基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28单链三特异抗体的制作方法

专利名称：基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28单链三特异抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程抗体领域，更具体地，涉及一种基因工程重组抗CEA抗CD3抗CD28单链三特异抗体；这种抗体的构建、表达和纯化方法；含有该抗体的载体和大肠杆菌宿主菌。
背景技术：
在人体内，T细胞的活化需要双信号传递途径的作用抗原呈递细胞(APCAntigen Presenting Cells)表面的MHC/抗原肽复合物与T细胞表达的TCR/CD3复合物相互作用，产生第一信号传递途径；而APC细胞表面的辅刺激信号分子受体(如B7)与T细胞表面的辅刺激信号分子(如CD28)相互作用，产生第二信号，即辅刺激信号传递途径。一般认为，仅存在第一信号，不能充分活化T细胞(Baxter & Hodgkin，2002；Bernard etal.，2002)。
T细胞主要包括两类杀伤性T淋巴细胞(CTLCytotoxic TLymphocytes)和辅助性T细胞(THT help cells)。其中CTL细胞是细胞免疫的主要效应细胞，而TH细胞通过分泌细胞因子(如IL-2等)和细胞之间的直接相互作用，调节CTL细胞的活性，间接参与细胞免疫。由于肿瘤免疫主要以细胞免疫为主，因此以特异活化CTL细胞为目的设计抗肿瘤药物是进行肿瘤免疫治疗的重要途径。(Foss，2002)目前人们针对T细胞活化的第一信号途径，设计并构建了一系列基因工程抗肿瘤抗CD3双特异抗体，其中相当一部分已经进入临床实验(Daniel et al.，1998；Holliger et al.，1999；Loffler etal.，2000；Manzke et al.，2001；Manzke et al.，2001；Dreier etal.，2002；Dreier et al.，2003；Loffler et al.，2003；MinFang，2003；Fang et al.，2004)。已有的实验数据已经表明，该类双特异抗体能够通过特异活化识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，间接特异杀伤肿瘤细胞。然而由于仅有第一信号传递途径，还不足以完全活化T淋巴细胞，甚至可能诱导T淋巴细胞产生激活诱导的细胞死亡(AICDactivationinduced cell death)现象，从而降低杀伤肿瘤细胞的作用效果(Daniel etal.，1998)。
为了克服该种双特异抗体的缺点，人们设计构建了另外一种双特异抗体抗肿瘤抗CD28双特异抗体。将其与抗肿瘤抗CD3双特异抗体两种双特异抗体联合使用，就可以为T细胞活化提供完整的双信号途径(Junget al.，2001；Kodama et al.，2002)。实验证明，这样做能大幅度提高杀伤肿瘤细胞的效率。然而两种双特异抗体联合使用的方式，在具体应用上会带来一系列不便，如增加了表达和纯化的操作工序和生产成本，临床应用时必须考虑两种抗体的相对比例等。因此，如果构建一种同时针对三种抗原(肿瘤抗原、CD3或TCR、CD28)的三特异抗体(TsAbtri-specificantibody)分子，那么该三特异抗体分子将具有上述两种双特异抗体分子的特性，并且在表达、纯化和临床应用中将具有更大的优越性。
三特异抗体有以下三种类型，化学偶联型(Jung et al.，1991；Tuttet al.，1991；French，1998；Wong et al.，2000)、基因工程多聚体型(Atwell et al.，1999；Dolezal et al.，2000；Schoonjans etal.，2000；Schoonjans et al.，2000；Kortt et al.，2001；Schoonjans etal.，2001；Willems et al.，2003)和基因工程单链融合分子型(Song etal.，2003；Zhang et al.，2003)。其中第三种类型的三特异抗体的构建方式简单，表达产物单一，易于纯化，因此具有更好的应用前景。采用该种方式，本发明人已经成功构建了一种基因工程抗卵巢癌抗CD3抗CD28单链三特异抗体(Song et al.，2003；Zhang et al.，2003)，并且已经证明能够在体外介导产生卵巢癌细胞特异的杀伤作用。由于癌胚抗原-CEA(carcinoma embryonic antigen)是广谱的肿瘤相关抗原(Shi etal.，1983；Ganjei et al.，1988；Horie et al.，1996；Kuo et al.，1996；Feilet al.，1999；Tomita et al.，2000；Kammerer et al.，2003)，用其抗体构建单链三特异抗体将可应用于多种肿瘤的预防和治疗。

发明内容
发明概述本发明将广谱的肿瘤相关抗原CEA引入三特异抗体的构建，构建抗CEA抗CD3抗CD28基因工程单链三特异抗体CEA-TsAb，从而明确了三特异抗体识别肿瘤细胞的特异标记，一方面使三特异抗体能够区分肿瘤细胞和机体正常细胞，尽量避免非特异杀伤反应，另一方面，由于CEA是一种广谱肿瘤相关抗原，该三特异抗体在多种肿瘤的免疫治疗领域，具有了广阔的应用前景。
因此在本发明的一个方面，提供了一种用于治疗多种肿瘤的抗CEA抗CD3抗CD28基因工程单链三特异抗体。
在本发明的另一个方面，提供了一种构建该种三特异抗体的方法。
本发明所述的CEA-TsAb包含的抗CEA鼠源单链抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO1)如下QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSDYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGRTDYNERFKGKATFTGDVSSNTAYMKLSSLTSEDSAVYYCATGTTPFGYWGQGTLVTVSATSTPSHNSHQVPSAGGPTANSGSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYTYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTAYYYCQHSWEIPRTFGGGTKLEIK本发明所述的CEA-TsAb包含的抗CD3鼠源单链抗体的氨基酸序(SEQID NO2)如下EVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRA本发明所述的CEA-TsAb的核苷酸序列(SEQ ID NO3)如下1 ATGGGTCTCGAGCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCGGAACTGATGAA51 ACCGGGCGCGAGCGTGAAAATCAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTCA101 GCGATTATTGGATCGAATGGGTGAAACAGCGTCCGGGTCACGGCCTGGAA151 TGGATCGGTGAAATCCTGCCGGGCAGCGGCCGTACCGACTACAACGAACG201 TTTCAAAGGCAAAGCGACCTTCACCGGCGACGTTTCTAGCAACACCGCGT251 ATATGAAACTGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTACTGC
301 GCGACCGGCACCACCCCGTTCGGTTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTAC351 CGTTTCCGCGACTAGTACCCCGAGCCATAACAGCCATCAGGTGCCGAGCG401 CGGGCGGCCCGACCGCGAACAGCGGCTCTAGAGACATCGTGCTGACCCAG451 AGCCCGGCGAGCCTGGCGGTGTCTCTGGGTCAGCGTGCGACCATCTCCTG501 CCGTGCTTCCCAGTCCGTTTCCACCTCCTCCTACACCTACATGCACTGGT551 ATCAGCAGAAACCGGGTCAGCCGCCGAAACTGCTGATCAAATATGCGAGC601 AACCTGGAATCTGGTGTGCCGGCGCGTTTCAGCGGTTCTGGCAGCGGCAC651 CGACTTCACCCTGAACATCCACCCGGTGGAAGAAGAAGATACCGCGTATT701 ACTATTGCCAGCACTCTTGGGAAATCCCGCGTACCTTCGGTGGCGGCACC751 AAACTGGAAATCAAAGAATTCAACAGCACGTACCGGGTTGTAAGCGTCCT801 CACCGTACTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAATACAAATGCAAGA851 GTACTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGA901 GCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA951 CACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGG1001 GACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAG1051 GACAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGA1101 ACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAT1151 CGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGA1201 ACCTCAGTCACTGTCTCCTCAACTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGG1251 TGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTCTAGAGACATCCAGATGACCCAGACCA1301 CATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGG1351 GCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGA1401 TGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAG1451 TCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACC1501 ATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGG1551 TAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAACTGGAACTGAAGC1601 GCGCTGTCGACTTCCAGAATGCGCTGCTGGTTCGTTACACCAAGAAAGTA1651 CCCCAAGTGTCAACTCCAACTCCTGTAGAGGTCTCACATATGCAGGTACA1701 GCTACAGGAATCTGGTCCGGGTCTGGTAAAACCGTCTCAGACCCTGTCTC1751 TGACCTGTACCGTATCTGGTTTCTCTCTGTCTGACTATGGTGTTCATTGG
1801 GTACGTCAGCCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGTCTGGGTGTAATATGGGG1851 TGGAGGCACGAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACGTGTAACCTCTT1901 CCGACGATACCTCTAAAAATCAGTTCTCTCTGAAACTGTCTTCCGTAGAC1951 ACCGCTGTATACTATTGTGCTCGTTCCTATTACTATTCTATGGACTACTG2001 GGGTCAGGGCACCCTGGTAACCGTATCTTCCGGTACCGAACAAAAACTCA2051 TCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCACATCATCATCACCATCACGAG2101 CAA本发明所述的CEA-TsAb的氨基酸序列(SEQ ID NO4)如下MGLEQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSDYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGRTDYNERFKGKATFTGDVSSNTAYMKLSSLTSEDSAVYYCATGTTPFGYWGQGTLVTVSATSTPSHNSHQVPSAGGPTANSGSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYTYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTAYYYCQHSWEIPRTFGGGTKLEIKEFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKSTEVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRAVDFQNALLVRYTKKVPQVSTPTPVEVSHMQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSDYGVHWVRQPPGKGLECLGVIWGGGTNYNSALMSRRVTSSDDTSKNQFSLKLSSVDTAVYYCARSYYYSMDYWGQGTLVTVSSGTEQKLISEEDLNGAAHHHHHHEQ在本发明的另一个方面，提供了一种用于表达该抗体的载体CEA-TsAb/pTRI。
在本发明的另一个方面，提供了一种含有上述载体的大肠杆菌宿主细胞。
在本发明的另一个方面，提供了一种低温诱导促进三特异抗体胞内可溶表达的方法。
在本发明的另一个方面，提供了一种采用DEAE阴离子交换树脂纯化该三特异抗体的方法。
但是，在本说明书的上下文，尤其是“实施例”部分的公开内容的基础上，本发明的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。


图1.采用重叠PCR拼接用于构建CEA-TsAb的载体多克隆位点DNA的过程简图，其中符号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别代表用于构建的合成寡聚核苷酸片段，字母A、B、C、D、E，罗马数字I、II、III、IV和符号UP、DOWN分别代表构建过程中的中间产物，符号WHOLE代表终产物。
图2.重叠PCR拼接用于构建CEA-TsAb的载体多克隆位点DNA片段的琼脂糖电泳鉴定，第一泳道重叠PCR拼接产物；第二泳道DL2000 DNA分子量标准(大连宝生物公司)图3.多克隆位点DNA片段核苷酸序列、酶切位点及组成。
图4.构建CEA-TsAb的操作过程简图。
图5.用于构建CEA-TsAb的各中间载体和构建成功的含有CEA-TsAb的载体简图。
图6.构建CEA-TsAb过程中各中间产物和终产物的琼脂糖电泳鉴定，第1泳道以质粒pTRI为模板的PCR产物；第2泳道以质粒CD28 VH/pTRI为模板的PCR产物；第3泳道以质粒CD3 scFv/CD28 VH/pTRI为模板的PCR产物；第4泳道以质粒CEA-TsAb/pTRI为模板的PCR产物；第5泳道DL2000 DNA分子量标准(大连宝生物公司)图7.采用重叠PCR拼接用于构建CEA-TsAb的载体多克隆位点DNA的过程简图，其中数字1-22分别代表用于构建的合成寡聚核苷酸片段，字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、a、b、c、d、e、f、g，罗马数字I、II、III、IV和符号UP、DOWN分别代表构建过程中的中间产物，符号WHOLE代表终产物。
图8.重叠PCR拼接用于构建抗CEA单链抗体DNA片段的琼脂糖电泳鉴定，泳道1和9为DNA分子量标准(大连宝生物公司)DL2000；泳道2-5依次为构建过程的中间产物I、II、III和IV；泳道6和7分别为构建过程的中间产物UP和DOWN；泳道8为全长单链抗体片段WHOLE。
图9.低温诱导CEA-TsAb胞内可溶表达的SDS-PAGE鉴定结果，泳道1超声沉淀；泳道2超声上清；泳道3低分子量蛋白标准(上海生物化学研究所)；泳道4pTRI空载体表达超声沉淀；泳道5pTRI空载体表达超声上清，其中箭头所指为CEA-TsAb特异条带。
图10.低温诱导表达CEA-TsAb的Western blot鉴定，泳道1预染蛋白分子量标准(NEB公司)；泳道2CEA-TsAb/pTRI表达产物超声沉淀；泳道3pTRI空载体表达产物超声沉淀；泳道4CEA-TsAb/pTRI表达产物超声上清；泳道5pTRI空载体表达产物超声上清。
图11.DEAE阴离子交换纯化结果的SDS-PAGE鉴定，泳道1pTRI空载体表达产物超声上清；泳道2CEA-TsAb表达产物超声上清；泳道3DEAE阴离子交换纯化过柱流穿组分；泳道4DEAE阴离子交换纯化NaCl洗脱组分；泳道5DEAE阴离子交换纯化NaOH洗脱组分；泳道6低分子量蛋白标准(购自上海生物化学研究所)。箭头所指为CEA-TsAb特异条带。
图12.CEA-TsAb的ELISA鉴定结果，图中的曲线由上而下分别代表四种测定结果。第一条曲线10μg/ml Jurkat细胞膜抗原；第二条曲线1μg/ml CEA抗原；第三条曲线1μg/mlCD28抗原；第四条曲线不包被任何抗原的测定结果。
图13.CEA-TsAb对各种肿瘤细胞结合特异性的FACS鉴定结果，图中带阴影的峰是不加抗体CEA-TsAb的对照样品测定结果，不带阴影的峰是添加抗体CEA-TsAb的样品测定结果。
图14.CEA-TsAb对Jurkat细胞和PBMC细胞结合特异性的FACS鉴定，图中带阴影的峰是不加抗体CEA-TsAb的对照样品测定结果，不带阴影的峰是添加抗体CEA-TsAb的样品测定结果。
图15.MTT法检测不同效靶比对CEA-TsAb介导的T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞效率的影响，三条曲线分别代表三个不同效靶比(E/T＝10、5、1)时，杀伤肿瘤细胞的效率与抗体浓度的相关性，图中的曲线由上而下分别代表三种不同的效靶比的特异杀伤率测定结果，第一条曲线效靶比为10；第二条曲线效靶比为5；第三条曲线效靶比为1。
图16.MTT检测抗体浓度对CEA-TsAb介导的T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的效率的影响，图中显示特异杀伤率的变化分为四个阶段阶段1在6g/ml-12g/ml之间，特异杀伤率与抗体浓度负相关，在12g/ml时，特异杀伤率达到最高；阶段2特异杀伤率与抗体浓度正相关，至750ng/ml时特异杀伤率最低；阶段3在24ng/ml-750ng/ml之间，特异杀伤率与抗体浓度负相关，在24ng/ml特异杀伤率最高；阶段4特异杀伤率与抗体浓度又出现正相关。
图17.CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞过程中，抗体浓度对T淋巴细胞增殖的影响。图中显示SI的变化分为三个阶段阶段1抗体浓度在1.5g/ml-12g/ml之间，SI与抗体浓度呈正相关变化，在1.5g/ml达到最低；阶段2SI与抗体浓度呈负相关变化，在47ng/ml左右达到最高；阶段3在小于47ng/ml时，SI与抗体浓度呈正相关变化，在0.7ng/ml时SI最低。
图18.CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞过程中细胞形态观察记录(二)，A单独培养SW1116细胞20小时后细胞形态；B-I按照效靶比为5共孵育SW1116细胞和PBMC细胞，并添加CEA-TsAb(终浓度为1g/ml)共孵育20小时后处于不同杀伤阶段的各种细胞形态，其中B靶细胞由贴壁开始脱离；C效应细胞开始聚集在靶细胞的表面；D靶细胞表面局部出现突起；E靶细胞局部破碎；F靶细胞整体破碎；G-I靶细胞逐渐完全破碎。
图19.CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制简图，上图CEA-TsAb的结构简图；下图CEA-TsAb杀伤肿瘤细胞的作用机制CEA-TsAb与肿瘤细胞和CTL细胞特异结合，并通过活化CTL细胞而杀伤肿瘤细胞。
图20.PI和FITC-Annexin V双标记被杀伤的肿瘤细胞(SW1116)的荧光显微镜观察记录，A、B和C行分别代表三种不同状态的被杀伤肿瘤细胞(依次为坏死细胞、晚期凋亡细胞和早期凋亡细胞)；第2列为绿色荧光单色观察结果，第3列为红色荧光单色观察结果，第1列是采用LeicaQFISH软件将前两种单色荧光观察结果进行叠加的结果。
图21.PI和FITC-Annexin V双标记被杀伤的肿瘤细胞(SW1116)的FACS检测结果，代表不同细胞杀伤状态的明显各个分区左下区(Low Left，LL)为活细胞(viable cells)、右下区(Low Right，LR为早期凋亡细胞(early apoptosis cells)、左上区(Up Left，UL)为坏死细胞(necrosiscells)、右上区(Up Right，UR)为晚期凋亡细胞(late apoptosis cells)。不添加抗体组(SW1116+PBMC)左下区90.17％，右下区1.66％，左上区5.94％，右上区2.23％；添加50ng/ml CEA-TsAb(SW1116+PBMC+CEA-TsAb)左下区52.83％，右下区16.12％，左上区9.80％，右上区21.25％。
发明详述在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义本发明所构建的基因工程单链三特异抗体是采用基因工程重组的方法构建的，同时具有三种抗原结合特异性的单一抗体分子。具体地，本文所述的抗CEA抗CD3抗CD28单链三特异抗体是指将三种抗体片段通过两种连接肽(FC连接肽和HSA连接肽)(Min Fang，2003)串联在一起构建而成的单一分子的三特异抗体。可以在该抗体的C端添加c-myc标签和组氨酸标签((His)6-tag)(Hengen，1995；Fan et al.，1998)，用于活性检测和纯化，也可以不加。这三种抗体片段可以是单链抗体片段(scFvsinglechain fragment of variable region)，抗体Fab片段或单域抗体片段(VH或VL)。更具体地，CEA-TsAb是将抗CEA scFv、抗CD3scFv和抗CD28 VH依次通过FC连接肽和HSA连接肽串联在一起，再在C端添加c-myc标签和组氨酸标签((His)6-tag)构建而成。该抗体具有以下优点1.是基于T细胞活化需要双信号传递途径的理论基础之上构建的，具有完全活化T细胞的能力。
2.能够识别广谱肿瘤相关抗原CEA，能够介导CTL细胞特异杀伤多种肿瘤细胞，具有治疗多种肿瘤的应用前景。
本文所述的低温诱导，促进三特异抗体胞内可溶表达的方法是指采用0.4mM的IPTG((异丙基-β-D-半乳糖苷))在30℃诱导大肠杆菌表达三特异抗体。这种方法能够保证大幅度减少包涵体形成，胞内可溶表达的三特异抗体的比例(占所有三特异抗体的比例)达到50％以上。使用该方法得到的表达产物不必进行的变性和复性，直接进行纯化，有利于提高产率和节约成本。
本文所述的采用DEAE阴离子交换树脂，一步流穿纯化三特异抗体的方法是指在合适的pH值(pH8.0)，将上述胞内可溶表达产物，经过一次DEAE阴离子交换层析，使几乎所有杂蛋白被吸附在DEAE柱上，而大部分三特异抗体随流穿液流出，三特异抗体的纯度达到75％以上。
本发明的技术方案如下首先构建含有特定多克隆位点的中间载体pTRI。然后从已有的表达载体上采用PCR的方法，扩增出抗CD28单域抗体的编码DNA片段CD28 VH，同时将其两端的酶切位点更换为NdeI/KpnI；再从已有的载体上扩增出抗CD3单链抗体的编码DNA片段，同时将其两端的酶切位点更换为ScaI/SalI；再从已有的载体上切下CEA scFv(XhoI/EcoRI)。最后按照一定的先后顺序进行酶切连接和转化反应即可以构建完成抗CEA抗CD3抗CD28单链三特异抗体CEA-TsAb。
将CEA-TsAb/pTRI转入大肠杆菌BL21(DE3)后，进行IPTG低温诱导表达，表达产物超声上清经过一步DEAE阴离子交换后，即可以得到初步纯化。采用酶联免疫吸附反应(ELISA)检测CEA-TsAb纯化产物的抗原结合活性；CEA-TsAb纯化产物标记FITC后采用单色流式细胞术(FACS)检测的肿瘤细胞结合特异性；采用MTT方法检测CEA-TsAb纯化产物介导T淋巴细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞的效果；以及采用倒置显微镜记录上述杀伤过程中肿瘤细胞形态变化；采用MTT方法检测CEA-TsAb纯化产物介导T淋巴细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞的过程中，T细胞的增殖情况；采用PI/annexin-V双色FACS检测CEA-TsAb纯化产物介导T淋巴细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞，诱导其凋亡的效果，同时使用荧光显微镜记录上述杀伤过程中坏死或凋亡肿瘤细胞的形态。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，本说明书中的实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1.重叠PCR拼接用于构建三特异抗体表达载体pTRI的多克隆位点DNA片段重叠PCR拼接的流程图见图1。用于拼接反应的寡聚核苷酸片段如下1.5’-TAT ACC ATG GGT CTC GAG-3’(SEQ ID NO5)2.5’-TAT ACC ATG GGT CTC GAG ATG TAC CCG CGC GGT AAC ACT AGT GAATTC AAC AGC ACG TA-3’(SEQ ID NO6)3.5’-AGC CAG TCC TGG TGC AGT ACG GTG AGG ACG CTT ACA ACC CGG TACGTG CTG TTG AAT TC-3’(SEQ ID NO7)4.5’-CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAA TAC AAA TGC AAG AGTACT TCT AGA ATG TA-3’(SEQ ID NO8)5.5’-CGA ACC AGC AGC GCA TTC TGG AAG TCG ACG TTA CCG CGC GGG TACATT CTA GAA GTA CT-3’(SEQ ID NO9)6.5’-AAT GCG CTG CTG GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCAACT CCA ACT CCT GT-3’(SEQ ID NO10)7.5’-GCG GTA CCG TTA CCG CGC GGG TAC ATC ATA TGT GAG ACC TCT ACAGGA GTT GGA GTT GA-3’(SEQ ID NO11)8.5’-CGC GGT AAC GGT ACC GCG CTG GAA GTT GAC GAA ACC TAC GTT CCGAAA GAA TTT AAC GC-3’(SEQ ID NO12)9.5’-TCG CTA GCC CCA TCC GCG GGA TGT CAG CGT GGA AGG TGA AGG TTTCCG CGT TAA ATT CTT TCG G-3’(SEQ ID NO13)10.5’-ATC GAG CTC ATG TAC CCG CGC GGT AAC GCT AGC GAA CAA AAACTC ATC TCA GAA GAG GA-3’(SEQ ID NO14)11.5’-TA TTG CTC GTG ATG GTG ATG ATG ATG TGC GGC CCC ATT CAGATC CTC TTC TGA GAT GAG-3’(SEQ ID NO15)12.5’-CTC GAC GGA TCC TTA TTG CTC GTG ATG GTG-3’(SEQ ID NO16)操作步骤如下步骤1将片段2-11按照图1所示及如下的反应条件各自配对重叠延伸，不加引物。得到的反应产物不需要回收，可直接进行下一步反应。
反应条件每个片段各1μl；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTPs(每种2mmol/ml)(大连宝生物技术公司)；0.3μl Taq(1U)(大连宝生物技术公司)；水14μl。
94℃预变性1分钟；94℃变性30秒；45℃退火30秒；72℃延伸30秒；进行10个循环。
得到反应产物A(片段2和3配对)、B(片段4和5配对)、C(片段6和7配对)、D(片段8和9配对)和E(片段10和11配对)。
步骤2将反应产物A和B，B和C，C和D，D和E按照图1所示及如下的反应条件各自配对重叠延伸，不加引物。1％琼脂糖凝胶电泳回收反应产物。反应产物I(反应产物A和B配对)约180bp，II(反应产物B和C配对)约180bp，III(反应产物C和D配对)约180bp，IV(反应产物D和E配对)约100bp。
反应条件反应产物各10μl，不需要补充其它反应成分，按照下述条件进行反应。
94℃预变性1分钟；94℃变性30秒；45℃退火30秒；72℃延伸30秒；进行10个循环。
步骤3将反应产物I和II，III和IV按照图1所示及如下的反应条件分别配对，重叠延伸。1％琼脂糖凝胶电泳回收反应产物。UP(反应产物I和II配对)约340bp，DOWN(反应产物III和IV)约260bp)反应条件反应产物I和II，III和IV各1μl；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTPs(每种2mmol/ml)；0.3μl Taq(1U)；13μl水。
94℃预变性1分钟；94℃变性30秒；72℃延伸50秒；进行25个循环。
步骤4反应产物UP和DOWN配对，重叠延伸，以片段1和12作为引物。
反应条件反应产物UP和DOWN各1μl；引物各1μl；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTPs(每种2mmol/ml)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。
94℃预变性1分钟；94℃变性30秒；72℃延伸50秒；进行25个循环。得到重叠PCR产物。
最后，重叠PCR产物经1％琼脂糖电泳鉴定，片段大小为439bp，(见图2)，表明采用上述方法成功完成了多克隆位点DNA片段的拼接。重叠PCR产物即多克隆位点DNA片段的核苷酸序列、酶切位点及组成见图3。
实施例2CEA-TsAb的构建具体构建过程参考图4。在构建过程中使用的各种载体的简图见图5。构建过程具体操作步骤如下(1)载体pTRI的构建将多克隆位点DNA片段和pTMF空载体(Zhang et al.，2002)同时进行NcoI/BamHI双酶切反应，回收多克隆位点DNA片段的酶切产物和pTMF酶切的大片段产物，连接并转化TOP10菌株，提取阳性转化克隆的质粒后经PCR鉴定得到正确的连接产物。将正确连接产物的质粒命名为pTRI，用于下一步操作。
其中所进行的酶切反应、连接反应、细菌感受态制备和转化反应的具体操作如下酶切反应使用20μl体系，对约1μg pTMF空载体或多克隆位点DNA片段分别进行NcoI/BamHI(Promega公司)双酶切反应。酶的用量、缓冲溶液以及反应条件参见所用限制性内切酶的说明书。酶切产物经过1％琼脂糖电泳后，采用胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收特异大小的片段，pTMF空载体酶切产物大小约5000bp，多克隆位点DNA片段酶切产物大小约为430bp。
连接反应酶切后的pTMF载体片段50-100ng；酶切后的多克隆位点DNA片段载体的3-10倍(摩尔比)；10×T4 DNA连接酶缓冲溶液2μl；T4 DNA连接酶(大连宝生物公司)1U；补加ddH2O至总体积为20μl。16℃过夜连接。
制备大肠杆菌感受态细胞将TOP10菌株(Invitrogen公司)转接在2ml LB培养基((10g/l tryptone(GIBCO公司)，5g/l yeast extract(GIBCO公司)，5g/l NaCl，pH7.5))中37℃振荡培养过夜。按1∶100的比例转接至20-40ml无抗生素LB培养基中，快速振荡培养至A600为0.3-0.4时(约2.5小时)停止，冰浴15分钟，4℃ 4,000rpm离心10分钟收集菌体，弃上清，加入10ml预冷的0.1mol/ml CaCl2(Sigma公司)，重悬混匀，冰浴20分钟，4℃4,000rpm离心10分钟，弃上清后加入预冷的含12％甘油的0.1mol/mlCaCl21~2ml，轻轻悬起菌体，每管200μl，-80℃冻存备用。
连接产物的转化在200μl感受态细胞中加入1μl上述连接混合物，混匀后冰浴30分钟，42℃热激100秒，然后迅速冰浴2分钟。向冰浴后的混合物中加入0.8ml LB培养基，37℃轻摇(＜150rpm)或静置45分钟复苏；10,000rpm离心1分钟，弃上清，加50～100μl LB培养基重悬沉淀，涂布于LB-K平板(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，15g/l琼脂(SIGMA公司)，50μg/ml卡那霉素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃培养过夜。
阳性重组克隆的筛选与鉴定挑取卡那霉素筛选阳性的连接产物单克隆，接入2ml LB-K培养基(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/lNaCl，50μg/ml卡那霉素(SIGMA公司)，pH7.5)，37℃振荡过夜培养，然后按照质粒提取试剂盒(上海华舜公司)的说明书提取质粒DNA，命名为pTRI。按照下述方法进行PCR鉴定。
PCR鉴定在20μl的扩增体系中加入0.1~1μl质粒DNA(约20~200ng)，上游引物(T7-up5’-TAATACGACTCACTATAGGGG A-3’)(SEQID N017)和下游引物(T7-down5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’)(SEQID NO18)各10pmol，2μl 10×Taq酶缓冲液和2μl 2mmol/ml的dNTPs，Taq酶1U，补水至总体积20μl。具体反应程序94℃预变性5分钟后，94℃变性40秒，53℃退火40秒，72℃延伸40秒，扩增25个循环，取5μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图6，PCR产物大小约为500bp。
(2)CD28 VH/pTRI的构建采用PCR方法从质粒CD28 VH/pTMF(Cheng et al.，2002)上扩增抗CD28 VH的DNA片段，由于所使用的上游引物(P15’-TCACATATGCA GGTACAGC TACAG-3’)(SEQ ID NO19)和下游引物(P25’-TTCGCTAGCGGAAGATACGGTA CCA-3’)(SEQ ID NO20)的5’端分别带有酶切位点NdeI和NheI，因此PCR产物的两端也会带上这两个新的酶切位点。
PCR反应混合物组成引物各1μl，dNTPs 2μl(每种2mmol/ml)，10×pfu缓冲液2μl，质粒CD28 VH/pTMF 1μl(约100ng)，Pfu酶(Promega公司)0.3μl，补ddH2O至20μl。PCR反应条件94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸50秒，一共反应25个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收约350bp的PCR产物。
将该PCR产物与载体pTRI进行NdeI/NheI(Promega公司)双酶切反应，具体酶切反应条件参照酶供应商的说明书，用胶回收试剂盒回收PCR产物的酶切产物(约350bp)和pTRI酶切大片段产物(约5300bp)，经连接和转化，具体反应过程参照上述步骤(1)，然后提取卡那霉素抗性阳性克隆进行PCR鉴定，鉴定方法参考上述步骤(1)。结果见图6，PCR产物大小为750bp左右的克隆为正确连接的质粒，命名为CD28 VH/pTRI，用于下一步操作。
(3)CD3 scFv/CD28 VH/pTRI的构建采用PCR方法从质粒CD3 scFv/pTMF(刘喜富等，1996)上扩增抗CD3 scFv的DNA片段，由于所使用的上游引物(P15’-AAGAGTACTGAGGTGAAGCTGGTGG-3’)(SEQ ID NO21)和下游引物(P25’-GAAGTCGACAGCGCGCTTCAGTTCCAG-3’)(SEQ ID NO22)的5‘端分别带有酶切位点ScaI和SalI，因此PCR产物的两端也会带上这两个新的酶切位点。
PCR反应混合物组成引物各1μl，dNTPs 2μl(每种2mmol/ml)，10×pfu缓冲液2μl，质粒CD3 scFv/pTMF 1μl(约100ng)，Pfu酶(Promega公司)0.3μl，补ddH2O至20μl。PCR反应条件94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸50秒，一共反应25个循环。采用1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收750bp左右的PCR产物。
将该PCR产物与载体CD28 VH/pTRI同时ScaI/SalI(Promega公司)双酶切反应，具体酶切反应条件参照酶供应商的说明书，用胶回收试剂盒回收PCR产物的酶切产物(750bp左右)和CD28 VH/pTRI酶切大片段产物(5700bp左右)，进一步进行连接和转化TOP10菌株。具体连接和转化反应过程参照上述步骤(1)，然后提取卡那霉素抗性阳性克隆进行PCR鉴定。PCR鉴定方法参考上述步骤(1)。鉴定结果见图6，PCR产物大小为1400bp左右的克隆为正确连接的质粒，保留鉴定阳性的克隆，提取质粒命名为CD3 scFv/CD28 VH/pTRI，用于下一步操作。
(4)CEA-TsAb/pTRI的构建重叠PCR构建抗CEA单链抗体将抗CEA单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列(Koga etal.，1990)以一段多肽序列(GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO23)连接起来，设计成抗CEA单链抗体。然后按照大肠杆菌喜好的密码子表(Nakamuraet al.，2000)将其反向翻译成一段DNA序列，并进一步拆分成互补的寡聚核苷酸片段(下述序列1-22)，以便于使用重叠PCR技术拼接成全长的抗CEA单链抗体DNA片段。以下为用于拼接抗CEA单链抗体全基因片段的寡聚核苷酸片段。
1.5’-TTCCTCGAGCAGGTTCAGCT-3’(SEQ ID NO24)2.5’-TCGCGCCCGGTTTCATCAGTTCCGCACCGCTCTGCTGCAGCTGAACCTGCTCGAGGAA-3’(SEQ ID NO25)3.5’-ACTGATGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATCAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTC-3’(SEQ ID NO26)4.5’-CACCCATTCGATCCAATAATCGCTGAAGGTATAGCCGGTCGCTT-3’(SEQID NO27)5.5’-ATTATTGGATCGAATGGGTGAAACAGCGTCCGGGTCACGGCCTGGAATGGATCGGTGAA-3’(SEQ ID NO28)6.5’-ACGTTCGTTGTAGTCGGTACGGCCGCTGCCCGGCAGGATTTCACCGATCCATTCCAGG-3’(SEQ ID NO29)7.5’-CGTACCGACTACAACGAACGTTTCAAAGGCAAAGCGACCTTCACCGGCGACGTTTCTAGC-3’(SEQ ID NO30)8.5’-TTCGCTGGTCAGGCTAGACAGTTTCATATACGCGGTGTTGCTAGAAACGTCGCCGGTGAA-3’(SEQ ID NO31)9.5’-TGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTACTGCGCGACCGGCACCACCCCG-3’(SEQ ID NO32)10.5’-GCTCACGGTCACCAGGGTGCCCTGACCCCAGTAACCGAACGGGGTGGTGCCGGTCGCGCA-3’(SEQ ID NO33)11.5’-GCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGACTAGTACCCCGAGCCATAACAGCCATCAGGTGCCG-3’(SEQ ID NO34)12.5’-GTCTCTAGAGCCGCTGTTCGCGGTCGGGCCGCCCGCGCTCGGCACCTGATGGCTGTTAT-3’(SEQ ID NO35)13.5’-CGAACAGCGGCTCTAGAGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGAGCCTGGCGG
TGTC-3’(SEQ ID NO36)14.5’-CTGGGAAGCACGGCAGGAGATGGTCGCACGCTGACCCAGAGACACCGCCAGGCTCGCCGG-3’(SEQ ID NO37)15.5’-TCTCCTGCCGTGCTTCCCAGTCCGTTTCCACCTCCTCCTACACCTACATGCACTGGTAT-3’(SEQ ID NO38)16.5’-GATCAGCAGTTTCGGCGGCTGACCCGGTTTCTGCTGATACCAGTGCATGTAGGTGT-3’(SEQ ID NO39)17.5’-AGCCGCCGAAACTGCTGATCAAATATGCGAGCAACCTGGAATCTGGTGTGCCGGCGCGT-3’(SEQ ID NO40)18.5’-GTTCAGGGTGAAGTCGGTGCCGCTGCCAGAACCGCTGAAACGCGCCGGCACACCAGATT-3’(SEQ ID NO41)19.5’-GCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCGGTGGAAGAAGAAGATACCGCGTATTACTAT-3’(SEQ ID NO42)20.5’-GCCACCGAAGGTACGCGGGATTTCCCAAGAGTGCTGGCAATAGTAATACGCGGTATCTT-3’(SEQ ID NO43)21.5’-TCCCGCGTACCTTCGGTGGCGGCACCAAACTGGAAATCAAAGAATTCGCC-3’(SEQ ID NO44)22.5’-GGCGAATTCTTTGATTTCCAG-3’(SEQ ID NO45)S1)5’-GGCGAATTCTTTGATTTCCAG-3’(SEQ ID NO46)S17)5’-AGCCGCCGAAACTGCTGATC-3’(SEQ ID NO47)S16)5’-GATCAGCAGTTTCGGCGGCT-3’(SEQ ID NO48)S13)5’-CGAACAGCGGCTCTAGAGAC-3’(SEQ ID NO49)S12)5’-GTCTCTAGAGCCGCTGTTCG-3’(SEQ ID NO50)S7)5’-GTACCGACTACAACGAACGT-3’(SEQ ID NO51)S6)5’-ACGTTCGTTGTAGTCGGTAC-3’(SEQ ID NO52)步骤1将片段1-22各自配对重叠延伸，不加引物，反应产物不需要回收，直接进行下一步反应。用于反应的每个片段各1μl(10pmol)；2μl10×PCR缓冲液(500mM KCl，50mM Tris pH8.5，25mM Mg(Cl)2下同)；2μl dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，每种2mM)(购自大连宝生物技术公司，下同)；0.3μl Taq(1U)(购自大连宝生物技术公司，下同)；水14μl。反应条件94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；10个循环。
得到反应产物A(片段1和2配对)、B(片段3和4配对)、C(片段5和6配对)、D(片段7和8配对)、E(片段9和10配对)，F(片段11和12配对)、G(片段13和14配对)、H(片段15和16配对)、I(片段17和18配对)、J(片段19和20配对)、K(片段21和22配对)。
步骤2将反应产物A和B，D和E，G和H，J和K各自配对重叠延伸，不加引物。用于反应的每种物质各10μl(10pmol)。反应条件94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；10个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收反应产物a(A和B配对)、b(C)、c(D和E配对)、d(F)、e(G和H配对)，f(I)和g(J和K配对)。a和g的大小为120bp，c和e的大小约为170bp，b、d和f的大小约为100bp。
步骤3将a与b、c与d、f与g分别配对，单独使用反应产物e，添加各自引物(s1和s6对应a和b的配对，s7和s12对应c和d的配对，s13和s16对应e，s17和22对应f和g的配对)，进行PCR扩增。用于反应的每种物质各1μl(约100ng)；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTPs(每种2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；补加水至终体积为20μl。反应条件94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收反应产物I(a和b配对)、II(c和d配对)、III(对应于反应产物e)和IV(f和g配对)。反应产物I大小约为200bp，II大小约为250bp，III的大小约为140bp，IV的大小约为230bp。
步骤4将反应产物I与II、III与IV分别配对，添加各自引物(s1和s12对应I和II的配对，s13和22对应III和IV的配对)，进行PCR扩增。用于反应的每种物质各1μl(约100ng)；2μl 10×PCR缓冲液；2μldNTP(2mM each)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。反应条件94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25个循环。得到反应产物UP(I和II配对)和DOWN(III和IV配对)，经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收。UP的大小约为430bp，DOWN的大小约为340bp。
步骤5将反应产物UP和DOWN配对，添加引物(片段s1和片段22)进行PCR扩增。反应产物UP和DOWN各1μl(约100ng)；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(每种2mM)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq(1U)；水12μl。反应条件94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸1min；25个循环。得到的反应产物WHOLE(约750bp)经1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收。
上述操作步骤流程参见图7，各个步骤的反应产物的PCR鉴定见图8。
将上述750bp的DNA片段和载体pTMF同时进行XhoI和EcoRI(Promega)双酶切反应。具体酶切反应条件参照酶供应商的说明书。采用胶回收试剂盒回收PCR产物的酶切产物(750bp左右)和pTMF酶切大片段产物(5200bp左右)，进行连接和转化TOP10菌株，具体连接和转化反应过程参照的步骤(1)。然后提取卡那霉素抗性阳性克隆，命名为CEAscFv/pTMF。
将CEA scFv/pTMF与CD3 scFv/CD28 VH/pTRI同时进行XhoI和EcoRI(Promega)双酶切反应。具体酶切反应条件参照酶供应商的说明书。将750bp左右的CEA scFv/pTMF酶切小片段产物(抗CEA scFv)和CD3scFv/CD28 VH/pTRI的酶切大片段(6000bp左右)产物进行连接和转化TOP10菌株，具体连接和转化反应过程参照的步骤(1)。然后提取卡那霉素抗性阳性克隆进行PCR鉴定。PCR鉴定方法参考步骤(1)。鉴定结果见图6，PCR产物大小为2100bp左右的克隆为正确连接的质粒，命名为CEA-TsAb/pTRI。
实施例3CEA-TsAb的低温诱导胞内可溶表达(1)将CEA-TsAb/pTRI转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)按照实施例2中所述制备感受态细胞的方法，制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。按照质粒提取试剂盒(上海华舜公司)的说明书提取质粒CEA-TsAb/pTRI，按照实施例2步骤(1)进行转化实验，并如实施例2所述进行鉴定。
(2)低温诱导表达将含有CEA-TsAb/pTRI的BL21(DE3)涂LB-K平板，37℃过夜培养，然后挑取单克隆，接种于5ml LB-K液体培养基中，在大试管内，37℃摇床培养过夜(200转/分钟)。次日取过夜培养物按1/100的比例转接到250ml LB-K液体培养基中，继续37℃摇床培养(200转/分钟)至A600＝0.6，补加IPTG(大连宝生物公司)至终浓度为0.4mmol/ml，继续在30℃培养4小时，进行低温诱导表达。室温12,000rpm离心10分钟，收集菌体，悬于1/5培养体积的PBS缓冲液中，进行菌体超声破碎。经过进一步室温12,000m离心10分钟后，离心上清组分含有胞内可溶表达的CEA-TsAb；离心沉淀含有以包涵体形式表达的CEA-TsAb，将离心沉淀悬浮在1/5培养体积的PBS中。按照《分子克隆实验指南》(金冬雁，黎孟枫译，1996，科学出版社)，采用还原SDS-PAGE电泳和Western blot检测上述超声上清和超声沉淀中CEA-TsAb的表达情况，并使用数字图象分析仪(美国Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200 Documentation & analysissystem)确定胞内可溶表达和包涵体表达的相对比例。SDS-PAGE电泳(见图9)和Western blot(见图10)的结果表明，采用上述胞内可溶表达的方法，胞内可溶表达的比例达到70％左右。因为超声上清可以直接用于纯化和后续的体外活性实验，省去了变性和复性的步骤，大大节约生产成本和时间。
实施例4采用DEAE阴离子交换树脂纯化CEA-TsAb将上述250ml的低温诱导胞内可溶表达产物室温12,000rpm离心10分钟，收集菌体并悬于1/5体积(50ml)的DEAE阴离子交换树脂(发玛西亚公司)的平衡缓冲液(20mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH8.0)中，进行超声破碎。然后室温12,000rpm离心10分钟，离心上清直接用于纯化。
将20ml DEAE阴离子交换树脂悬浮在100ml平衡缓冲液中，进行装柱(上海华美公司)，柱的规格为16mm×20cm；然后使用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡，流速为1ml/分钟；将上述超声产物的离心上清直接上柱，上样流速为0.25ml/分钟，收集流穿组分，即为纯化的CEA-TsAb；收集结束后，使用2个柱体积(约40ml)的洗脱缓冲液(500mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH8.0)进行洗脱，流速为0.25ml/分钟；使用2个柱体积(约40ml)0.5mol/L NaOH清洗柱料，2个柱体积(40ml)1mol/LNaCl进行柱的再生，流速为0.5ml/分钟；最后再使用2个柱体积(40ml)平衡缓冲液平衡柱料，流速为1ml/分钟用于下一次纯化。如果较长时间不使用，必须使用4个柱体积以上的20％乙醇水溶液过柱后，保存在4℃，以免柱料滋生细菌。
上述流穿组分，直接进行还原SDS-PAGE，鉴定纯化效果。SDS-PAGE的结果(见图11)显示经过一步DEAE阴离子交换纯化，可以去除超声上清中的大部分杂蛋白，使用数字图象分析仪(美国Alpha Innotech公司，AlphaImage 2200 Documentation&analysis system)确定CEA-TsAb的纯度达到70％左右。
上述纯化样品需要对PBS(8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl调pH至7.4，定容至1升)透析过夜(4℃)。透析体积为500ml，每隔6个小时换一次透析液。采用Bradford法对透析后的样品进行蛋白定量，具体操作按照《精编分子生物学实验指南》(颜子颖，王海林译，金冬雁校，1999，科学出版社，)进行。定量后的样品补加NaN3(Sigma公司)至终浓度0.05％(W/V)，作为防腐剂；补加海藻糖(购自中国科学院微生物研究所)至终浓度0.15mol/L，作为稳定剂。然后分装为1ml/份冻存于-80℃，待用。
实施例5ELISA方法检测CEA-TsAb的抗原结合活性Jurkat细胞膜抗原的制备收集Jurkat细胞(人急性白血病淋巴瘤细胞)(购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，序号TIB-152)约5×106，1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在0.5ml PBS中，进行超声破碎。将超声破碎液12,000rpm室温离心10分钟后，保留超声上清，使用Bradford法进行蛋白浓度定量。然后补加NaN3至终浓度0.05％(W/V)，作为防腐剂；补加海藻糖(购自中国科学院微生物研究所)至终浓度0.15mol/L，作为稳定剂。然后分装为100μl/份冻存于-80℃，待用。
ELISA操作步骤
(1)包被抗原浓度分别为1μg/ml CEA(Fitzerald公司，德国)；1μg/mlCD28-FC chimera(R&D公司)；10μg/ml Jurkat细胞膜抗原。包被体积为100μl/孔包被。包被缓冲液配方1.36g Na2CO3，7.35g NaHCO3，950ml水，使用1mol/L HCl或1mol/L的NaOH调pH9.2，补水至1L。PBS 37℃包被2小时或4℃包被过夜。
(2)封闭PBS洗板1-2次后，加入封闭液PBSA(PBS-1％BSA(W/V))，200μl/孔，37℃封闭1-2小时。
(3)加样PBS洗板三次后，加入纯化样品，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。样品使用方法以10μg/ml的纯化CEA-TsAb作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度三复孔。
(4)加入第一抗体PBST(PBS-0.05％Twen-20(V/V))洗板三次后，以封闭液1/1000稀释抗cmyc-tag单抗(9E10，购自SANTA CRUTZ公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。
(5)加入第二抗体PBST洗板三次后，以封闭液1/1000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(购自华美公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。
(6)显色PBST洗板5次后，添加显色液(48.6ml 0.1M柠檬酸，51.4ml 0.2MNa2HPO4加水至1L，pH5.0，配成底物缓冲液；10ml底物缓冲液中加入4mgOPD即邻苯二胺(Sigma公司)，15μl 30％H2O2配成显色液)，100μl/孔，室温避光显色15-30分钟。
(7)终止反应添加终止液(1mol/L HCl)，50μl/孔。
(8)测定结果在490nm读取吸光值。
ELISA结果(见图12)显示，CEA-TsAb与两种纯抗原(CEA和CD28)特异结合。由于Jurkat丰富表达CD3，因此CEA-TsAb与CD3也特异结合。
实施例6FACS(流式细胞术)方法检测CEA-TsAb与肿瘤细胞的结合活性首先采用间接FACS方法检测CEA-TsAb对各种肿瘤细胞的结合特异性。所使用的各种肿瘤细胞的肿瘤相关性和组织来源见下表。
名称肿瘤相关性来源A549肺腺癌ATCCCCL-185MCF-7 乳腺癌ATCCHTB-22SKOV3 卵巢癌ATCCHTB 77SW1116 结肠癌ATCCCCL-233具体操作如下(1)培养、收集上述4种细胞除SW1116细胞外，其余3种细胞的培养条件均为RPMI-1640液体培养基(GIBCO公司)，10％胎牛血清(黑龙江江海生物工程技术公司)，5％CO2，37℃孵箱培养；SW1116细胞的培养条件L15液体培养基(GIBCO公司)，10％新生牛血清(黑龙江江海生物工程技术公司)，5％CO2，37℃孵箱培养。在细胞生长至对数期后，每种细胞收集5×105个。
(2)将上述各种细胞1,000g离心10分钟后，使用PBS悬浮细胞，再次1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在100μl含有10μg/ml CEA-TsAb的PBS中，4℃放置30分钟。每种细胞均设立不加抗体的同型对照，该对照以下各步均与待测样品同样操作。
(3)1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在100μl含有1/1000稀释抗cmyc-tag抗体(9E10，SANTA CRUTZ公司)的PBS中，继续4℃放置30分钟。
(4)1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在100μl含有1/1000稀释FITC偶联羊抗鼠IgG(BD公司)的PBS中，继续4℃放置30分钟。
(5)流式细胞仪(BD公司，FACS Calibur)检测，激发光为488nm，每次收10,000个细胞。
上述实验结果(见图13)显示，CEA-TsAb与各种肿瘤细胞的结合能力不同与SKOV3、SW1116有较强结合；与A549发生较弱结合；与MCF-7不发生结合。
实施例7FACS(流式细胞术)方法检测CEA-TsAb与外周血淋巴细胞(PBMC)和Jurkat细胞的结合活性我们还采用直接FACS的方法检测CEA-TsAb对外周血淋巴细胞(PBMC)(购自北京市输血中心)和Jurkat细胞的结合活性。具体实验操作如下(1)将CEA-TsAb标记荧光素FITC(Sigma公司)。荧光标记方法按照《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编，湖北科学技术出版社出版)所述操作。
(2)采用Ficol方法提取PBMC(外周血淋巴细胞)，并在含有10％新生牛血清的RPMI 1640培养基中，在玻璃细胞培养瓶中，37℃放置过夜，吸附并去除巨噬细胞等粘附细胞。将未吸附的细胞(主要是T淋巴细胞)计数后，收集5×105个细胞，用于FACS检测。Ficol方法方法《现代免疫学实验技术》(沈关心 周汝麟 主编，湖北科学技术出版社出版)所述操作。
(3)采用含有10％新生牛血清的RPMI1640培养基，在37℃CO2(5％)培养箱中培养两种细胞。待细胞生长至对数期后，收集5×105个细胞，用于FACS检测。
(4)将上述两种细胞1,000g离心10分钟后，使用PBS悬浮细胞，再次1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在100μl含有10μg/ml FITC标记CEA-TsAb的PBS中，4℃放置30分钟。每种细胞均设立不加抗体的同型对照，该对照以下各步均与待测样品同样操作。
(5)流式细胞仪(BD公司，FACS Calibur)检测，激发光为488nm，每次收10,000个细胞。
上述实验结果(见图14)显示CEA-TsAb与两种细胞均能发生特异结合。
综合CEA-TsAb与肿瘤细胞的结合特异性实验，CEA-TsAb与PBMC及Jurkat细胞的结合特异性实验，可以得出结论CEA-TsAb与T淋巴细胞和表达CEA的肿瘤细胞均能发生特异结合作用。
实施例8MTT方法检测CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤结肠癌细胞SW1116的活性我们以与CEA-TsAb发生特异结合的结肠癌细胞SW1116为靶细胞(Target cells)，以PBMC为效应细胞(Effect cells)，在体外按照一定的效靶比(靶细胞/效应细胞，E/T)混合，同时添加一定浓度的CEA-TsAb，然后在37℃培养48小时，再采用MTT方法测定肿瘤细胞的存活情况。以此检测CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤结肠癌细胞SW1116的活性。具体操作如下(1)提取收集PBMC，具体操作与实施例7相同。
(2)培养收集SW1116细胞，具体操作与实施例6相同。
(3)使用L15培养基(购自GIBCO公司)调整效应细胞(PBMC)和靶细胞(SW1116)的浓度固定SW1116细胞的密度为1×105个/ml，100l/孔加入到96孔细胞培养板(Nunc公司)中。同时添加不同浓度的PBMC，100l/孔加入到上述细胞培养板中，以分别对应不同的效靶比(分别为1、5、10)。同时使用L15培养基调整CEA-TsAb的浓度5倍浓缩于使用抗体浓度(例如CEA-TsAb使用浓度为1g/ml，那么浓缩液的浓度应为5g/ml)。将抗体浓缩液以50l/孔加入已经加有效应细胞和靶细胞的96孔细胞培养板中，然后在37℃的CO2(5％)培养箱中，培养48小时。每种样品均为4复孔。同时每种效靶比均设立不加抗体的阴性对照，单独效应细胞或靶细胞的阴性对照以及不加任何细胞的培养基阴性对照。
(4)将细胞培养基弃掉后，使用PBS(300l/孔)洗板一次，再加入MTT(Sigma公司)溶液(浓度200l/孔)，37℃孵育4小时后，使用PBS(300l/孔)洗板一次，加入DMSO(二甲基亚砜，200l/孔)(Sigma公司)37℃孵育30分钟后，测定A600。
(5)特异杀伤率(specific cytolysis)的计算公式为特异杀伤率(％)＝[A600(E/T)-A600(E/T/A)]/[A600(E/T)-A600(M)]×100％A600(E/T)每种效靶比不加抗体的阴性对照孔的A600测定值；A600(E/T/A)每种样品的A600测定值；A600(M)不加任何细胞的培养基阴性对照的A600测定值。
采用上述方法我们首先比较了不同效靶比(1、5、10)对CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的效率的影响，结果(图15)显示，杀伤效率并未随着效靶比的提高而提高。效靶比为1时，特异杀伤效率最低；效靶比为10时居次；效靶比为5时特异杀伤率最高。最高特异杀伤率达到85％左右。这说明特异杀伤率不仅与效靶比有关，可能还受其他因素的影响。为了进一步研究抗体浓度对特异杀伤率的影响，我们固定效靶比为5，测定特异杀伤率的抗体浓度(0.4ng/ml-12g/ml)依赖曲线。结果(见图16)发现特异杀伤率的变化分为四个阶段阶段1在6g/ml-12g/ml之间，特异杀伤率与抗体浓度负相关，在12g/ml时，特异杀伤率达到最高；阶段2特异杀伤率与抗体浓度正相关，至750ng/ml时特异杀伤率最低；阶段3在24ng/ml-750ng/ml之间，特异杀伤率与抗体浓度负相关，在24ng/ml特异杀伤率最高；阶段4特异杀伤率与抗体浓度又出现正相关。从整个过程看，特异杀伤率出现两个最大值12g/ml时约为85％；24ng/ml时约为70％。该结果表明，在较低的效靶比和极低的抗体浓度下，CEA-TsAb仍然保持高效介导T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
实施例9CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤SW1116细胞过程的细胞形态观察我们以与CEA-TsAb发生特异结合的结肠癌细胞SW1116为靶细胞(Target cells)，以PBMC为效应细胞(Effect cells)，在体外按照效靶比(E/T)为5混合，同时添加一定浓度(750ng/ml)的CEA-TsAb，在37℃培养20-40小时，再采用OLYMPUS IMT-2倒置显微镜观察效应细胞杀伤肿瘤细胞的情况并进行显微照相。使用40×物镜在第20小时观察并记录，结果(图18)发现CEA-TsAb介导效应细胞杀伤肿瘤细胞的过程可以分为以下四个步骤首先靶细胞逐渐由贴璧变为脱落(图18B)；然后效应细胞聚集在肿瘤细胞的表面(图18C)；随着聚集的效应细胞数目的增加，肿瘤细胞表面开始出现突起(图18D)；最后，细胞的边缘越来越模糊，直至细胞完全破碎死亡(图18E、F、G)。
实施例10CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤SW1116细胞过程中，T淋巴细胞增殖的MTT检测我们采用MTT方法检测T细胞的增殖，以此评估在CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤SW1116细胞过程中，T细胞的活化情况，具体操作如下(1)提取收集PBMC，具体操作与实施例7相同。
(2)培养收集SW1116细胞，具体操作与实施例6相同。
(3)使用L15培养基调整SW1116细胞的浓度为106/ml，然后添加丝裂霉素C(终浓度为25g/ml，SIGMA公司)，37℃CO2(5％)孵箱孵育20分钟后，使用PBS洗3次，除去残余的丝裂霉素C备用。
(4)使用L15培养基调整效应细胞和靶细胞的浓度PBMC为5×105个/ml；SW1116为1×105个/ml。混匀后，100l/孔加入到96孔细胞培养板(Nunc公司)中。同时使用L15培养基调整CEA-TsAb的浓度(抗体使用浓度是终浓度的5倍，例如终浓度是1μg/ml，则此步抗体浓度为5μg/ml)，以50l/孔加入到已经加有效应细胞和靶细胞的96孔细胞培养板中，然后在37℃的CO2(5％)培养箱中，培养4天。设立不加抗体的对照，单独效应细胞或靶细胞的对照以及不加任何细胞的培养基对照。上述检测样品均为4复孔。
(5)1,000g离心10分钟，将细胞培养基上清弃掉，使用PBS(300l/孔)悬浮细胞沉淀，再次1,000g离心10分钟，弃离心上清，再加入MTT溶液(浓度25g/ml，200l/孔)，37℃孵育4小时后，使用PBS(300l/孔)洗板一次，加入DMSO(二甲基亚砜，200l/孔)并37℃孵育30分钟后，测定A600。
(6)特异刺激指数(SIspecific index)的计算公式为SI＝[A600(E/T/A)/A600(E/T)]A600(E/T)不加抗体的对照孔的A600测定值；A600(E/T/A)加抗体的样品孔的A600测定值；如图17所示，随着CEA-TsAb的浓度变化，SI的变化分为三个阶段阶段1抗体浓度在1.5g/ml-12g/ml之间，SI与抗体浓度呈正相关变化，在1.5g/ml达到最低；阶段2SI与抗体浓度呈负相关变化，在47ng/ml左右达到最高；阶段3在小于47ng/ml时，SI与抗体浓度呈正相关变化，在0.7ng/ml时SI最低。该结果表明在较低的抗体浓度时，CEA-TsAb仍然具有活化T淋巴细胞的能力。将SI的变化规律与肿瘤细胞特异杀伤率的变化规律相比较，我们还发现CEA-TsAb介导T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的效率与T细胞的活化程度直接相关，T细胞活化程度越高，杀伤肿瘤细胞的效率越高。
综合实施例4、5、6、7、8、9的实验结果，我们认为在上述杀伤过程中，CEA-TsAb的作用主要体现在两个方面在肿瘤细胞和效应细胞(T淋巴细胞)之间建立直接联系，即发挥导向作用；通过活化聚集在肿瘤细胞周围的效应细胞，发挥杀伤肿瘤细胞的功能。该作用总结为如图19所示的机制模型。即当CEA-TsAb应用于人体后，与T淋巴细胞和表达CEA的肿瘤细胞均能发生特异结合作用，结果起到将T淋巴细胞导向至肿瘤细胞的附近的作用。同时CEA-TsAb通过与CD3和CD28发生特异结合活化T细胞。活化的CTL细胞将直接杀伤肿瘤细胞，而活化的TH细胞通过分泌细胞因子(如IL-2、IFN-γ等)，辅助活化CTL、NK细胞等细胞免疫的效应细胞，间接杀伤肿瘤细胞。
实施例11CEA-TsAb介导的T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的杀伤机制的检测活化的CTL细胞可以通过三种途径杀伤肿瘤细胞一种途径是通过分泌穿孔素在肿瘤细胞表面制造微孔，导致细胞破碎而坏死；另外活化的CTL细胞分泌的颗粒酶由上述微孔进入肿瘤细胞内，诱导肿瘤细胞凋亡；还可以通过活化CTL细胞表面诱导表达的FASL与肿瘤细胞表面的FAS相互作用，诱导肿瘤细胞凋亡。为了具体分析CEA-TsAb介导的T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的杀伤机制，我们采用PI(碘化丙锭)和FITC偶联的Annexin-V(均购自BD公司)标记被杀伤的肿瘤细胞，然后采用荧光显微镜和FACS来观察和检测肿瘤细胞坏死和凋亡的产生情况和相互比例。具体操作如下(1)提取收集PBMC，具体操作与实施例7相同。
(2)培养收集SW1116细胞，具体操作与实施例6相同。
(3)使用L15培养基调整效应细胞和靶细胞的的浓度PBMC和SW1116均为1×105个/ml。混匀后，1.0ml/孔加入到48孔细胞培养板(Nunc公司)中。同时使用L15培养基调整CEA-TsAb的浓度为5g/ml，250l/孔加入到细胞培养孔内，使CEA-TsAb的使用浓度为1g/ml。在37℃的CO2(5％)培养箱中培养20小时。设立不加抗体的对照，单独效应细胞以及单独靶细胞的对照。
(4)将48孔细胞培养板1,000g离心10分钟后，弃培养基上清，使用0.3％胰酶(Sigma公司)(w/v)消化贴壁细胞1分钟(50l/孔)，补加10％新生牛血清的RPMI1640(1ml/孔)，将细胞轻轻吹打成细胞悬浮液，转移到1.5ml离心管中，1,000g离心10分钟。
(5)使用PBS(500l/管)洗细胞一次，再加入结合缓冲液(购自BD公司)(100l/管)悬浮细胞沉淀，每管补加5l PI溶液(50g/ml)和3lFITC-Annexin-V溶液，4℃避光15分钟。
(6)每管补加300l结合缓冲液，取少量细胞制细胞压片，采用Leica DMRA2荧光显微镜观察杀伤的肿瘤细胞的形态和荧光标记状况。使用QFISH软件(Leica公司)进行分析。结果如图20所示。
(7)使用BD FACS Calibur进行双色荧光检测(FL1和FL2)。条件共收集20,000个细胞，激发光波长为488nmol/L，。结果如图21所示图21显示了早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞的差别。早期凋亡细胞表面仅有绿色荧光(FITC)，晚期凋亡细胞表面同时存在绿色和红色(PI)两种荧光，坏死细胞表面主要是红色荧光，同时伴有少量绿色荧光。
在图21的上图中，四个分区分别代表四种不同状态的细胞左下区为存活的肿瘤细胞为；右下区为早期凋亡细胞；右上区为晚期凋亡细胞；左上区为坏死细胞。不添加抗体的对照样品中四种状态的细胞比例依次为90.17％、1.66％、2.23％、5.94％；添加抗体后，四种状态的细胞比例依次为52.83％、16.12％、21.25％、9.86％。该结果显示，在添加CEA-TsAb后，活化的T淋巴细胞通过诱导肿瘤细胞坏死和凋亡发挥杀伤效应；与不加抗体的对照相比，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例均提高了近9倍，坏死细胞的比例提高了一倍。
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Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Glu Arg Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Gly Asp Val Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Thr Gly Thr Thr Pro Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ala Thr Ser Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro115 120 125Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn Ser Gly Ser Arg Asp Ile Val Leu130 135 140Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr145 150 155 160Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Thr Tyr165 170 175Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile180 185 190Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly195 200 205
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Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp100 105 110Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Gln130 135 140Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val145 150 155 160Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp165 170 175Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr180 185 190Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser195 200 205Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile210 215 220Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala225 230 235 240Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala245 250
<210>3<211>2103<212>DNA<213>人工合成<400>3atgggtctcg agcaggtgca gctgcagcag agcggtgcgg aactgatgaa accgggcgcg 60agcgtgaaaa tcagctgcaa agcgaccggc tataccttca gcgattattg gatcgaatgg 120gtgaaacagc gtccgggtca cggcctggaa tggatcggtg aaatcctgcc gggcagcggc 180cgtaccgact acaacgaacg tttcaaaggc aaagcgacct tcaccggcga cgtttctagc 240aacaccgcgt atatgaaact gtctagcctg accagcgaag atagcgcggt gtattactgc 300gcgaccggca ccaccccgtt cggttactgg ggtcagggca ccctggttac cgtttccgcg 360actagtaccc cgagccataa cagccatcag gtgccgagcg cgggcggccc gaccgcgaac 420agcggctcta gagacatcgt gctgacccag agcccggcga gcctggcggt gtctctgggt 480cagcgtgcga ccatctcctg ccgtgcttcc cagtccgttt ccacctcctc ctacacctac 540atgcactggt atcagcagaa accgggtcag ccgccgaaac tgctgatcaa atatgcgagc 600aacctggaat ctggtgtgcc ggcgcgtttc agcggttctg gcagcggcac cgacttcacc 660ctgaacatcc acccggtgga agaagaagat accgcgtatt actattgcca gcactcttgg 720gaaatcccgc gtaccttcgg tggcggcacc aaactggaaa tcaaagaatt caacagcacg 780taccgggttg taagcgtcct caccgtactg caccaggact ggctgaatgg caaggaatac 840aaatgcaaga gtactgaggt gaagctggtg gagtctggac ctgagctggt gaagcctgga 900gcttcaatga agatatcctg caaggcttct ggttactcat tcactggcta caccatgaac 960tgggtgaagc agagtcatgg aaagaacctt gagtggatgg gacttattaa tccttacaaa1020
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<213>人工合成<400>32tgtctagcct gaccagcgaa gatagcgcgg tgtattactg cgcgaccggc accaccccg 59<210>33<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>33gctcacggtc accagggtgc cctgacccca gtaaccgaac ggggtggtgc cggtcgcgca 60<210>34<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>34gcaccctggt gaccgtgagc gcgactagta ccccgagcca taacagccat caggtgccg 59<210>35<211>59<212>DNA<213>人工合成
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权利要求
1.一种单链三特异抗体，其特征在于由抗肿瘤相关抗原的抗体、FC连接肽、抗人CD3抗体、HSA连接肽、抗人CD28抗体依次连接而成。
2.权利要求1所述的单链三特异抗体，其中所述抗肿瘤相关抗原的抗体、抗人CD3抗体、抗人CD28抗体可以为单链抗体片段、抗体Fab片段或单域抗体片段。
3.权利要求1所述的单链三特异抗体，其特征在于所述单链三特异抗体的C末端具有c-myc标签和/或组氨酸标签。
4.权利要求1所述的单链三特异抗体，其中所述肿瘤相关抗原是癌胚抗原。
5.权利要求1所述的单链三特异抗体，其是由抗癌胚抗原单链抗体、FC连接肽、抗人CD3单链抗体、HSA连接肽和抗CD28抗体重链片段依次连接构成的CEA-TsAb，具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
6.一段DNA序列，其特征在于编码权利要求1-5任一项的单链三特异抗体。
7.权利要求6的DNA序列，其是编码权利要求5的单链三特异抗体的DNA序列，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
8.权利要求5的单链三特异抗体，其特征在于所述抗癌胚抗原单链抗体具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
9.权利要求5的单链三特异抗体，其特征在于所述抗人CD3单链抗体具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
10.一种表达载体，其特征在于含有权利要求6或7的DNA序列。
11.权利要求10的表达载体，其是CEA-TsAb/pTRI。
12.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求10的表达载体。
13.权利要求12的宿主细胞，其是大肠杆菌。
14.一种促进单链三特异抗体胞内可溶表达的方法，其特征在于将处于对数生长期的含编码所述单链三特异抗体的DNA序列的宿主细胞用IPTG于30℃诱导表达，所述IPTG的终浓度为0.4mmol/ml。
15.权利要求14的方法，其中所述宿主细胞是含权利要求11的CEA-TsAb/pTRI的大肠杆菌BL21。
16.一种纯化单链三特异抗体的方法，其特征在于用DEAE阴离子交换树脂纯化用权利要求14的方法获得的单链三特异抗体。
17.一种用于治疗或预防肿瘤的药物组合物，其特征在于包含权利要求1-5任一项的单链三特异抗体和药用载体。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述肿瘤为表达癌胚抗原的肿瘤。
19.权利要求1-5任一项的单链三特异抗体在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
20.权利要求19的应用，其中所述肿瘤为表达癌胚抗原的肿瘤。
全文摘要
本发明涉及一种重组单链三特异抗体，其特征在于由抗肿瘤相关抗原的抗体、FC连接肽、抗人CD3抗体、HSA连接肽、抗人CD28抗体依次连接而成。更具体地，本发明涉及抗CEA、抗CD3、抗CD28的重组单链三特异抗体CEA－TsAb，该抗体是将三种抗体片段(抗CEA单链抗体、抗CD3单链抗体和抗CD28单域抗体)通过两种连接肽(FC连接肽和HSA连接肽)串联在一起构建而成，并可在其C端添加c－myc标签和组氨酸标签((His)
文档编号A61P35/00GK1563092SQ200410032158
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月1日 优先权日2004年4月1日
发明者王祥斌, 黄华樑, 赵宝峰, 赵琦, 朴锦华, 林晴 申请人:北京安波特基因工程技术有限公司