析证实了在移植野生型K1735之前一天或之后四天，用K1735-1D8免疫的小鼠是有反应活性的，当先与野生型K1735细胞共同培养3天时反应活性较高(图19b)。最强烈的反应活性出现在野生型细胞前一天免疫的组，这可能是由于肿瘤负荷较小的。来自用抗4-1BB单克隆抗体注射的小鼠或天然小鼠的脾细胞没有表现出反应活性。
将取自被免疫抗K1735-1D8的小鼠的脾细胞与经照射的野生型K1735细胞共同孵育5天，然后用4小时51Cr释放实验进行分析。没有先行去除自然杀伤细胞，K1735、Ag104和YAC细胞会以几乎相同的量被裂解(图19c)。然而，如果先将脾细胞与兔抗asialo GM1抗体加补体共同孵育去除自然杀伤细胞，那么与Ag104或YAC细胞相比，其会明显地表现出对抗野生型K1735细胞的细胞毒性淋巴细胞活性，尽管这种活性是较低的，这种活性还能被抗I类主要组织相容性抗原的单克隆抗体所抑制(图19d)。
在K1735-1D8细胞与野生型K1735细胞混合式时出现旁观者效应的证据。为了研究在体内表达抗4-1BB scFv的肿瘤细胞，例如作为一种体内转染的结果，是否会诱发一种免疫应答，这种应答也具有对抗野生型肿瘤细胞的效应，现已进行了两项将野生型K1735细胞与K1735-1D8细胞混合后进行研究的试验。第一项试验显示了在两种细胞等量混合之后，肿瘤在体内短暂生长之后便发生了消退。在第二项试验中，将2×106个野生型K1735细胞与2×105个K1735-1D8细胞相混合。如图20显示，与它们单独被移植时的情况相比，野生型细胞的生长被抑制了。
因此，源自抗-4-1BB杂交瘤1D8的，能够表达细胞结合scFv的K1735-1D8细胞会被自体小鼠排斥，CD4+T淋巴细胞，自然杀伤细胞，而非CD8+的T淋巴细胞都是排异所必需的。另外，抗K1735-1D8的免疫会诱发针对野生型K1735的具有免疫记忆和特异性的系统免疫反应。与此相反，反复用经放射线照射的野生型K1735细胞免疫的小鼠不会对野生型细胞的侵袭表现出保护作用。这与显示K1735在转染并表达CD80之后仍有着低免疫源性的数据是一致的。体外分析显示，被免疫小鼠的脾细胞能够对抗K1735-1D8细胞。给肿瘤携带小鼠接种疫苗不管是在肿瘤生长于皮下或肺中时都是具有疗效的。
所观察到的对抗野生型K1735这种低免疫源性的，I型主要组织相容性抗原表达量极低的肿瘤的治疗效果提示，将肿瘤细胞转染，使其表达抗4-1BB scFv，然后作为自体或同种异体疫苗使用可以破坏癌症病人在接受传统治疗后所剩余的微小转移灶。
人4-1BB特异性scFv来自杂交瘤5B9，加工过程与上面描述的G19-4，500A2和1D8 scFv的加工过程是一致的。图21显示了5B9 scFv序列与人IgG1铰链、CH2和CH3结构域以及人CD80的跨膜结构域和胞浆尾相融合。
***参考文献Allison，J.P.，C.Chambers，et al.(1998).“A role for CTLA-4-mediated inhibitorysignals in peripheral T cell tolerance？”Novartis Found Symp21592-8.
Beatty，P.G.，J.A.Ledbetter，et al.(1983).“Definition of a common leukocyte cell-surface antigen(Lp95-150)associated with diverse cell-mediated immune functions.”J Immunol131(6)2913-8.
Bennett，M.W.，J.O′Connell，et al.(1998).“The Fas counterattack in vivoapoptoticdepletion of tumor-infiltrating lymphocytes associated with Fas ligand expression by humanesophageal carcinoma.”J Immunol160(11)5669-75.
Boise，L.H.，A.J.Minn，et al.(1995).“CD28 costimulation can promote T cell survivalby enhancing the expression of Bcl-XL.”Immunity3(1)87-98.
Boon，T.，P.G.Coulie，et al.(1997).“Tumor antigens recognized by T cells.”ImmunolToday18(6)267-8.
Cassian，Y.，P.A.Savage，et al.(1999).“Isolation of high avidity melanoma-reactiveCTL from heterogeneous populations using peptide-MHC tetramers.”J.Immunol.162(2227-2234).
Chappell，D.B.and N.P.Restifo(1998).“T cell-tumor cella fatal interaction？”CancerImmunol lmmunother47(2)65-71.
Cheever，M.A.，M.L.Disis，et al.(1995).“Immunity to oncogenic proteins.”ImmunolRev14533-59.
Chen，L.，S.Ashe，et al.(1992).“Costimulation of antitumor immunity by the B7counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4.”Cell71(7)1093-102.
Chen，L.，P.McGowan，et al.(1994).“Tumor immunogenicity determines the effect ofB7 costmulation on T cell-mediated tumor immunity.”J Exp Med179523-532.
Chen，W.，W.Jin，et al.(1998).“Engagement ofcytotoxic T lymphocyte-associatedantigen 4(CTLA-4)induces transforming growth factor beta (TGF-beta)production by murineCD4(+)T cells.”J Exp Med188(10)1849-57.
Daniel，P.T.，A.Kroidl，et al.(1997).“Costimulatory signals through B7.1/CD28 preventT cell apoptosis during target cell lysis.”J Immunol159(8)3808-15.
DeBenedette，M.A.，N.R.Chu，et al.(1995).“Role of 4-1BB ligand in costimulation ofT lymphocyte growth and its upregulation on M12 B lymphomas by cAMP.”J Exp Med181(3)985-92.
den Haan，J.M.M.，S.M.Lehar，et al.(2000).“CD8+but not CD8-dendritic cells cross-prime cytotoxic T cells in vivo.”J.Exp.Med.1921685-1695.
D′Orazio，T.J.and J.Y.Niederkom (1998).“A novel role for TGF-beta and IL-10 in theinduction of immune privilege.”J Immunol160(5)2089-98.
Doty，R.T.and E.A.Clark (1996).“Subcellular localization of CD80 receptors isdependent on an intact cytoplasmic tail and is required for CD28-dependent T cellcostimulation.”J Immunol157(8)3270-9.
Doty，R.T.and E.A.Clark (1998).“Two regions in the CD80 cytoplasmic tail regulateCD80 redistribution and T cell costimulation.”J Immunol161(6)2700-7.
Ellenhorn，J.D.，R.Hirsch，et al.(1988).“In vivo administration of anti-CD3 preventsmalignant progressor tumor grovth，”Science242(4878)569-71.
Espevik，T.and J.Nissen-Meyer (1986).“A highly sensitive cell line，WEHI 164 clone13，for measuring cytotoxic factor/tumor necrosis factor from human monocytes.”J ImmunolMethods95(1)99-105.
Estin，C D.，U.S.Stevenson，et al.(1988).“Recombinant vaccinia virus vaccine againstthe human melanoma antigen p97 for use in immunotherapy.”Proc Natl Acad Sci U S A85(4)1052-6.
Fidler，I.J.and I.R.Hart (1981).“Biological and experimental consequences of the zonalcomposition of solid tumors.”Cancer Res413266-3267.
Finn，O.J.，K.R.Jerome，et al.(1995).“MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunityand cancer vaccines.”Immunol Rev14561-89.
Fiorentino，D.F.，M.W.Bond，et al.(1989).“Two types of mouse T helper cell.IV.Th2clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones.”J Exp Med170(6)2081-95.
Garlie，N.K.，A.V.LeFever，et al.(1999).“T cells coactivated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 as potential immunotherapy for cancer.”J Immunother22(4)336-45.
Gilliland，L.K.，N.A.Norris，et al.(1996).“Rapid and reliable cloning of antibodyvariable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments.”TissueAntigens47(1)1-20.
Greenberg，P.D.(1991).“Adoptive T cell therapy of turmorsmechanisms operative inthe recognition and elimination of tumor cells.”Adv Immunol49281-355.
Hahne，M.，D.Rimoldi，et al.(1996).“Melanoma cell expression of Fas (Apo-1/CD95)ligandimplications for tumor immune escape.”Science2741363-1366.
Hayden，M.S.，L.S.Grosmaire，et al.(1996).“Costimulation by CD28 sFv expressed onthe tumor cell surface or as a soluble bispecific molecule targeted to the L6 carcinoma antigen.”Tissue Antigens48(4 Pt1)242-54.
Hayden，M.S.，P.S.Linsley，et al.(1994).“Single-chain mono-and bispecific antibodyderivatives with novel biological properties and antitumour activity from a COS cell transientexpression system.”Ther Immunol1(1)3-15.
Hellstrom，I.，K.E.Hellstrom，et al.(1969).“Studies on immunity to autochthonousmouse tumors.”Transplant Proc1(1)90-4.
Hellstrom，K.E，and I.Hellstrom (1969).“Cellular immunity against tumor specificantigens.”Adv Cancer Res12167-223.
Hellstrom，K.E.and I.Hellstrom (1974).“Lymphocyte-mediated cytotoxicity andblocking serum activity to tumor antigens.”Adv Immunol18209-77.
Hellstrom，K.E.and I.Hellstrom (1999).Cancer Vaccines，Handbook of ExperimentalPharmacology.P.Perlmann and H.Wigzell.Heidelberg，Springer.Vaccines (Chapter 17)463-478.
Hu，H.M.，W.J.Urba，et al.(1998).“Gene-modified tumor vaccine with therapeuticpotential shifts tumor-specific T cell response from a type 2 to a type 1 cytokine profile.”JImmunol161(6).3033-41.
Huang，A.Y，P.Golumbek，et al.(1994).“Role of bone marrow-derived cells inpresenting MHC class I-restricted tumor antigens.”Science264(5161)961-5.
Hurtado，J.C.，Y.J.Kim，et al.(1997).“Signals through 4-1BB are costimulatory topreviously activated splenic T cells and inhibit activation-induced cell death.”J Immunol158(6)2600-9June，C H.，J.A.Ledbetter，et al.(1990).“Role of the CD28 receptor in T-cellactvation.”Immunol Today11(6)211-6.
Kahn，M.，H.Sugawara，et al.(1991).“CD4+T cell clones specific for the human p97melanoma-associated antigen can eradicate pulmonary metastases from a murine tumorexpressing the p97 antigen.”J Immunol146(9)3235-3241.
Kehrl，J.H.，L.M.Wakefield，et al.(1986).“Production of transforming growth factorbeta by human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth.”J ExpMed163(5)1037-50.
Kerr，W.G.and J.J.Mule′(1994).“Gene therapycurrent status and future prospects.”J.Leuko.Biol.56210-214.
Kiessling，R.，K.Kono，et al.(1996).“Immunosuppression inhuman tumor-hostinteractionrole of cytokines and alterations in signal-transducing molecules.”Springer Semin.Immunopathol.18227-242.
Kiessling，R.，K.Wasserman，et al.(1999).“Tumor-induced immune dysfunction.”Cancer Immunol.lmmunother.48353-362.
Kim，Y.J.，S.H.Kim，et al.(1998).“Human 4-1BB regulates CD28 co-stimulation topromote Thl cell responses.”Eur J Immunol28(3)881-90.
Klein，G.，H.O.Sjgren，et al.(1960).“Demonstration of resistance againstmethylcholanthrene-induced sarcomas in the primary autochthonous host.”Cancer Res201561-1572.
Krummel，M.F.and J.P.Allison (1996).“CTLA-4 engagement inhibits IL-2accumulation and cell cycle progression upon activation of resting T cells.”J Exp Med183(6)2533-40.
Kugler，A.，G.Stuhler，et al.(2000).“Regression of human metastatic renal cellcarcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids.”Nature Medicine6332-.
Kume，T.，K.Oshima，et al.(1999).“Relationship between Fas-ligand expression oncarcinoma cell and cytotoxic T-lymphocyte response in lymphoepithelioma-like cancer of thestomach.”Int J Cancer84(4)339-43.
Leach，D.R.，M.F.Krummel，et al.(1996).“Enhancement of antitumor immunity byCTLA-4 blockade.”Science271(5256)1734-6.
Ledbetter，J.A.，C.H.June，et al.(1986).“Valency of CD3binding and intemalization ofthe CD3 cell-surface complex control T cell responses to second signalsDistinction betweeneffects on protein kinase C，cyplasmic free calcium，and proliferation.”J.Immunol.1363945-3952.
Ledbetter，J.A.，G.Shu，et al.(1987).“Augmentation of normal and malignant B cellproliferation by monoclonal antibody to the B cell-specific antigen BP50(CDW40).”J Immunol138(3)788-94.
Levine，B.L.，W.B.Bemstein，et al.(1997).“Effects of CD28 costimulation on long-term proliferation of CD4+T cells in the absence of exogenous feeder cells.”J Immunol159(12)5921-30.
Linsley，P.S.and J.A.Ledbetter (1993).“The role of the CD28 receptor during T cellresponses to antigen.”Annu Rev Immunol11191-212.
Loh，E.Y.，J.F.Elliott，et al.(1989).“Polymerase chain reaction with single-sidedspecificityanalysis of T cell receptor delta chain.”Science243(4888)217-20.
Maeurer，M.J.，S.M.Gollin，et al.(1996).“Tumor escape from immune recognitionlethal recurrent melanoma in a patient associated with downregulation of the peptide transporterprotein TAP-1 and loss of expression of the immunodominant MART-1/Melan-A antigen.”JClin Invest98(7)1633-41.
Martin，P.J.，J.A.Ledbetter，et al.(1986).“A 44 kilodalton cell surface homodimerregulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes.”J Immunol136(9)3282-7.
Matter，B.，C.F.Zukoski，et al.(1970).“Transplanted carcinoma in animmunosuppressed patient.”Transplantation9(1)71-4.
Melero，I.，N.Bach，et al.(1998).“Amplification of tumorimmunity by gene transfer ofthe co-stimulatory 4-1BB ligandsynergy with the CD28 co-stimulatory pathway.”Eur JImmunol28(3)1116-21.
Melero，I.，J.V.Johnston，et al.(1998).“NK1.1 cells express 4-1BB(CDw137)costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonalantibodies”Cell Immunol190(2)167-72.
Melero，I.，W.W.Shuford，et al.(1997).“Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors.”Nat Med3(6)682-5.
Melief，C.J.and W.M.Kast (1995).“T-cell immunotherapy of tumors by adoptivetransfer of cytotoxic T lymphocytes and by vaccination with minimal essential epitopes.”Immunol Rev145167-77.
Miller，A.D.and G.J.Rosman (1989).“Improved retroviral vectors for gene transfer andexpression.”Blotechniques7(9)980-2，984-6，989-90.
Mizoguchi，H.，J.J.O′Shea，et al.(1992).“Alterations in signal transduction molecules inT lymphocytes from tumor-bearing mice[see comments].”Science258(5089)1795-8.
Mule′，J.，F.R.Jones，et al.(1979).“Selective localization of radiolabelled immunelymphocytes into syngeneic tumors.”J.Immunol.123600-606.
Nakagomi，H.，M.Petersson，et al.(1993).“Decreased expression of the signal-transducing z chains in tumor-infiltrating T cells and NK cells of patients with colorectalcarcinoma.”Cancer Res535610-5612.
Natoli，G.，A.Costanzo，et al.(1998).“Apoptotic，non-apoptotic，and anti-apoptoticpathways of tumor necrosis factor signalling.”Biochem Pharmacol56(8)915-20.
Nestle，F.O.，S.Alijagic，et al.(1998).“Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendritic cells [see comments].”Nat Med4(3)328-32.
Old，L.J.and Y.-T.Chen (1998).“New paths in human cancer serology.”J.Exp.Med.1871163-1167.
Pardoll，D.M.(1996).“Cancer vaccinesa road map for the next decade.”Curr OpinImmunol8(5)619-21Ranga，U.，C.Woffendin，et al.(1998).“Enhanced T cell engraftment after retroviraldelivery of an antiviral gene in HIV-infected individuals.”Proc.Natl.Acad.Sci.951201-1206.
Rodolfo，M.，C.Zilocchi，et al.(1999).“IL-4-transduced tumor cell vaccine inducesimmunoregulatory type 2 CD8T lymphocytes that cure lung metastases upon adoptive transfer.”JImmunol163(4)1923-8.
Rosenberg，S.A.(1995).Cell transfer therapyclinical applications.Biologic Therapy ofCancer(Chapter 19).V.T.DeVita，S.Hellman and S.A.Rosenberg.Philadelphia，PA，J.P.Lippincott487.
Rosenberg，S.A.，J.C.Yang，et al.(1998).“Immunologic and therapeutic evaluation of asynthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma[seecomments].”Nat Med4(3)321-7.
Schoenberger，S.P.，L.E.Jonges，et al.(1998).“Efficient direct priming of tumor-specific cytotoxic T lymphocyte in vivo by an engineered APC.”Cancer Res58(14)3094-100.
Schwartz，R.H.(1989).“Acquisition of immunologic self-tolerance.”Cell57(7)1073-81.
Shiraki，K.，N.Tsuji，et al.(1997).“Expression of Fas ligand in liver metastases ofhuman colonic adenocarcinomas.”Proc Natl Acad Sci USA94(12)6420-5.
Shuford，W.W.，K.Klussman，et al.(1997).“4-1BB costimulatory signals preferentiallyinduce CD8+T cell proliferation and lead to the amplification in vivo of cytotoxic T cellresponses.”J Exp Med186(1)47-55.
Sulitzeanu，D.(1993).“Immunosuppressive factors in human cancer.”Adv Cancer Res60247-267.
Takahashi，C.，R.S.Mittler，et al.(1999).“Cutting edge4-1BB is a bona fide CD8 T cellsurvival signal.”J Immunol162(9)5037-40.
Thompson，C.B.，T.Lindsten，et al.(1989).“CD28 activation pathway regulates theproduction of multiple T-cell-derived lymphokines/cytokines.”Proc Natl Acad Sci U S A86(4)1333-7.
Tsushima，H.，Y.Imaizumi，et al.(1999).“Fas antigen (CD95)in pure erythroid cell lineAS-E2 is induced by interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha and potentiates apoptoticdeath.”Exp Hematol27(3)433-40.
Walunas，T.L.，C.Y.Bakker，et al.(1996).“CTLA-4 ligation blocks CD28-dependent Tcell activation.”J Exp Med183(6)2541-50.
Walunas，T.L.，D.J.Lenschow，et al.(1994).“CTLA-4can function as a negativeregulator of T cell activation.”Immunity1(5)405-13.
Ward，P.I.，H.Koeppen，et al.(1989).“Tumor antigens defined by clonedimmunological probes are highly polymorphic and are not detected on autologous normal cells.”J.Exp.Med.170(217-232).
Wilbanks，G.A.，M.Mammolenti，et al.(1992).“Studies on the induction of anteriorchamber-associated immune deviation (ACAID).III.Induction of ACAID depends uponintraocular transforming growth factor-beta.”Eur J Immunol22(1)165-73.
Wilson，R.E.，E.B.Hager，et al.(1968).“Immunologic rejection of human cancertransplanted with a renal allograft.”N Engl J Med278(9)479-83.
Winberg，G.，L.S.Grosmaire，et al.(1996).“Surface expression of CD28 single chain Fvfor costimulation by tumor cells.”Immunol Rev153(209).
Yang，G.，K.E.Hellstrm，et al.(1995).“Antitumor immunity elicited by tumor cellstransfected with B7-2，a second ligand for CD28/CTLA-4 costimulatory molecules.”J Immunol154(6)2794-800.
Yang，G.，M.T.Mizuno，et al.(1997).“B7-negative versus B7-positive P815 tumordifferential requirements for priming of an antitumor immune response in lymph nodes.”JImmunol158(2)851-8.
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此处引用和提及的所有专利，出版物，科技文章，网站和其他参考文献和资料，都是本发明所属领域技术人员水平的体现，均各自完整引用作为参考。申请者保留将任意或所有来自任何这项专利，出版物，科技文章，网页，可用的电子信息，和其他参考材料或文献的全部添加到这份专利说明书的权利。
此处所描述的特异方法和组合物代表优选的实施方案，是示例性的，其目的不在于对本发明的范围进行限制。在本发明的基础上联想到的其他方面和实施方案也包含在本发明的权利要求书所限定的范围内。对于本领域技术人员，在不背离本发明的范围和主旨的前提下，对其做各种替代和修正，是非常显而易见的。在此作为例证说明的这项发明，如果缺乏任何组成部分或者多个组成部分，限度或多个限度，在此未作特意说明时，仍然可以实施。因此，在本说明的任何情况中，例如本发明的实施例或实施方案中，任何术语“包含”，“基本由…组成”，“包括”和“由…组成”都可以被说明书中任何另外两个术语替代。同时，“包含”，“包括”，“含有”等等术语可以延展含义并不受限制。在此描述说明的方法和步骤以不同的步骤顺序呈现时仍然成立，并不限于此处或权利要求中指定的步骤顺序。在任何情况下，都不可将本专利限定在实施例和实施方案公开的范围内。本专利绝不可以解释为受任何检查者或任何其他的官方以及专利和商标办公室职员制订的报告书的限制，除非这种报告书是特殊的，并未加限制或申请者书面反应明确采用保留。
采用的术语和表达是用来解释说明的术语，并不是对本发明的限制，并没有通过使用这样的术语和表达法来排除任何同义表达此处显示特征和描述或某一部分的意图，但是应该意识到各种变化可能在本发明要求保护的范围之内。因此，可以理解，尽管现在的发明通过优选的实施方案和可选择的特征公开，但是本领域技术人员可以对此作出变化和调整，这种修饰和变化在本发明从属权利要求定义的范围中。
本发明在此进行了广泛地、一般性的描述。落入一般公开范围的更窄的种类和亚属也构成本发明的一部分。一般性公布中的每个限定种类和亚一般性分组也构成了本发明的部分。这包括对发明的一般性描述，附带限制性条款或否定限制是去除任何物质，而不考虑去除的材料是否在此进行了特别描述。
其他的实施方案都包括在下列权利要求当中。另外，本发明的特点或方面以马库什(Markush)基团的方式描述，本领域技术人员应该意识到本发明也可通过马库什基团的成员或成员亚组的方式进行描述。
序列表<110>LEDBETTER，JEFFREYHAYDEN-LEDBETTER，MARTHAHELLSTROM，INGEGERDHELLSTROM，KARL ERIK<120>识别CD3或4-1BB的抗体或基因介导的肿瘤反应性淋巴细胞活化<130>034474.0004<140>10/107,991<141>2002-04-26<150>60/286,585<151>2001-04-26<160>5<170>专利版本2.1<210>1<211>1687<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人杂交基因<220>
<221>CDS<222>(7)(1671)<220>
<221>信号肽<222>(7)(75)<223>编码两侧连接有Hind III和SalI酶切位点的L6 Vκ前导肽<220>
<221>V_区<222>(76)(406)<223>编码Gl9-4小鼠抗人CD3 VL结构域<220>
<221>misc_特征<222>(406).(451)<223>编码(Gly4Ser)3接头<220>
<221>V_区<222>(451).(816)<223>G19-4小鼠抗人CD3 VH结构域<220>
<221>misc_特征<222>(816)(1521)<223>编码人IgG1 Fc结构域(铰链区，CH2，CH3)
<220>
<221>misc_特征<222>(1521)..(1687)<223>编码人CD80跨膜和细胞质结构域和连接的限制性酶切位点<400>1aagctt atg gat ttt caa gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt 48Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser1 5 10gct tca gtc ata atg tcc aga gga gtc gac atc cag atg aca cag act96Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr15 20 25 30aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc144Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys35 40 45agg gca agt cag gac att cgc aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa192Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys50 55 60cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc tac tac aca tca aga tta cac240Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His65 70 75tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat288Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr80 85 90tct ctc acc att gcc aac ctg caa cca gaa gat att gcc act tac ttt336Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe95 100 105 110tgc caa cag ggt aat acg ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aaa384Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125ctg gta acc aaa cgg gag ctc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg432Leu Val Thr Lys Arg Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly130 135 140tcg ggt ggc ggc gga tct atc gat gag gtc cag ctg caa cag tct gga480Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly145 150 155cct gaa ctg gtg aag cct gga gct tca atg tcc tgc aag gcc tct ggt528Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly160 165 170tac tca ttc act ggc tac atc gtg aac tgg ctg aag cag agc cat gga576Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly175 180 185 190
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ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat1296Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr415 420 425 430ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac1344Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn435 440 445aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc1392Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe450 455 460ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac1440Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn465 470 475gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg1488Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr480 485 490cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa gcg gat cct tcg aac ctg1536Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu495 500 505 510ctc cca tcc tgg gcc att acc tta atc tca gta aat gga att ttt gtg1584Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val515 520 525ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt gcc cca aga tgc aga gag aga agg1632Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg530 535 540agg aat gag aga ttg aga agg gaa agt gta cgc cct gta taaatcgata 1681Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555ctcgag 1687<210>2<211>1696<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人杂交基因<220>
<221>CDS<222>(13)..(1680)<220>
<221>信号肽<222>(13)..(71)<223>编码5B9小鼠抗人4-1BB VL前导肽序列
<220>
<221>V_区<222>(72)..(412)<223>编码5B9小鼠抗人4-1BB VL结构域<220>
<221>misc_特征<222>(413)..(459)<223>编码(Gly4Ser)3接头多肽<220>
<221>V_区<222>(460)..(826)<223>编码5B9小鼠抗人4-1BB VII结构域<220>
<221>misc_特征<222>(827)..(1527)<223>编码人IgG1 Fc结构域(铰链区，CH2，CH3)<220>
<221>misc_特征<222>(1528)..(1696)<223>编码带有限制性位点的人CD80跨膜和细胞质结构域<400>2aagcttgccg cc atg agg ttc tct gct cag ctt ctg ggg ctg ctt gtg ctc 51Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu1 5 10tgg atc cct gga tcc act gca gat att gtg atg acg cag gct gca ttc99Trp Ile Pro Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe15 20 25tcc aat cca gtc act ctt gga aca tca gct tcc atc tcc tgc agg tct147Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser30 35 40 45agt aag agt ctc cta cat agt aat ggc atc act tat ttg tat tgg tat195Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr50 55 60ctg cag aag cca ggc cag tct cct cag ctc ctg att tat cag atg tcc243Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser65 70 75aac ctt gcc tca gga gtc cca gac agg ttc agt agc agt ggg tca gga291Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly80 85 90act gat ttc aca ctg aga atc agc aga gtg gag gct gag gat gtg ggt339Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly95 100 105gtt tat tac tgt gct caa aat cta gaa ctt ccg ctc acg ttc ggt gct387Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala110 115 120 125
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cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc1107Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr350 355 360 365gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1155Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val370 375 380tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc1203Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala385 390 395aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg1251Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg400 405 410gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc1299Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly415 420 425ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg1347Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro430 435 440 445gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc1395Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser450 455 460ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag1443Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln465 470 475ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac1491Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His480 485 490tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa gcg gat cct tcg1539Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser495 500 505aac ctg ctc cca tcc tgg gcc att acc tta atc tca gta aat gga att1587Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile510 515 520 525ttt gtg ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt gcc cca aga tgc aga gag1635Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu530 535 540aga agg agg aat gag aga ttg aga agg gaa agt gta cgc cct gta1680Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555taaatcgata ctcgag 1696<210>3<211>555
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人融合蛋白<220>
<221>信号<222>(1)..(23)<223>L6 Vκ信号肽<220>
<221>结构域<222>(24)..(133)<223>G19-4小鼠抗人CD3轻链可变区<220>
<221>多肽<222>(134)..(148)<223>(Gly4Scr)3接头多肽<220>
<221>结构域<222>(149)..(270)<223>G19-4小鼠抗人VH结构域<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(271)..(504)<223>人IgG1 Fc结构域(铰链区，CH2，CH3)<220>
<221>跨膜<222>(505)..(555)<223>人CD80跨膜结构域和细胞质尾<400>3Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser20 25 30Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala35 40 45Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp50 55 60Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly65 70 75 80Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu85 90 95Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln100 105 110
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val115 120 125Thr Lys Arg Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Ile Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu145 150 155 160Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser165 170 175Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Asn180 185 190Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr195 200 205Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser210 215 220Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala225 230 235 240Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr245 250 255Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Asp Leu260 265 270Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala275 280 285Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro290 295 300Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val305 310 315 320Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val325 330 335Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln340 345 350Tyr Asn Ser Tnr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln355 360 365Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala370 375 380Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro385 390 395 400Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser420 425 430Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr435 440 445Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr450 455 460Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe465 470 475 480Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys485 490 495Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu Leu Pro500 505 510Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys515 520 525Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn530 535 540Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555<210>4<211>556<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人融合蛋白<220>
<221>信号<222>(1)..(20)<223>5B9小鼠抗人4-1BB Vκ信号肽<220>
<221>结构域<222>(21)..(133)<223>5B9小鼠抗人4-1BB VL结构域<220>
<221>多肽<222>(134)..(149)<223>(Gly4Ser)3接头多肽<220>
<221>结构域<222>(150)..(271)<223>5B9小鼠抗人4-1BB VH结构域<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(272)..(505)<223>人IgG1 Fc结构域(铰链区.CH2，CH3)<220>
<221>跨膜<222>(506)..(555)<223>人CD80跨膜和细胞质结构域<400>4Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro20 25 30Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser35 40 45Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys50 55 60Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Sei Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu145 150 155 160Val Gln Ser Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe165 170 175Ser Leu Thr Thr Tyr Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys180 185 190Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ile Thr Asp Tyr195 200 205Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asp Ser Lys210 215 220Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala225 230 235 240Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Gly Asp Asn Tyr Pro Tyr Tyr Tyr245 250 255
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp260 265 270Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro275 280 285Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys290 295 300Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val305 310 315 320Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr325 330 335Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu340 345 350Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His355 360 365Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys370 375 380Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln385 390 395 400Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu405 410 415Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro420 425 430Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn435 440 445Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu450 455 460Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val465 470 475 480Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln485 490 495Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu Leu500 505 510Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile515 520 525Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg530 535 540Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555
<210>5<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；引物<400>5cgtcgatgag ctctagaatt cgcatgtgca agtccgatga gtcccccccc ccccc5权利要求
1.产生肿瘤反应性T淋巴细胞的培养体系，其包括来自癌症患者的T细胞、抗原递呈细胞、自体或同种异体的肿瘤细胞和诱导多克隆活化的T细胞受体的固相化抗体。
2.权利要求1的培养体系，其中所述抗原递呈细胞是自体的单核细胞，其对所述T细胞产生应答而分化。
3.权利要求1的培养体系，其中所述自体的或同种异体的肿瘤细胞被转染来表达至少一种基因，所述基因编码刺激直接或间接T细胞应答的分子。
4.权利要求1的培养体系，其中所述固相化抗体与CD3和CD28受体相结合。
5.一种组合物，其包括编码能在细胞表面表达的抗-CD3scFv的多核苷酸。
6.权利要求5的组合物，其中所述多核苷酸编码G19-4scFv。
7.一种组合物，其包括编码能在细胞表面表达的抗人4-1BB scFv的多核苷酸。
8.权利要求7的组合物，其中所述多核苷酸编码5B9 scFv。
9.一种组合物，其包括由编码能在细胞表面表达的抗CD3 scFv的基因所转染的自体或同种异体肿瘤细胞。
10.权利要求9的组合物，其中所述的自体或同种异体肿瘤细胞被G19-4 scFv转染，所述G19-4 scFv能在细胞表面表达。
11.一种组合物，其包括由编码能在细胞表面表达的抗4-1BBscFv的基因所转染的自体或同种异体肿瘤细胞。
12.权利要求11的组合物，其中所述自体或同种异体肿瘤细胞被5B9 scFv转染，所述5B9 scFv能在细胞表面表达。
13.治疗癌症患者的方法，其包括给患者施用肿瘤细胞，所述肿瘤细胞被转染能在细胞表面表达抗-CD3 scFv。
14.权利要求13的方法，其中所述肿瘤细胞表达G19-4。
15.治疗癌症患者的方法，其包括给患者施用肿瘤细胞，所述肿瘤细胞被转染能在细胞表面表达抗-4-1BB scFv。
16.权利要求15的方法，其中所述肿瘤细胞表达5B9。
17.治疗癌症患者的方法，其包括给患者施用质粒，所述质粒包含能在细胞表面表达抗-CD3 scFv的序列。
18.权利要求17的方法，其中所述质粒编码G19-4 scFv。
19.治疗癌症患者的方法，其包括给患者施用质粒，所述质粒包含能在细胞表面表达抗4-1BB的序列。
20.权利要求19的方法，其中所述质粒编码5B7 scFv。
21.一种分离的多核苷酸，其包括编码能在细胞表面表达抗-CD3 scFv的序列。
22.一种分离的多核苷酸，其包括编码能在细胞表面表达G19-4scFv的序列。
23.一种分离的多核苷酸，其包括编码能在细胞表面表达抗-4-1BB的序列。
24.一种分离的多核苷酸，其包括编码能在细胞表面表达5B9scFv的序列。
全文摘要
本发明提供了一种体外产生肿瘤反应性T淋巴细胞的改良方法，其包括，例如，将来自癌症患者的PBMC与自体肿瘤细胞和磁珠共同培养，所述磁珠能通过CD3与CD28、CD40或CD28加CD40的组合来活化T细胞。本发明还提供了编码抗－CD3或抗－41BB scFv的基因以及转染正常或过度增殖细胞以在其表面表达所述基因的方法。基因和转染的肿瘤细胞是有用的诱导肿瘤破坏性免疫应答的组合物。
文档编号C12N15/86GK1894413SQ03812095
公开日2007年1月10日 申请日期2003年3月26日 优先权日2003年3月26日
发明者J·A·莱德贝特, I·赫尔斯特伦, M·海登-莱德贝特, K·E·赫尔斯特伦 申请人:特鲁比昂药品公司