Btrc基因的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体设及BTRC基因用于制备预测鼻咽癌复发 和转移，W及防止鼻咽癌复发和转移的制剂的应用方法。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌（化so地aryngealCarcinoma,NPC)是我国南方地区常见的头颈部恶性肿 瘤，由鼻咽粘膜上皮发生恶性转化而来，大多数为低分化鱗状细胞癌，恶性程度高且发病部 位隐蔽，特别是发生在咽隐窝和鼻咽顶部的患者早期症状不明显，因而难W早期发现，误诊 误治率较高；另外鼻咽癌极易发生转移，初诊患者颈部淋己结转移率高达80%。放射治疗 是目前鼻咽癌临床上最常用的治疗手段，60~70 %的患者能取得较好的疗效，但仍有20~ 30%的患者会出现复发和转移。复发和转移是临床上导致鼻咽癌患者死亡的主要因素之 一，且放化疗对治疗鼻咽癌的复发、转移效果不理想，因此，筛选新的鼻咽癌早期转移及预 后判断的分子标记物，对于鼻咽癌的临床治疗有着重要的指导意义，同时相比较传统的放 化疗手段，生物治疗的方法更适合复发和转移鼻咽癌的治疗，其中基因疗法对防治鼻咽癌 的复发、转移具有更重要而广阔的临床应用前景，筛选鼻咽癌基因治疗的祀点也同样意义 重大。
[0003] 我们通过基因忍片技术，筛选到了BTRC基因（GenebankGene10:8945 ;参考序列： NM033637. 3)在鼻咽癌中表达下调。迄今为止有关BTRC与鼻咽癌发生发展中的作用的关 系及其在鼻咽癌病人的早期筛查、辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文献报道。我们通 过研究表明，BTRC在鼻咽癌组织中的表达水平与鼻咽癌的侵袭转移及预后密切相关，鼻咽 癌组织中BTRC基因表达水平较低的患者更容易复发和转移，因而生存时间较BTRC基因表 达水平高的患者更短。表明BTRC基因可W作为鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断等的 分子标记，针对BTRC设计专用巧光实时定量PCR引物、原位杂交探针及免疫组织化学检测 试剂盒等，用于检测鼻咽癌组织中BTRC的表达水平有望为临床上对鼻咽癌进行复发和转 移的预测提供参考。
[0004] 此外，我们在鼻咽癌细胞中转染人工合成的BTRC基因干扰序列（siRNA)W抑制 BTRC基因的表达，证实在鼻咽癌细胞株中下调BTRC基因的表达可W促进鼻咽癌细胞的 侵袭转移；通过设计并构建BTRC基因的过表达载体，成功地在鼻咽癌细胞中表达BTRC基 因，可W有效地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力；通过一系列研究，申请人进一步证实 了BTRC基因编码一个名为β-TrCP化eta-transducinrepeatcontainingE3ubiquitin proteinligase)的E3 泛素蛋白连接酶巧3ubiquitinproteinligase)，P-TrCP是细 胞内蛋白经泛素化途径降解过程中的关键酶之一，可较特异地调控它的底物β-catenin 和Snail经泛素化途径降解，从而维持β-catenin和Snail运两个蛋白在细胞中的含量。 β-catenin、Snail是细胞上皮-间质转换（epithelial-mesenchymaltransition,EMT) 过程中的关键调控因子，而上皮-间质转换又是肿瘤细胞发生侵袭转移的最为关键的第一 步。因此，申请人通过研究证实了鼻咽癌细胞中BTRC表达下调，导致其编码的β-TrCP蛋 白量减少，β-TrCP的底物β-catenin和Snail的降解减慢，造成β-catenin和Snail在 细胞内聚集，推动了鼻咽癌细胞的上皮-间质转换，使鼻咽癌细胞具备更强的侵袭与转移 能力，从而表现为鼻咽癌患者的复发转移，最终导致患者死亡。在鼻咽癌细胞中通过基因工 程的手段重新表达BTCR，则可W明显地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力。因此，BTRC基 因W及其下游包括β-catenin和Snail在内的细胞上皮-间质转换相关信号通路又可W 成为鼻咽癌基因治疗的潜在祀点，特别是BTRC过表达载体在鼻咽癌的基因治疗中具有重 要的应用前景。将BTRC基因过表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒上制成纳米 基因转运体，多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒可保护BTRC基因过表达载体免受核酸酶降解， 延长作用时间，且有更高的转染效率。进而为制备防治鼻咽癌的复发和转移的制剂提供新 的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供BTRC基因的应用方法。
[0006] BTRC基因的应用方法，用于制备预测鼻咽癌复发和转移的制剂。
[0007] 所述的BTRC基因的表达与鼻咽癌复发和转移成负相关。
[0008] 所述的预测鼻咽癌复发和转移的制剂包括：PCR检测试剂、原位杂交检测试剂或 免疫组织化学试剂。
[0009] PCR检测试剂为巧光实时定量PCR试剂。
[0010] 巧光实时定量PCR试剂所用的引物包括：
[0011] BTRCforward, 5' -CCCCTTCTCGAACATACACCT-3'，
[0012] BTRCreverse, 5'-AGTCTCAAAGCCCTGCTCCT-3'
[0013] GAP畑forward, 5> -AACGGATTTGGTCGTATTGG-3>，
[0014] GAPDHreverse, 5' -TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3,。
[0015] 原位杂交检测试剂的寡核巧酸探针及阳性对照的寡核巧酸探针，序列如下：
[0016] BTRC探针 1 :5' -GTCTAAGTGAATTCTTCTCTGGTATTATCT-3'
[0017] BTRC探针 2 :5' -GTACTTGTGTTCCATACCTTTATAGTTCTA-3'
[0018] BTRC探针 3 :5' -ATCTCCAATTAGATTCTATTGTCTCAATGT-3'
[0019] GAP畑探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
[0020] GAP畑探针 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'
[0021] GAP畑探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。
[0022] BTRC基因的应用方法，还能用于制备防止鼻咽癌复发和转移的制剂。具体是用于 制备BTRC基因表达产物β-TrCP的底物β-catenin和Snai1的降解的制剂。更具体是用于 制备抑制上皮-间质转换制剂。该制剂促进BTRC基因的表达能使上皮细胞的标志物Z0-1、 E-ca化erin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、N-ca化erin、Vimentin 及Slug的表达降低。
[0023] 本发明研究表明，BTRC在鼻咽癌组织中的表达水平与鼻咽癌的侵袭转移及预后成 负相关，鼻咽癌组织中BTRC基因表达水平较低的患者更容易复发和转移，因而生存时间较 BTRC基因表达水平高的患者更短。表明BTRC基因可W作为鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预 后判断等的分子标记，针对BTRC设计专用巧光实时定量PCR引物、原位杂交探针及免疫组 织化学检测试剂盒等，用于检测鼻咽癌组织中BTRC的表达水平有望为临床上对鼻咽癌进 行复发和转移的预测提供参考。
[0024] 本发明还证实在鼻咽癌细胞株中下调BTRC基因的表达可W促进鼻咽癌细胞的侵 袭转移；通过设计并构建BTRC基因的过表达载体，成功地在鼻咽癌细胞中表达BTRC基因， 可W有效地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力。进而为制备防治鼻咽癌的复发和转移的制 剂提供新的途径。
【附图说明】
[00巧]图1为利用基因忍片技术从6例正常鼻咽上皮组织和10例鼻咽癌组织中筛选得 到的差异表达基因图谱；
[0026] 共筛选得到差异表达基因2461个，其中在鼻咽癌中表达上调的基因与1677个，在 鼻咽癌中下调的基因有784个；N代表正常鼻咽上皮组织，T代表鼻咽癌组织。
[0027] 图2为基因忍片数据中BTRC基因在正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织中的表达情 况，BTRC基因在鼻咽癌组织中的表达明显下调（P= 0. 001);
[0028]N代表正常鼻咽上皮组织，T代表鼻咽癌组织。
[0029] 图3为利用巧光实时定量PCR技术验证了BTRC基因在正常鼻咽上皮组织和鼻咽 癌组织中的表达情况，BTRC基因在鼻咽癌组织中的表达明显下调（P<0. 05);
[0030]N代表正常鼻咽上皮组织（共9例），T代表鼻咽癌组织（共28例）。
[0031] 图4为免疫组织化学方法检测BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[003引正常鼻咽上皮（Non-tumorNP巧中BTRC表达水平较高（positive)，而在106例鼻 咽癌（NPC)中有48例检测到BRTC的低表达化OW)，其余58例为高表达Oii曲）。
[0033] 图5为原位杂交检测BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0034] 原位杂交的结果与免疫组织化学结果具有很高的一致性。
[003引图6为鼻咽癌中BTRC的表达与鼻咽癌患者预后的关系；
[0036] 鼻咽癌中BTRC的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，BTRC高表达化i曲）的患 者不论无病生存时间值isease化eesurvival,DFS，左）还是总的生存时间（Overall survival,0S，右）都要明显长于BTRC低表达(X〇w)的患者。
[0037] 图7为在鼻咽癌细胞Η肥2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体度TRC0巧和 RNA干扰序列（siBTRC)后，实时巧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中BTRC的表达情况 (mRNA水平），导入BTRC过表达载体后，BTRC基因的表达显著升高（左），而导入RNA干扰 序列后，BTRC基因的表达显著降低（右），NC为阴性对照（negativecontrol)。
[0038] 图8为在鼻咽癌细胞Η肥2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体度TRC0巧和 RNA干扰序列（siBTRC)后，Westernbloting方法检测了鼻咽癌细胞中BTRC的表达情况 (蛋白水平），导入BTRC过表达载体后BTRC基因的表达显著升高（左），而导入RNA干扰序 列后BTRC基因的表达显著降低（右），NC为阴性对照（negativecontrol)。
[0039] 图9为在鼻咽癌细胞Η肥2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体度TRC0巧和 RNA干扰序列（SiBTRC)后，细胞穿膜（transwell)实验证实，人为促进BTRC的表达后，能穿 过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著降低，表明细胞侵袭能力减弱