专利名称：人源性重组抗角蛋白基因工程抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗银屑病的生物药品及其制备方法。该生物药品中包括利用分子生物学手段制备的人源性重组抗角蛋白基因工程抗体(human anti-keratin genetic engineering antibody)。
背景技术：
银屑病是一种疑难病症，该病主要病理改变是表皮角质形成细胞过度增生，炎症细胞浸润，并有大量炎性细胞因子释放。对银屑病的治疗包括外用药物、系统用药、物理疗法和其他治疗办法。系统用药所针对的靶分子多种多样，有维甲酸受体、激素受体以及多种免疫活性分子如白介素、白介素受体、肿瘤坏死因子、黏附分子等。治疗银屑病目前国内外尚没有特效药品。
技术内容本发明的目的在于提供一种治疗银屑病的生物药品及其制备方法，用完全人源性的抗角蛋白单克隆抗体解决临床治疗银屑病的问题。
本发明的技术方案可以治疗银屑病的人源性重组抗角蛋白基因工程抗体，其基因序列在结构上属于Fab片段，包括轻链基因和重链Fd段基因，其基因序列为轻链可变区基因GCCGAGCTCACGCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCGTCTCTTGCCGGGCGAGTCATGACATTAGTAATTCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATTCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCCAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACGGATTTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCAACAATATTATACTTCCC
CGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA重链可变区基因GAGGTGCAGCTGCTCGAGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCGTCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGCGGCGGCATTGGGTGCGGTAGGCTTCGTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCGCGGTCAGAGTCTCCTCA这种人源性重组抗角蛋白基因工程抗体的制备方法，其特征在于该方法包括以下主要步骤a、从人源性噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白噬菌体抗体；b、利用基因工程手段，获得可溶性表达的人源性抗角蛋白Fab段；c、对所获抗体的结合活性、特异性、亲和力等免疫学特性进行鉴定。
上述步骤a中，筛选抗角蛋白噬菌体抗体是用人表皮角蛋白作为抗原，从一个半合成噬菌体抗体库中经过数轮的“亲和吸附——洗脱——扩增”过程，筛选具有较好结合活性的抗角蛋白噬菌体抗体，得到其基因序列。
上述步骤b中，其基因工程手段，包括DNA克隆以及利用各种原核系统、酵母系统和真核系统表达人源性抗角蛋白Fab抗体。
上述步骤b中，用酶切去除噬菌体载体上的基因III，然后转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达出可溶性的人源性抗角蛋白Fab抗体，获得可溶性表达的人源性抗角蛋白Fab段。
上述步骤c中，其鉴定包括人源性抗角蛋白Fab抗体的纯化，大肠杆菌表达产物经饱和硫酸铵盐析，充分透析后用金属鳌和亲和层析法分离纯化，得到人源性重组抗角蛋白基因工程抗体。
有益效果角蛋白(keratin)是一组相对分子质量(Mr)为40 000～70 000的蛋白质家族，它们属于细胞骨架成份，是上皮组织的主要结构蛋白和标记蛋白。除此之外，角蛋白还具有一些重要的生物学功能，如参与细胞增生分化的调节、介导信号传导等。银屑病患者表皮角质形成细胞过度增生并伴有分化异常，角蛋白表达的质和量均与正常皮肤有明显差异。要想彻底治愈银屑病，就要治根治本，从研究一种针对表皮角蛋白来治疗银屑病的生物药品。本发明是从客观存在的全长DNA序列中选择特定的片段，用基因工程的手段将其分离出来或克隆出来，用来制备治疗银屑病的生物药品。
本发明通过以下生物学实验证明本发明的功能原理、该抗体的稳定性和含有上述抗体的该药品治疗银屑病的实用性实验例1培养人表皮角质形成细胞接种96孔培养板，待细胞贴壁生长后在培养液中加入系列浓度的抗角蛋白单克隆或多克隆Fab抗体，继续培养24小时，用MTT法测定细胞增殖活性，观察细胞在增殖活性和产生IL-8等细胞因子方面的改变。结果显示抗角蛋白Fab抗体以剂量依赖的方式抑制角质形成细胞的增生，并显著降低角质形成细胞产生IL-8的活性，表明此类抗体能够有效地抑制银屑病表皮的过度增生和炎症反应，具有治疗作用。
实验例2用ELISA方法检测人源性抗角蛋白Fab抗体与人表皮角蛋白以及其他一些无关抗原如铁蛋白、木瓜蛋白酶、乙肝表面抗原、人IgG等的结合情况，结果发现此抗体与人表皮角蛋白具有较高的结合活性，而与其他无关抗原不结合，说明该抗体的特异性、稳定性良好。
实验例3用心得安涂擦的办法建立豚鼠银屑病模型，方法是选择符合研究要求的豚鼠若干只，用5％的心得安乳剂均匀涂于耳廓皮肤，剂量每平方厘米约0.3g，每日2次，连续涂擦2周，涂擦部位可以发生银屑病样皮炎。动物模型建立后，给予注射抗角蛋白抗体，连续观察病变部位的组织病理学改变。结果发现，注射抗角蛋白抗体对动物模型的银屑病样皮炎具有明显的疗效。
通过大量的生物学实验证实，本发明所述的人源性重组抗角蛋白基因工程抗体具有抑制表皮角质形成细胞增生的活性，具有治疗银屑病的作用。该抗体的制备方法克服了鼠源性单克隆抗体存在的免疫原性问题，能够保证长期疗效，具有可工业化生产、操作简单、生产周期短、成本低、产量和纯度高、活性好、质量稳定、使用安全等优点。
具体实施例方式
实施例人源性重组抗角蛋白基因工程抗体制备方法(1)人源性抗角蛋白Fab抗体基因的获得用人表皮角蛋白作为抗原，从一个半合成噬菌体抗体库中经过数轮的“亲和吸附——洗脱——扩增”过程，筛选具有较好结合活性的抗角蛋白噬菌体抗体，得到其基因序列；(2)人源性抗角蛋白Fab抗体的可溶性表达利用分子生物学手段，酶切去除噬菌体载体上的基因III，然后转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达出可溶性的人源性抗角蛋白Fab抗体；(3)人源性抗角蛋白Fab抗体的纯化大肠杆菌表达产物经饱和硫酸铵盐析，充分透析后用金属鳌和亲和层析法分离纯化，得到人源性抗角蛋白Fab抗体的基因工程产物。
权利要求
1.一种人源性重组抗角蛋白基因工程抗体，其特征在于其基因序列在结构上属于Fab片段，包括轻链可变区基因和重链可变区基因，其基因序列为轻链可变区基因GCCGAGCTCACGCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCGTCTCTTGCCGGGCGAGTCATGACATTAGTAATTCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATTCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCCAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACGGATTTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCAACAATATTATACTTCCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA重链可变区基因GAGGTGCAGCTGCTCGAGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCGTCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGCGGCGGCATTGGGTGCGGTAGGCTTCGTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCGCGGTCAGAGTCTCCTCA
2.一种人源性重组抗角蛋白基因工程抗体的制备方法，其特征在于该方法包括以下主要步骤a、从人源性噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白噬菌体抗体；b、利用基因工程手段，获得可溶性表达的人源性抗角蛋白Fab段；c、所获抗体的结合活性、特异性、亲和力等免疫学特性进行鉴定。
3.根据权利要求2所述的人源性重组抗角蛋白基因工程抗体制备方法，其特征在于所述步骤a中，筛选抗角蛋白噬菌体抗体是用人表皮角蛋白作为抗原，从一个半合成噬菌体抗体库中经过数轮的“亲和吸附——洗脱——扩增”过程，筛选具有较好结合活性的抗角蛋白噬菌体抗体，得到其基因序列。
4.根据权利要求2所述的人源性重组抗角蛋白基因工程抗体制备方法，其特征在于所述步骤b中，其基因工程手段，包括DNA克隆以及利用各种原核系统、酵母系统和真核系统表达人源性抗角蛋白Fab抗体。
5.根据权利要求2所述的人源性重组抗角蛋白基因工程抗体制备方法，其特征在于所述步骤b中，用酶切去除噬菌体载体上的基因III，然后转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达出可溶性的人源性抗角蛋白Fab抗体，获得可溶性表达的人源性抗角蛋白Fab段。
6.根据权利要求2所述的人源性重组抗角蛋白基因工程抗体制备方法，其特征在于所述步骤c中，其鉴定包括人源性抗角蛋白Fab抗体的纯化，大肠杆菌表达产物经饱和硫酸铵盐析，充分透析后用金属鳌和亲和层析法分离纯化，得到人源性重组抗角蛋白基因工程抗体。
全文摘要
一种人源性重组抗角蛋白基因工程抗体，其基因序列在结构上属于Fab片段，包括轻链基因和重链Fd段基因。该抗体的制备方法，包括以下主要步骤a、从人源性噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白噬菌体抗体；b、利用基因工程手段，获得可溶性表达的人源性抗角蛋白Fab段；c、对所获抗体的结合活性、特异性、亲和力等免疫学特性进行鉴定。本发明的抗体具有抑制表皮角质形成细胞增生的活性，具有治疗银屑病的作用。该抗体的制备方法克服了鼠源性单克隆抗体存在的免疫原性问题，能够保证长期疗效，具有可工业化生产、操作简单、生产周期短、成本低、产量和纯度高、活性好、质量稳定、使用安全等优点。
文档编号C12N15/09GK1513875SQ0215942
公开日2004年7月21日 申请日期2002年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者王刚, 刘玉峰, 王琰, 王 刚 申请人:中国人民解放军第四军医大学第一附属医院, 中国人民解放军第四军医大学第一附属