专利名称：抗β2GPI基因工程Fab抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体，尤其是一种抗(32GPI的Fab抗体，属于生物制品领域。技术背景抗磷脂抗体综合征(Antiphospholipid Syndromes, APS)是一组与抗磷脂抗 体(APA)有关，具有多系统多脏器损害的特点，并以动静脉血栓形成和反复自 发流产为突出表现的疾病。APA是一类针对各种负电荷磷脂-蛋白复合物的自身 抗体或同种抗体，包括免疫球蛋白G、 M、 A或几种同时存在，APA通过其识 别的抗原特异性不同，与各种磷脂-蛋白复合物结合，干扰各种依赖磷脂的凝血 和抗凝因子发挥作用。APS基本病理改变为血管内血栓形成，各级动静脉血管 血栓可引起相应症状，胎盘小血管APS血栓可引起流产。APS分类有以下几种(1)根据病因的不同分为原发性与继发性APS，临 床上原因不明的血栓与习惯性流产并伴APA持续阳性者，均诊断为原发性APS， 继发性APS原因有自身免疫性疾病、肿瘤、感染、炎症等。自身免疫性疾病为 主要原因，其中系统性红斑狼疮(SLE)最为常见。SLE患者抗(32糖蛋白-I(P2GPI) 抗体阳性率高达65%。据统计，SLE患者血栓和习惯性流产的发生率分别为10% 和20% 40%，若伴有LA或APA的患者发病率大大提髙约为50%和96%。 (2) 根据抗体可分为伴LA持续阳性的狼疮抗凝因子血栓综合征(LA-T综合征)，伴 抗心磷脂抗体(ACA)阳性的抗心磷脂抗体血栓综合征(ACA-T综合征)及LA 与ACA同时阳性的混合性APL-T综合征。(3)据临床症状分V型I型主要以 深静脉血栓为主，包括上下肢末端静脉、肝静脉、门静脉、肾静脉血栓和肺梗塞。n型主要以动脉血栓为主，包括冠状动脉、外周动脉等。m型主要包括视 网膜和脑血管血栓。IV型由以上3型混合组成。v型主要由胎盘血栓引起胎儿 流产，又称胎儿流产综合征。APS综合征的诊断标准为(1)临床指标:①静脉血栓形成；②动脉血栓形 成；③习惯性流产；④血小板减少。(2)实验室指标:①中-高滴度的IgG和IgM 抗心磷脂抗体阳性；②狼疮抗凝物阳性。至少一项实验室指标加一项临床指标 即可诊断。其中抗P2糖蛋白-I (p2GPI)抗体是主要的血清标志性抗体，目前作 为一种实验室检测指标在其诊断方面具有很高的敏感性和特异性。《抗P2GPI抗体与抗磷脂抗体综合征的相关性研究》来源于《中国免疫学 杂志》，1999年第5期第15巻，作者曹文华，杨翰仪。该文章通过一系列实 验验证了抗p2GPI与抗磷脂抗体综合征之间的紧密关系，但是并没有由此继续 做深入的剖析，通过该相关性来达到防治抗磷脂抗体综合征的目的。 发明内容本发明的目的在于提供一种抗P2GPI的Fab抗体，所述抗体具有较强的 (32GPI结合活性和抗原特异性的能力。发明人经过广泛的研究，提供了一种用抗体库技术制备针对(32GPI的基因 工程Fab抗体，利用其只有单价的特点以及不具有Fc段因而不能激活补体的特 性，使其封闭自身抗原表位，竞争性抑制病理性自身抗体的结合，从而阻断二 聚体复合物的形成和后续的补体活化等免疫炎症过程，终止其免疫损伤从而实 现APS反复自发流产的特异性预防与治疗。卩2GPI是一种血浆蛋白，它与带负电的分子(磷脂等)结合，从而抑制了由 磷脂催化的凝血反应。在ELISA检测中P2GPI明显增强抗磷脂抗体与心脂结合 能力，这可能是抗心脂抗体(APL)直接与卩2GPI结合形成磷脂-卩2GPI复合物，中的磷脂暴露出了新的抗原决定簇而出现。APS主要的 病理性自身抗体是抗P2GPI自身抗体，而本发明中的Fab抗体能有效抑制抗 P2GPI自身抗体的结合，对该抗体活性进行的研究显示，该Fab抗体具有较强的 (32GPI结合性和抗原特异性。该自身抗体通过其二价的F(ab)2，与2个(32GPI结 合，形成抗体-抗原二价复合物后可以使(32GPI与膜磷脂结合的亲和力上升达100 倍，这种抗132GPI-(32GPI 二价复合物与膜磷脂的高亲和力结合可以激发一系列 的下游分子事件，包括l、激活补体，抗体与相应抗原结合后，借助暴露的补体 结合点去激活补体系统、激发补体的溶菌、溶细胞等免疫作用，介导滋养层表 面和血管的炎症反应；2、启动信号转导通路，诱导滋养层和内皮细胞、白细胞、 血小板等细胞膜表达与粘附和血栓形成相关的表型；3、干扰破坏内皮细胞的抗 凝机制。这些下游分子事件最终导致胚胎受损发生胎儿死亡或流产。本发明是利用抗体库技术制备抗(32GPI基因工程Fab抗体，该抗体只有一 个抗原结合位点，不会象完整二价抗体那样与两个抗原分子结合形成二价二聚 体复合物，Fab抗体不具有Fc段，也不具备固定并激活补体的活性，所以用使 其封闭(32GPI分子主要抗原表位，能有效抑制抗(32GPI自身抗体的结合，从而 阻断自身抗体一抗原二价二聚体复合物的形成及其对补体的激活作用和后续免 疫损伤，实现APS反复自发流产的特异性预防与治疗。本发明的有益效果1 、 本发明能有效治疗抗磷脂抗体综合征引起的流产。2、 本发明简单，对实验室条件要求不高，有利于实现和推广。3、 所需费用低，实现周期短，临床应用价值高。
图1 一个抗p2GPI自身抗体与两个f32GPI分子结合形成二价二聚体复合物的过程。图2噬菌体抗体与不同抗原反应的ELISA鉴定 图3筛选所获噬菌体抗体的基因指纹分析 图4可溶性Fab的纯化(A)与SDS-PAGE鉴定(B) 图5可溶性Fab抗体与不同抗原反应的ELISA鉴定具体实施方式
试验l利用噬菌体抗体库制备人源性抗P2糖蛋白-I抗体 1材料和方法1. 1.材料人源性天然抗体库为先前构建，系从未经免疫的健康志愿者分 离淋巴细胞，扩增多样性IgG、 IgM基因并克隆到噬菌体抗体Fab段表达载体所 建成，库容1X109，有效重组率80%。 P2糖尿白-1 (P2GPI)系根据文献介 绍的方法由本室制备。所用各种内切酶均为Promega产品，AMV逆转录酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自GibcoBRL;丑co//XL1-Blue和辅助噬菌体 VCSM13为实验室常规保存。1. 2.方法1. 2. 1.抗P2GPI噬菌体抗体的筛选取-70 'C冻存的抗体库质粒电转化 五.co// XL1-Blue对抗体库进行扩增，在含有100 pg/ml氨苄青霉素(Amp)的SB培 养液中扩大培养后以辅助噬菌体VCSM13诱导表达噬菌体抗体。表达上清中加 聚乙二醇(PEG) 8000到4%， NaCl到3。/。，冰浴30 min后离心，将沉淀溶于 1% BSA-PBS中存4 "C备筛选用。抗体库的筛选采用固相化抗原免疫吸附筛选 法问。将3 2GPI以50pg/ml的浓度包被抗原管(Immunotube, Nunc)，经3%牛血 清白蛋白(BSA)封闭后加抗体库上清(约1X1012噬菌体)，室温孵育2h;用含0.05% Tween-20的PBS液和PBS溶液各洗10次(第2轮之后各洗20次)，然 后以0.1M三乙胺(TEA， Sigma)lml洗脱；洗脱液立即加入0.5ml 1M的Tris-HCl (pH7.4)中和，移入离心管中感染半对数期生长的五.co//XL1-Blue。取适量感染 后菌液稀释后铺LB-Amp琼脂平板测定洗脱液滴度，其余菌液扩大培养后以 VCSM13超感染并振荡培养过夜，次日收上清浓縮即为次级噬菌体抗体库，用 来进行下一轮的筛选。滴定次级抗体库的滴度并计算每一轮筛选噬菌体投入/产 出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标。1. 2. 2阳性克隆的挑选从第四轮筛选生长菌落的琼脂平板上随机挑取 30个单集落在含有Amp的SB液体培养基中培养，用辅助噬菌体VCSM13超感 染诱导表达噬菌体抗体。收获表达上清，以e2GPI为抗原进行ELISA反应，显 色阳性的克隆再以人角蛋白、胃蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)等抗原同时包被 ELISA板，鉴定其抗原抗体反应的特异性，所用二抗为HRP-抗M13(Amersham Biosciences) 01. 2. 3.抗体免疫球蛋白类型鉴定与DNA指纹分析噬菌体抗体表达载 体(p3MH)和IgM CHI内各含有一个五coi I酶切位点，而IgG CHI无此位点， 因此可用五co及I酶切的方法鉴定所获特异性抗体的免疫球蛋白类型。噬菌体抗 体质粒经酶切、电泳释放出约1.5kb条带者为IgM，否则为IgG。用DNA指纹分析区分所获抗体来自相同或不同的克隆。以阳性克隆的质粒 DNA为模板，用弓l物5，-GAMATYGAGCTCACSCAGTCTCCA-3，搭配 5'-GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGA-3'进行PCR扩增抗体基因(k链+重链 Fd段)。扩增产物经纯化后以万WiVI酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA指纹 分析。1. 2. 4.可溶性Fab的表达、纯化与鉴定将筛选获得的抗3 2GPI噬菌体抗体质粒DNA以A^el酶解切除基因m，载体自连后电转化五.co/z'XLl-Blue感 受态细胞，铺LB-Amp琼脂平板培养过夜，次日挑取单集落在SB中培养，加 IPTG(异丙基硫代-P -D-半乳糖苷，Promega)至lmM诱导培养过夜后收细菌上清 即含可溶性Fab抗体。Fab抗体的纯化用镍螯合亲和层析法进行。HisTrap FF柱(GE Healthcare) 按使用说明依次进行平衡、上样、洗涤、洗脱，收集洗脱液测定蛋白浓度，对 PBS充分透析后用Amicon浓縮离心管(Millipore)浓縮获得Fab产物。纯化的Fab 抗体经SDS-PAGE鉴定，进行ELISA实验用P 2GPI抗原及无关抗原检测所获 Fab的结合活性及其特异性，所用二抗为HRP-抗人K轻链单克隆抗体(Bethyl Laboratories, Inc.)。2结果2.1. 抗P2GPI噬菌体抗体的筛选经过4轮筛选，噬菌体抗体回收率得到 约120倍富集。从最后一轮挑取的30个单菌落制备噬菌体抗体，用ELISA方法 进行检测发现其中有6个噬菌体抗体能与P 2GPI特异性结合，图2为一个代表 性克隆与不同抗原反应的ELISA结果。2.2. 抗体克隆及免疫球蛋白类型鉴定6个特异阳性的噬菌体抗体其抗体基 因经PCR扩增，仏^VI酶切得到2种不同的酶切图形，说明分别属于2个不同 的Fab基因克隆，其中l、 2属于同一个克隆命名为B2A1， 3 6则属于另一个 克隆命名为B2A2(见图3)。经五coiU酶切鉴定，所获得的2个抗体克隆均属于 IgG。2.3. 可溶性Fab的表达、纯化与鉴定将2个阳性克隆质粒切除噬菌体基因 III， IPTG诱导后进行ELISA检测，结果均表达出了人Fab段。镍螯合亲和层析 纯化可见单一的蛋白洗脱峰(图4A)， SDS-PAGE分别显示约23kDa和46kDa的还原型和非还原型Fab段(图4B)。在与不同抗原的ELISA反应中，Fab抗 体(2pg/ml)与P2GPI特异性结合，见附图5。 试验2试验方法发明人制作了抗磷脂抗体综合征的自发流产小鼠模型，取20只成年、健康 雌性妊娠鼠，将APS患者血清IgG自身抗体注射到妊娠小鼠，最终导致16只妊 娠鼠流产，从而成功复制了 APS自发流产动物模型。但是在其它条件相同的基 础上，如果用酶切的方法去除自身抗体的Fc段，所得到的Fab片段虽然仍具有 结合P2GPI的活性但却不具备诱发流产的致病作用。取20只成年、健康雌性妊 娠鼠，将Fab片段注射到小鼠体内，观察2周，无妊娠鼠流产。结论IgG自身抗体的Fab片段具有结合P2GPI的活性，不具备诱发流产的致病 作用。
权利要求
1、抗β2GPI基因工程Fab抗体，其特征在于抑制病理性自身抗体的结合，阻断二聚体复合物的形成，阻断后续补体活化免疫炎症过程。
2、 根据权利要求1所述的抗P2GPI基因工程Fab抗体，其特征在于Fab 抗体蛋白的基因为人源性抗P2GPI抗体基因，核苷酸序列和由此产生的氨基酸序 列用于表达抗P2GPI、中和性抗体或多肽产物。
3、 根据权利要求l所述的抗(32GPI基因工程Fab抗体，其特征在于特异 性识别(32GPI并与之结合，阻断P2GPI与抗(32GPI自身抗体相结合。
全文摘要
本发明涉及一种抗β2GPI基因工程Fab抗体，它是由张秀茹专家经过大量研究发现的，该抗体的特性有1.只有单价，2.不具有Fc段因而不能激活补体，这两种特性能使其封闭自身抗原表位，竞争性抑制病理性自身抗体的结合，从而阻断抗β2GPI自身抗体与两个β2GPI分子结合形成二价二聚体复合物的形成和后续的补体活化等免疫炎症过程，终止其免疫损伤从而实现APS反复自发流产的特异性预防与治疗。该发明对抗磷脂抗体综合征的治疗有深远意义。
文档编号A61P15/06GK101235089SQ20081010132
公开日2008年8月6日 申请日期2008年3月4日 优先权日2008年3月4日
发明者张秀茹 申请人:张秀茹