迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗及其制备方法

专利名称：迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，主要涉及防治鱼类细菌性疾病的生物制剂，具体讲就是一种迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗及其制备方法。

背景技术：
海水养殖鱼和虾均爆发过细菌性流行性疾病，其病原体分别为弧菌类(鳗弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河弧菌、副溶血弧菌)及迟缓爱德华菌。其中迟缓爱德华菌感染有暴发性发作的特点，其原发感染或引起的继发感染，对人和鱼类的致病性均较严重。在鱼类常见的疾病中，迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是淡、海水养殖鱼类的一种最主要病原菌。该菌为革兰氏染色阴性，周生鞭毛运动短杆菌，菌体大小0.5-3.0μm，具运动性，兼性厌氧，没有荚膜，不形成芽孢，不抗栓，能在15～42℃生长，迟缓爱德华菌含有长度为5.3Kb的溶血素基因，其表达产物为一种热不稳定的铁结合蛋白，具有很强的致病性，该菌能侵入上皮细胞，在入侵几分钟之内可逃避胞内吞噬泡溶酶体，并在胞质内大量复制，复制几次后溶解宿主细胞膜，使细胞膜褶皱核膜消散，胞体溶解。对人体感染的主要症状为细菌性肠胃炎，或因伤口感染引起蜂窝组织炎，伤至粘膜引起气性坏疽、肝疾病、慢性胆管炎、关节炎、坏死性筋膜炎、卵巢脓肿等多种疾病。并易于和嗜水气单胞菌等发生混合感染或继发感染。鱼类感染该菌后主要发生肝脏和肾脏的病变，即俗称″肝肾病″。发病症状为活力下降，腹部膨胀，摄食减少或废绝。随病情发展，病鱼肝区或肾区肿胀隆起，而腹部具一凹线，经剖检，肝脏肿大色深，有点状出血；严重者肝脏形成点状或蜂巢状溃疡灶，且引起与病灶相贴的腹膜炎，并逐步溃烂以至腹壁破溃穿孔(肝脏型)。肾脏的病损过程与肝脏相同，重则肾区肌肉、皮肤溃烂穿孔，挤压可流出脓血液体(肾脏型)。肝、肾的这种病损可单独或同时发生。伴有鳍条充、出血和肠炎，肛门充血红肿而突出，鱼皮出血性溃疡。
迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是肠杆菌科爱德华菌属中唯一对人有致病性的细菌，可导致人体发生胃肠炎、败血症、肝脓肿、脑膜炎、伤口感染等，临床表现为腹泻、水样便、伴呕吐、腹痛、低热等。是一种条件致病菌，在自然条件下广泛存在。
目前国内对鱼类该菌的治疗仍然是使用各类抗生素，如在饵料中添加适量的土霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、呋喃唑酮和磺胺类药物等，但抗生素等易产生耐药性和药物残留等。欧、美等国有报道将弧菌、气单胞菌、迟缓爱德华菌等制成了灭活疫苗，并从中提取出脂多糖、胞外蛋白等有效抗原，制备出单克隆抗体疫苗，且已商品化生产。但是灭活疫苗的抗原性较弱，而减毒疫苗的安全性不稳定，不能达到防治疾病的目的，所以对迟缓爱德华菌抗独特型抗体的研究对于水产养殖业具有积极的意义和经济意义。
因此，本发明的研究是在生物工程领域进行更加深入且针对性的探讨，对于人类的健康和保护也具有重要的意义。
经本发明项目组在因特网搜索和对国内外专利文献和公开发表的期刊论文检索，未发现与本发明相关的同样报道或文献。
同时委托陕西省科学技术信息研究所就本发明主题在中、外文献库进行检索，也未见与本发明完全相同的文献报道。


发明内容
本发明的目的是提供一种抗体分子小、免疫原性低；组织穿透力强、易于进入血液循环，到达靶细胞；在非靶向组织中滞留时间短、血液清除快；无Fc段，不易与同具有Fc受体的非靶细胞结合并具有较高的抗原亲和力、使用方便、有效、可行、可大规模生产的迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗。
下面对本发明进行说明 本发明是一种迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于利用迟缓爱德华菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株克隆出重链VH和轻链VL可变区基因，用(Gly4Ser)3组成的连接肽linker连接VH和VL，体外构建VL-Linker-VH形式的单链抗体scFv基因，将迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在大肠杆菌中获得表达，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体，纯化和体外复性过程，获得了高纯度的单链抗体片段，重组蛋白的相对分子量为27kD，ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力，作为迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其基因序列和氨基酸序列如下
鉴于对于人鱼共患病的致病菌迟缓爱德华菌目前尚无根本性的无副作用的有效防治和治疗的药物，本发明从基因工程的领域进行研究。
本发明项目组在前期研究工作中，已成功制备出迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株1E11，是一种可分泌具有抗原“内影像”、高保护率的抗独特型抗体。并申请了中国国家发明专利，在国内外相关的学术期刊上发表了研究成果的论文。关于迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株1E11的报道参见金晓航，黄威权，夏永娟，等.抗迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体的制备与鉴定J.水生生物学报，2005，29(3)340-343。
本发明项目组长期从事海洋鱼类病诊断、检测、治疗及免疫工程方面的专项研究，已成功研制了海鱼细菌病多联免疫检测药盒、海鱼细菌病多联单克隆抗体治疗制剂、海鱼细菌病多联抗独特型抗体疫苗，以上三种生物制品均获得了国家发明专利。
本发明应用分子免疫学和基因工程技术，从分泌抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E11中，扩增出该抗体的轻、重链可变区基因，通过基因重组，体外成功构建单链抗体基因scFv(VL-linker-VH)，将其克隆至表达载体PET28a并在大肠杆菌中表达，表达产物经纯化及复性后进行鉴定。制备出迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗。具有较高的抗原亲和力、使用方便、有效等优点。对于养殖业而言，一旦发生疫情，一方面很难有效控制，另一方面，如前所述，存在使用抗生素等易产生耐药性和药物残留，对人类的健康带来潜在的危害等问题，本发明从重组抗体领域进行针对性防疫，从根本上有效地解决问题。
利用细胞工程生产的单克隆抗体，要经过大量培养分泌抗体的杂交瘤细胞来获取，成本较高，并存在着多次传代后抗体易丢失的缺点。本发明利用前期的研究成果即迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)进行基因重组，构建单链抗体基因。
作为scFv基因的引物序列是本发明的基础和重要组成部分，由一条亲水性连接肽相连，从而形成与天然抗体中抗原结合位点相似的结构。scFv是由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(linker)连接而成的重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的六分子一，因此它具有分子小，免疫原性低；组织穿透力强、易于进入血液循环，到达靶细胞；在非靶向组织中滞留时间短、血液清除快；无Fc段，不易与同具有Fc受体的非靶细胞结合，易于基因工程操作和通过包涵体大量表达等优点。
实现权利要求1所述迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法，具体的步骤如下 一.应用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株中克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因； 二.在重链(VH)和轻链(VL)可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3，体外构建单链抗体基因； 三.将其克隆至原核表达载体pET28a，构建原核表达质粒pET28a—scFv。筛选阳性克隆，将鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21中进行诱导表达挑取转化的单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220r/min，37℃培养过夜，次日以1∶100转接，在220r/min，37℃条件下振荡培养至A600nm＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，10℃～15℃低温诱导表达4小时后收菌。将原核表达产物12000rpm，4℃离心15min，弃上清，用裂解液(50mmol Tris-HCl，0.5mmol EDTA，5mmol DTT，5％甘油，PH8.0)悬浮沉淀，加溶菌酶至100ug/mL，30℃水浴30min，置冰上超声破碎菌体50次(2秒/次，间隔2秒)。12000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入复性液(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.1mol脲，1％甘油，PH8.0)至20mg/mL，在4℃条件下，每隔2h加一次，共分三次加入，4℃条件下10～12h，待液体清透后装入处理过的透析袋进行透析，每隔6h更换一次透析液，第一次用透析液1(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.05mol脲，1％甘油，PH8.0)，第二次用透析液2(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.01mol脲，1％甘油，PH8.0)，第三次的透析液为去离子水，三次后收集菌体加入50％甘油—70℃冻存。
五.结果迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21菌中获得表达，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体，纯化和体外复性过程，获得了高纯度的单链抗体片段，获得重组蛋白的相对分子量为27kD的迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗。ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。
由于本发明应用基因工程重组抗体技术，克隆迟缓爱德华菌抗独特型抗体的轻、重链可变区基因，以(Gly4Ser)3组成的连接肽(linker)连接抗体的轻、重链可变区基因VL和VH，构建迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体(scFv)基因，将单链抗体(scFv)基因在原核中高效表达，获得高表达、高活性的原核与真核表达细胞株。并探讨了行之有效的制备方法，提供了一种抗体分子小、免疫原性低；组织穿透力强、易于进入血液循环，到达靶细胞；在非靶向组织中滞留时间短、血液清除快；无Fc段，不易与同具有Fc受体的非靶细胞结合并具有较高的抗原亲和力、使用方便、有效、可行、可大规模生产的、环保的迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗，研制出新型、高效的防治鱼类细菌性疾病的生物制剂，解决了目前尚无对人类会有传染的迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗的问题。本发明可以用于海鱼的迟缓爱德华菌的独特型抗体基因工程疫苗防治，也可用于所有海洋生物的迟缓爱德华菌的独特型抗体基因工程疫苗防治，为水产养殖业的防病抗病开辟一条新的有效途径。从根本上解决了养殖业的迟缓爱德华菌防疫难题，由于鱼是人类常用食物之一，也从源头上起到了保证人体健康的作用。



说明书附图是本发明的基因序列和氨基酸序列图。

具体实施例方式 下面结合实施例对本发明进行详细说明 实施例1 本发明在前期研究中，已成功制备出迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株1E11，为可分泌具有抗原“内影像”、高保护率的抗独特型抗体。为了构建迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其实施方法为 1.迟缓爱德华菌抗独特型单克隆杂交瘤细胞的复苏 将分泌迟缓爱德华菌抗独特型的单克隆杂交瘤细胞株1E11从冻存的液氮罐中取出，立即置37℃水浴中快速融化，加入37℃预热的RPMI-1640无血清培养液10mL，1000rpm，离心10min，弃上清；加入20％含小牛血清的RPMI-1640培养液5mL，1000rpm，离心10min，弃上清；沉淀加入10mL含30％小牛血清的RPMI-1640培养液，用枪头轻轻吹打沉淀，使杂交瘤细胞悬垂后转入培养瓶，再向培养瓶加入含30％小牛血清的RPMI-1640培养液至50mL，置5％CO2、37℃孵箱培养，次日换液，待细胞呈对数生长期。
2.细胞总RNA的提取 a.收获对数生长期的分泌迟缓爱德华菌抗独特型的单克隆杂交瘤细胞株1E11，细胞计数后，以1×107个细胞加入1mL Trizol的比例加入2.8mL Trizol，用吸管吹打几次，混合，15—30℃孵育10min。
b.以1mL Trizol加入0.2mL氯仿的比例加入0.56mL的氯仿，盖紧离心管盖子，用力震荡15s，待充分混匀后，室温静置5min。
c.12000rpm，15min，4℃离心。取上层清液至另一新的1.5mL离心管中。
d.以1mLTrizol加入0.5mL异丙醇的比例，加入1.4mL的异丙醇，混合，室温静置10min。
e.12000rpm，10min，4℃离心，弃上清，加入1.5mL 75％的乙醇(用DEPC处理过的水配置)，漩涡振荡混合样品。
f.12000rpm，15min，4℃离心，弃上清，室温干燥10min。加入11uL DEPC水溶解。
g.加入11uL DEPC水，65℃，10min溶解。取2uL稀释后，紫外分光光度计定量，RNA样品直接使用或—70℃冻存备用。
3.细胞反转录合成第一链cDNA 用Invitrogen公司的反转录试剂盒，过程如下 a.取11uL约5ug的mRNA在65℃，10min保温，冰上放置1min冷却。
b.加入以下组分 1uL 0.5ug/mL OligodT；1uL 10mM dNTP；2uL 10×RTbuffer；4uL 25mM MgCl；2uL 0.1MDTT；1uL RNase out。混匀。
c.42℃，5min后加入50U的反转录酶Superscript II到离心管中，混匀，42℃，水浴50min。
d.72℃，15min终止反应，至于冰上冷却。
e.加入1uL RNase H，37℃，反应20min，除去未反应的RNA。将反转录的cDNA直接使用或—20℃保存备用。
4.迟缓爱德华菌抗独特型mAb VH基因和VL基因的扩增和纯化 a.VH基因和VL基因的扩增 引物设计 根据GenBank库，设计并合成抗体轻、重链可变区基因5’端信号肽，及3’端恒定区的通用引物 VHback5’-ATGAAATGCAGCTGGGGCAT(C，G)TTCTTC-3’ VHfor5’-CAAGGGATAGACAGATGGGGC-3’ VLback5’-ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGG(C，G)GTTG-3’ VLfor5’-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’ 以合成的cDNA为模板，PCR扩增VH和VL基因，反应条件如下 在25uL反应体系中，加入cDNA2uL，Back和For引物各2uL，2×Pfu PCRMasterMix 12.5uL，ddH2O补至25uL进行PCR反应。
VH基因扩增的反应参数为于94℃变性5min后，94℃、1min，50℃、1min，72℃、1min，共25次循环后，于72℃再延伸10min。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
VL基因扩增的反应参数为94℃变性5min后，94℃、1min，52℃、1min，72℃，1min，共25个循环，最后72℃，10min。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
b.基因工程单链抗体scFv的构建及序列测定 引物设计 以重叠延伸拼接法(gene splicing by overlap extension，SOE)，用(Gly4Ser)3组成的连接肽(linker)连接VH和VL，构建VL-Linker-VH形式的单链抗体scFv基因。引物序列如下 VLback5’-GTGCAGAATTCGTCTTGACCCAAACT-3’ VLfor5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3’ VHback5’-GGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGAGGTTCAGCTGCAG-3’ VHfor5’-GCAGAAGCTTGCGGCCGCTTATGAGGAGACTGTGAG-3’ 将PCR扩增的VH和VL基因片段经电泳分离纯化后，以等量(各3uL，约1ug)混合，加入10×Taq Buffer 5uL、dNTP4uL和1～2个单位的Taq聚合酶，加ddH2O补至50uL进行PCR反应。
反应参数为于94℃变性5min后，94℃、1min，58℃、1min，72℃、1min，7次循环后，在反应管中加入scFv基因5’端引物和3’端引物各1uL，再加入于1个单位的Taq聚合酶进行30个循环的扩增，即可得到完整的单链抗体scFv基因基因片段。参见说明书附图。
5.重组单链抗体的原核表达载体的构建 将重组单链抗体scFv的PCR回收产物与原核表达载体pET28a用同一对酶EcoRI和Hind III双酶切，反应体系组成如下 10×M Buffer2uL EcoRI 1uL Hind III1uL pET28a Vector 8uL ddH2O 8uL 10×M Buffer2uL EcoRI 1uL Hind III1uL scFv8uL ddH2O 8uL 37℃反应4小时后，将酶切产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化。
将酶切回收产物按以下体系进行连接反应 scFv10uL pET28a Vector 1.5uL 10×Ligase Buffer 2.5uL T4 DNA连接酶1uL ddH2O补足到25uL。
将连接混合物于16℃连接12h后转化E.coli DH5a感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆后，小量提取质粒并以PCR和酶切鉴定筛选，筛选后的质粒命名为pET28a—scFv。
6.重组单链抗体的原核诱导表达 将鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21中进行诱导表达挑取转化的单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220r/min，37℃培养过夜，次日以1∶100转接，在220r/min，37℃条件下振荡培养至A600nm＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，10℃～15℃低温诱导表达4小时后收菌。
7.重组单链抗体原核表达产物的纯化 a.原核表达产物12000rpm，4℃离心15min； b.弃上清，沉淀用生理盐水或PBS洗涤一次； c.用裂解液(50mmol Tris-HCl，0.5mmol EDTA，5mmol DTT，5％甘油，PH8.0)悬浮沉淀，加溶菌酶至100ug/mL，30℃水浴30min； d.置冰上超声破碎菌体50次(2秒/次，间隔2秒)； e.12000rpm，4℃离心10min；弃上清(可保留部分上清用于SDS-PAGE)； f.沉淀用生理盐水或PBS洗涤两次，称重后得到粗提包涵体于—70℃冻存或用于复性。
8.重组单链抗体原核表达产物的复性 a.加入复性液(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.1mol脲，1％甘油，PH8.0)至20mg/mL，在4℃条件下，每隔2h加一次，共分三次加入，4℃条件下10～12h； b.待液体清透后装入处理过的透析袋进行透析，每隔6h更换一次透析液，第一次用透析液1(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.05mol脲，1％甘油，PH8.0)，第二次用透析液2(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.01mol脲，1％甘油，PH8.0)，第三次的透析液为去离子水，三次后收集菌体加入50％甘油—70℃冻存或PEG浓缩纯化。
9.单链抗体表达产物的SDS-PAGE和Western blotting分析 纯化表达产物用PEG浓缩纯化后取10uL加等量的2×SDS蛋白上样缓冲液，在沸水中煮10min，12000rpm离心5min后，取10uL上清进行SDS-PAGE蛋白电泳。电泳完毕后取下凝胶用考马斯亮蓝染色1h，用脱色液脱色1～3h观察是否有目的蛋白。同样的SDS-PAGE电泳凝胶经电转移2.5h，把目的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(NC膜)，将NC膜用0.5％的脱脂奶粉于37℃封闭1h，PBST洗涤3次，加入1200鼠抗迟缓爱德华菌单克隆抗体，37℃，1h；PBST洗涤3次，加入150的HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；DAB-H2O2底物显色。
10.单链抗体表达产物亲和活性的ELISA检测 纯化的单链抗体scFv以110，1100，11000，110000梯度稀释后包被酶标板，4℃孵育过夜；弃包被液，PBS(pH7.4)洗涤3次，加入兔抗迟缓爱德华菌多克隆抗体(11000稀释)，37℃孵育1h；PBS洗涤后加入HRP-羊抗兔IgG，37℃孵育1h；PBS快速洗涤5次后OPD显色，酶联检测仪上测410nm的OD值。
11.实施例1结果 本发明实施例得到的抗体重链可变区VH基因全长339bp，编码113个氨基酸，序列中无终止密码子，为一开放读框；具有4个FR，3个CDR区和维持抗体V区空间结构所必需的2个特征性的半胱氨酸，分别位于第22位和第96位，为V-D-J重排，符合小鼠IgG VH基因特征。同源性分析表明，我们所得到的VH基因与GenBank中序列号为M13832.1(Identities 96％)和U88672.1(Identities 93％)序列相似性较高，它们均为小鼠重链可变区基因。确定扩增的VL基因为具有V-J重排，符合小鼠IgG VL基因特征的正确轻链可变区序列，基因全长336bp，编码112个氨基酸，序列中无终止密码子，为一开放读框；具有4个FR，3个CDR区和维持抗体V区空间结构所必需的2个特征性的半胱氨酸，分别位于第23位和第93位，且分别位于FR1区和FR3区。序列相似性最高的两个基因U60463.1和L22331.1均为Vκ可变区基因，经检索GenBank，轻、重链可变区基因均未见相同序列，为两个新基因。在此基础上，构建了VL-Linker-VH形式的单链抗体scFv基因，并分别克隆到原核表达载体pET28a中，在原核表达菌株BL21大肠杆菌表达。表达、鉴定结果SDS-PAGE结果显示，pET28a—scFv在接近相对分子量31KD处有一条特异性条带。Westernblotting结果显示pET28a—scFv能与抗原结合，具有较强的亲和力，从以上实验中，筛选出了高表达、高免疫活性的迟缓爱德华菌抗独特性单链抗体scFv，并检测了其表达蛋白的抗原特异性和免疫原性，结果表明重组融合蛋白表达的SDS-PAGE和Western blotting分析显示，在31kD处有一特异性蛋白条带，而在表达载体pET28a上单链抗体基因scFv的N端有His.Tag/T7.Tag融合标签，表达融合蛋白前体分子量为4kD，则剩余蛋白分子量为27kD，此蛋白分子量与期望值一致。说明该诱导蛋白为目的蛋白。融合蛋白特异结合活性ELISA检测结果显示，表达scFv融合蛋白能与抗原特异性结合，与对照相比，具有统计学意义(P<0.01)。
实施例2 材料和方法 1菌株、质粒及主要试剂质粒PET28a及菌株E.coli BL21(DE3)为美国Novagen公司产品。RPMI1640为GibcoBRL公司产品，RNA抽提试剂购自Takara公司，RT-PCR试剂盒为美国invitrogen公司产品.质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自北京博大泰克公司。PCR试剂，连接试剂均购自北京天为时代公司。
裂解液50mmol Tris-HCl，0.5mmol EDTA，5mmol DTT，5％甘油，PH8.0。
复性液25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.1mol脲，1％甘油，PH8.0。
梯度透析液1.25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.05mol脲，1％甘油，PH8.0。
2.25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.01mol脲，1％甘油，PH8.0。
2.迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法 基因的获取、表达、鉴定等其他情况与条件均同实施例1 迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法，具体的步骤如下 一.采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株中克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因； 二.在重链(VH)和轻链(VL)可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3，体外构建单链抗体基因； 三.将其克隆至原核表达载体pET28a，构建原核表达质粒pET28a—scFv。筛选阳性克隆，将鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达挑取转化的单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220r/min，37℃培养过夜，次日以1∶100转接，在220r/min，37℃条件下振荡培养至A600nm＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，10℃～15℃低温诱导表达4小时后收菌。将原核表达产物12000rpm，4℃离心15min，弃上清，用裂解液(50mmol Tris-HCl，0.5mmolEDTA，5mmol DTT，5％甘油，PH8.0)悬浮沉淀，加溶菌酶至100ug/mL，30℃水浴30min，置冰上超声破碎菌体50次(2秒/次，间隔2秒)。12000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入复性液(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.1mol脲，1％甘油，PH8.0)至20mg/mL，在4℃条件下，每隔2h加一次，共分三次加入，4℃条件下10～12h，待液体清透后装入处理过的透析袋进行透析，每隔6h更换一次透析液，第一次用透析液1(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.05mol脲，1％甘油，PH8.0)，第二次用透析液2(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.01mol脲，1％甘油，PH8.0)，第三次的透析液为去离子水，三次后收集菌体加入50％甘油—70℃冻存。
实施例3 迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗的免疫保护作用 1.试验用鱼美国红鱼，又名红姑鱼，属鲈形目、石首鱼科。Sciaenops ocellatus(Linnaeus))，总共200尾用于实验，分注射组和对照组2组，每组100尾。
2.方法 迟缓爱德华菌抗独特型抗体和弗氏不完全佐剂11混合，腹腔注射免疫美国红鱼，每尾注射0.1mL(含抗体10—20μg)，免疫一个月后，用5倍半致死量的迟缓爱德华病菌腹腔注射攻击美国红鱼，观察抗独特型抗体基因工程疫苗对美国红鱼的保护作用。
每组随机取10尾鱼，分别用5倍半致死量的菌对各组鱼进行攻毒，计算疫苗对海鱼的保护率，观察死亡之数。
3.相对保护率(Relative percent survival，RPS)的计算公式 相对保护率(RPS)＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％ 4.结果
同样条件分别进行三次实验，迟缓爱德华病菌抗独特型抗体基因工程疫苗对美国红鱼的免疫保护率分别为80％、82.5％和81.2％。本发明的实验免疫保护率平均为80％以上，免疫鱼血清ELISA实验抗体效价达到10-4。提供了一种有效的基因工程抗体疫苗。
序列表
权利要求
1.一种迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于利用迟缓爱德华菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因，用(Gly4Ser)3组成的连接肽(linker)连接VH和VL，构建VL-Linker-VH形式的单链抗体scFv基因，在大肠杆菌中表达，获得迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其基因序列和氨基酸序列如下
2.一种迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于构建单链抗体scFv基因的引物序列为
VLback5’-GTGCAGAATTCGTCTTGACCCAAACT-3’
VLfor5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTTATTTCCAG
CTTGGTCCC-3’
VHback5’-GGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGAGGTTCAGCT
GCAG-3’
VHfor5’-GCAGAAGCTTGCGGCCGCTTATGAGGAGACTGTGAG-3’
3.实现权利要求1所述迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法，其特征在于具体的步骤如下
一.应用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株中克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因；
二.在重链(VH)和轻链(VL)可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3，体外构建单链抗体基因；
三.将其克隆至原核表达载体pET28a，构建原核表达质粒pET28a—scFv，筛选阳性克隆，将鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21中进行诱导表达挑取转化的单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220r/min，37℃培养过夜，次日以1∶100转接，在220r/min，37℃条件下振荡培养至A600nm＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，10C～15℃低温诱导表达4小时后收菌，将原核表达产物12000rpm，4℃离心15min，弃上清，用裂解液(50mmol Tris-HCl，0.5mmolEDTA，5mmol DTT，5％甘油，PH8.0)悬浮沉淀，加溶菌酶至100ug/mL，30℃水浴30min，置冰上超声破碎菌体50次(2秒/次，间隔2秒)。12000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入复性液(25mmol Tris-HCl，10mmolNaCl，0.1mol脲，1％甘油，PH8.0)至20mg/mL，在4℃条件下，每隔2h加一次，共分三次加入，4℃条件下10～12h，待液体清透后装入处理过的透析袋进行透析，每隔6h更换一次透析液，第一次用透析液1(25mmol Tris-HCl，10mmol NaCl，0.05mol脲，1％甘油，PH8.0)，第二次用透析液2(25mmol Tris-HCl，10mmol NaCl，0.01mol脲，1％甘油，PH8.0)，第三次的透析液为去离子水，三次后收集菌体加入50％甘油—70℃冻存或PEG浓缩纯化。
全文摘要
本发明提供了一种迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗及其制备方法，采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株中克隆出VH和VL可变区基因，在VH和VL可变区基因间引入连接肽(Gly4Ser)3，体外构建VL-Linker-VH形式的单链抗体scFv基因，克隆至表达载体PET28a并在大肠杆菌中表达，表达产物纯后，用SDS-PAGE、Western blot及ELASA鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21菌中获得表达，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经溶解包涵体，纯化和体外复性，获得高纯度的单链抗体片段，重组蛋白相对分子量为27kD。海鱼免疫保护率平均为80％以上。
文档编号A61K39/395GK101455839SQ20081015112
公开日2009年6月17日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者红 秦, 黄威权, 金晓航, 刘玉林, 欣 张, 刘子冬 申请人:中国人民解放军第四军医大学