非人类四元转基因动物的制作方法

专利名称：非人类四元转基因动物的制作方法
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阿尔茨海默病(AD)是神经退行性疾病，其特征在于记忆丧失和认知功能降低。在 超过65岁后AD患病率每五年大约增加一倍。整体上，大约5-10 %的这些65岁以上人群 被影响到。临床诊断AD仅限于排除诊断。只有在死亡之后，通过脑显微检查含有淀粉样 蛋白β (Α-β)肽的纤维的胞外斑块和含有多聚化、磷酸化Tau蛋白的胞内纠结的存在才 能确诊。在多数病例中，AD发病较晚且属于偶发病例。早期发病的家族型AD代表了一小 部分病例，但它们对于增进对疾病机理的理解具有极端重要性。已知的突变是瑞典突变 型(Swedish Mutation) (SFAD)，其影响密码子 670/671 (K670+N 和 M671+L)，和伦敦突变型 (London Mutation)，其影响APP的密码子717。所有这些突变均影响APP的蛋白裂解加工， 产生更多淀粉样蛋白生成肽。APP能被至少3种分泌酶(α -、β -和、-分泌酶)加工。β -分泌酶通过在甲硫 氨酸671 (ΑΡΡ770编号)后切割APP起始了 A-β肽产生，所述切割导致了 12kd仍保留在膜 上的羧末端片段。12kd片段然后遭受Y-分泌酶在疏水跨膜结构域内的切割，释放了 40、42 或43残基Α-β (SeubertP, Vigo-Pelfrey C,Esch F,Lee Μ,Dovey H,Davis D, Sinha S, Schlossmacher Μ,Whaley J,Swindlehurst C. Isolation and quantificationof soluble Alzheimer' s beta-peptide from biological fluids. Nature. 1992. 359 :325_7)。当前的AD治疗仅能提供一般症状缓解。对减缓该病病程并阻止或延缓易感个体 中该病的疾病改良剂高度存在尚未满足的医学需求。开发这样的药剂需要对该病分子基础 的理解和动物模型的开发的进展等等。已知大量过表达与AD相关蛋白的转基因品系，例如过表达APP伦敦突变型和β 分泌酶的二元转基因小鼠。本发明提供非人类转基因动物，其基因组包含a)编码包含与阿尔茨海默病(AD) 或AD型病理学相关的突变的人APP蛋白的第一转基因DNA序列，其中所述第一转基因DNA 序列被有效地连接到第一启动子；b)编码包含与阿尔茨海默病(AD)或AD型病理学相关突 变的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列，其中所述第二转基因DNA序列被有效连接到第 二启动子；c)编码定向抗淀粉样蛋白肽的人抗体轻链的第三转基因DNA序列，其中所述第 三转基因DNA序列被有效连接到第三启动子；及编码所述人抗体的重链的第四转基因DNA 序列，其中所述第四转基因DNA序列被有效连接到第四启动子或第三启动子。术语“阿尔茨海默病(AD)病理学”指AD患者中的病理改变，例如丧失神经元突触 密度和突触数目，认知能力降低和记忆丧失。它们也包括脑中弥散性和神经性斑块，其主要 由淀粉样蛋白β肽、神经元和/或神经胶质包涵物或不可溶沉积物组成，其用抗A β抗体 染色呈阳性。特别地，本发明提供了非人类转基因动物，其基因组包含a)编码人APP瑞典突变型或人APP伦敦突变型蛋白的第一转基因DNA序列，其中 所述第一转基因DNA序列被有效地连接到第一启动子；b)编码包含N141I取代的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列，其中所述第二转基因DNA序列被有效连接到第二启动子；C)编码定向抗人淀粉样蛋白肽的人抗体的轻链的第三转基因DNA序列，其中所述 第三转基因DNA序列被有效连接到第三启动子；及d)编码所述人抗体的重链的第四转基因DNA序列，其中所述第四转基因DNA序列 被有效连接到第三启动子或第四启动子。本发明也涉及如本发明所提供的非人类转基因动物的后代，通过与相同或其他基 因型动物繁殖而获得。优选地，该后代通过与相同基因型动物繁殖而获得。所述后代包含 与如上所述四元非人类动物的转基因DNA序列相同的转基因DNA序列。此外，本发明涉及源自如上所述的四元非人类转基因动物或其后代的细胞系或原 代细胞培养物。此外，本发明也提供源自如上所述的四元非人类转基因动物或其后代的组织或器 官外植体或其培养物。本发明也提供源自如上所述的非人类转基因动物或其后代的组织或细胞提取物。本发明也提供产生非人类转基因动物的方法，所述转基因动物的基因组包含编码 人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型、包含N141I取代的人早老蛋白2和定向抗β淀粉样 蛋白肽的人抗体的重链和轻链的转基因DNA，所述方法包括a)共注射包含编码人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型的所述第一转基因DNA序 列的遗传构建体和包含编码具有W41I取代的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列的遗传 构建体到非人类受精卵或非人类胚胎干细胞，并从所述受精卵或胚胎干细胞产生二元非人 类转基因动物；b)共注射包含第三转基因DNA序列(编码定向抗淀粉样蛋白肽的人抗体的轻链) 的遗传构建体和包含编码所述人抗体的重链的第四转基因DNA序列的遗传构建体到非人 类受精卵或非人类胚胎干细胞，并从所述受精卵或胚胎干细胞产生二元非人类转基因动 物，c)将a)和b)的转基因动物进行交配并因而产生四元非人类转基因动物，其基因 组包含编码人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型、包含N141I取代的人早老蛋白2、定向抗 β淀粉样蛋白肽的人抗体的重链和轻链的转基因DNA。可选地，在上述方法的步骤c)中，第三和第四转基因DNA序列可位于相同的构建 体上。本发明也提供产生非人类转基因动物的方法，该动物表达人APP瑞典突变型或 APP伦敦突变型、包含N141I取代的人早老蛋白2和定向抗β淀粉样蛋白肽的人抗体的重 链和轻链，所述方法包括a)共注射包含编码人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型的所述第一转基因DNA序 列的遗传构建体，其中所述第一转基因DNA序列被有效连接到第一启动子，和包含编码具 有W41I取代的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列的遗传构建体到非人类受精卵或非人 类胚胎干细胞中，其中所述第二转基因DNA序列被有效连接到第二启动子，并从所述受精 卵或胚胎干细胞产生二元非人类转基因动物；b)共注射包含第三转基因DNA序列(其编码定向抗人淀粉样蛋白肽的人抗体的轻 链)的遗传构建体，其中所述第三转基因DNA序列被有效连接到第三启动子，和包含编码所述人抗体的重链的第四转基因DNA序列的遗传构建体到非人类受精卵或非人类胚胎干细 胞，其中所述第四转基因DNA序列被有效连接到第四启动子，并从所述受精卵或胚胎干细 胞产生二元非人类转基因动物，c)将a)和b)的转基因动物进行交配并因而产生四元非人类转基因动物，其表达 人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型、包含m41I取代的人早老蛋白2、定向抗β淀粉样蛋 白肽的人抗体的重链和轻链。可选地，在上述方法的步骤c)中，第三和第四转基因DNA序列可位于相同的构建 体上，且有效连接到第三启动子。本发明进一步提供上述方法产生的四元非人类转基因动物。APPAPP指淀粉样蛋白前体蛋白。已经鉴定了大量APP的cDNA形式，其中编码了三种最 丰富的同种型APP695、APP751和APP770。这些形式通过不同的拼接从一条前体RNA而来。 该基因长度超过 175kb，具有 18 个外显子(Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakaki Y. Genomicorganization of the human amyloid beta-protein precursor gene. Gene. 1990. 87(2) 257-63) 0 APP含有胞外结构域、跨膜区和胞质结构域。A-β由恰好位 于疏水跨膜结构域外的至多28个氨基酸和该跨膜结构域的至多15个氨基酸组成。因此， A-β是源自APP的切割产物，其在脑和其他组织如心脏、肾脏和脾脏中正常发现。然而，通 常仅可在脑中见到大量的A-β沉积物。较大的APP替代形式(ΑΡΡ751、ΑΡΡ770)由ΑΡΡ695 及一个或两个其他结构域组成。ΑΡΡ751由ΑΡΡ695的所有695个氨基酸及其他56个与丝 氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz家族(KPI)具有同一性的氨基酸组成(Tanzi RE,McClatchey Al, Lamperti ED, Villa-Komaroff L, Gusella JF, Neve RL. Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursormRNA associated with Alzheimer ' s disease.Nature. 1988. 331:528_30 ；Weidemann A,Konig G, Bunke D, Fischer P, Salbaum JM, Masters CL, Beyreuther K. Identification, biogenesis, and localization of precursors ofAlzheimer' s disease A4 amyloid protein. Cell. 1989 Apr 7 ；57 (1) 115-26. Kitaguchi N,Takahashi Y,Tokushima Y,Shiojiri S,Ito H. Novel precursorof Alzheimer ' s disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature. 1988. Feb 11 ；331 (6156) 530-2. ；Tanzi RE, St George-Hyslop PH, Haines JL, Polinsky RJ, Nee L, Foncin JF, Neve RL, McClatchey ALConneally PM, Gusella JF. The genetic defect in familial Alzheimer ' s diseaseis not tightly linked to the amyloid beta-protein gene. Nature. 1987. 329(6135) :156_7)。APP770 含有 APP751 的所 有751个氨基酸及其他19个与神经元细胞表面抗原0X-2同源的氨基酸结构域(Weidemarm 等人，1989 ；Kitaguchi等人，1988)。除非另外指明，本文所提及的氨基酸位置是当它们出 现在APP770中时的位置。由于缺少0X-2和KPI结构域，在APP695和APP751中同等位置 的氨基酸编号在某些情况下不同。按照惯例，所有形式APP的氨基酸位置以等同于APP770 形式的位置提及。除非另外指明，本文遵循该惯例。除非另外指明，本文提及的所有形式的 APP和APP片段，包括所有形式的A-β，基于人APP氨基酸序列。APP通过移除引导序列和 加上硫酸及糖基而被翻译后修饰。术语“ΑΡΡ”也包括突变的APP^f^n APP瑞典突变型和 APP伦敦突变型。
包含与阿尔茨海默病(AD)或AD型病理学相关突变的人APP蛋白优选是APP瑞典 突变型和APP伦敦突变型。如本文所用，术语“APP瑞典突变型”指如上所定义包含K670N/M671L取代的APP 同种型。优选地，人APP瑞典突变型由SEQ ID NO :1所编码。 如本文所用，术语“APP伦敦突变型”指如上所定义包含一个或多个天然或人工突 变的APP同种型，所述突变影响淀粉样蛋白肽的生产倾向于Α-β 42肽生产的特异性增加。 优选的是围绕Y "分泌酶切割位点与病理学相关的天然APP突变，包括-Τ7141 (Kumar-Singh S 等人 Hum Mol Genet. 2000 Nov 1 ；9 (18) :2589_98·)-V715M(Ancolio K,等人，Proc Natl Acad Sci U S Α. 1999 Mar30 ；96 (7) 4119-24.)-I716V(Eckman CB，等人，Hum Mol Genet. 1997 Nov ；6(12) :2087_9·)-V717F(Murrell J, et al, Science. 1991 Oct 4 ；254(5028) :97_9·)-V717G (Chart i er-Har 1 in MC，等人，Nature. 19910ct 31 ；353(6347) :844_6·)-V717I(Goate A，等人，Nature. 1991 Feb 21 ；349 (6311) 704-6)-V717L (Murrell JR，等人，Arch Neurol. 2000 Jun ；57 (6) :885_7·)-L723P (Kwok JB，等人，Ann Neurol. 2000Feb ；47 (2) :249_53·)也优选人工突变(在A-β结构域外跨膜区中所有残基的取代)，其例子和其关于 Y-分泌酶切割的后果由Lichtenthaler和其合作者描述(Lichtenthaler SF, et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar16 ；96 (6) :3053_8)。更优选地，人APP伦敦突变型是包含天然V717F突变的人APP伦敦突变型。最优 选地，人APP伦敦突变型由SEQ ID NO 3所编码。优选地，第一转基因DNA序列编码人APP瑞典突变型。早老蛋白2(PS2)早老蛋白2 (PS)是γ -分泌酶复合物的一个蛋白。在APP的加工中涉及、~分泌 酶(参见图1)。如本文所用，术语“编码早老蛋白2的DNA序列”或“PS2基因”指在1995年6月 28日申请的美国专利申请序号08/496，841中第一次披露和公开并在稍后由Rogaev等人 (Nature. 1995 ；376 (6543) :775_8)和 LevyLahad 等人(Ann Neurol. 1995 ；38 (4) :678_80) 描述的哺乳动物基因，包括任何等位变体和异种特异性哺乳动物类似物。在本文中公开了 一条人早老蛋白_2(hPS2)cDNA序列，其序列如SEQ ID NO 9所示。术语“早老蛋白-2基因”或“PS2基因”主要涉及编码序列，但也能包括某些或所 有位于两端的调节区和/或内含子。特别地，术语PS2基因包括从cDNA或基因组DNA创制 的人工或重组基因，包括基于拼接变体的重组基因。早老蛋白_2基因也被称为E5-1基因。包含与阿尔茨海默病(AD)或AD型病理学相关突变的人早老蛋白2优选是具有 N141I、T122P、M239V 或 M239I 取代的人 PS2(Shen 等人，PNAS,2007,104(2) 403-409)。更 优选地，包含与阿尔茨海默病(AD)或AD型病理学相关突变的人早老蛋白2是具有N141I 取代的人PS2。因此，第二转基因DNA序列优选编码具有N141I取代的人PS2。最优选的是编码 SEQ ID NO 19 的 DNA 序列。
抗体抗体是“Y”形分子并由两条重链和两条轻链组成。存在重链和轻链的不同类型和 亚型。每一条重链和每一条轻链均具有恒定区和可变区，其中重链的恒定区大小更大。术语“恒定区”或“C区”指这样发抗体分子区域，其与相同物种生物产生的具有不 同特异性的抗体的相应区域基本相同。恒定部分在相同抗体类别(同种型)内不可变，起 特定免疫球蛋白亚类的效应物功能。Fc片段是通过用木瓜蛋白酶切割抗体而产生并包含恒 定区的绝大部分的抗体片段。如本文所用，术语“可变区”指结合特异性抗原的抗体分子区域。它由重链和轻链 的抗原结合位点的组合所组成。它在不同B细胞的免疫球蛋白间不同，但在相同B细胞产 生的所有免疫球蛋白间相同。可变区经由B细胞成熟过程中发生的基因重组过程而在体内 产生。正是该重排的过程产生了结合任何给定抗原所需的无数多样性并因此使免疫系统能 识别和中和无数外源和病理结构所赋予的抗原负担。作为结果，抗体库由携带不同V区的 巨大的所有组成部分并同时有相同Fc部分的免疫球蛋白组成。术语“抗原结合片段”或“Fab片段”是包括可变的、抗原结合区且用木瓜蛋白酶切 割抗体而产生的抗体片段。如本文所用，术语“独特型区”指对每一种抗体类型独特的抗体可变区部分。第三转基因核苷酸序列编码定向抗β淀粉样蛋白肽的抗体的轻链。优选地，所述 抗体是人、人源化或嵌合抗体。更优选地，所述抗体是免疫球蛋白Y (IgG)。最优选地，所述 抗体是治疗性抗体Mabll(W0 03/070760)。第四转基因核苷酸序列编码定向抗β淀粉样蛋白肽的抗体的重链。优选地，所述 抗体是人、人源化或嵌合抗体。更优选地，所述抗体是免疫球蛋白Y (IgG)。最优选地，所述 抗体是治疗性抗体Mabll(W0 03/070760)。术语“β淀粉样蛋白肽”或“Α-β ”指通过用β-分泌酶和Y-分泌酶切割APP生 产的肽。该肽具有39-43个氨基酸。它是阿尔茨海默病患者脑淀粉样蛋白斑块的主要组成 成分。优选地，淀粉样蛋白肽是人淀粉样蛋白肽。优选地，第四转基因核苷酸序列编码分泌型抗体的重链。这样的优选DNA序列缺 少编码跨膜结构域的序列。第三和第四转基因DNA序列可与一个启动子有效连接(即与第三启动子连接)或 它们可分别与单独的启动子有效连接(即第三转基因DNA序列与第三启动子有效连接，第 四DNA序列与第四启动子有效连接)。启动子如本文所用，术语“有效连接”指，当合适的转录激活子蛋白被结合到调控序列上 时，DNA序列和调控序列以允许基因表达的方式连接。如本文所用，术语“调控序列”指这样的核苷酸序列，其是调控蛋白质表达的蛋白 质结合位点。调控序列的例子如启动子或增强子。如本文所用，术语“启动子”指结合RNA聚合酶和转录因子以启动转录的基因区 域。如本文所用，术语“增强子”指通过增加位于同一 DNA分子上最接近的启动子的活 性而增加遗传转录速度的核苷酸序列。
第一启动子可以是在神经元中表达有效连接的DNA的任何启动子。第一启动子可 以是遍在型启动子。优选地，第一启动子是神经元启动子。更优选地，第一启动子是脑特异 的启动子。术语“组织特异性启动子”指以组织特异性方式调控和指导基因表达的启动子，例 如在脑组织、肌肉组织、肝脏组织、肾脏组织等中调控和指导基因表达。脑特异性启动子是 在脑组织中调控和指导基因表达的启动子。最优选地，第一启动子是朊病毒基因的启动子。第一启动子也可以是可控启动子。可控启动子可以是任何控制转基因以可调控和 /或可诱导方式表达的启动子，例如通过加入特异性诱导剂或抑制剂底物。本领域已知多个 可诱导细菌启动子(Schultze N,Burki Y,Lang Y,Certa U,Bluethmann H ；Nat Biotechnol 1996 ； 14(4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption !applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71(1) :19-27 ；Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian celllines. Biotechniques. 1998 ；24 (4) :624_8，630—2)。第二启动子可以是任何使有效连接的DNA在神经元中表达的启动子。第一启动子 可以是遍在型启动子。优选地，第二启动子是神经元启动子。更优选地，第二启动子是脑特 异性启动子。术语“组织特异性启动子”指以组织特异性方式调控和指导基因表达的启动子，例 如在脑组织、肌肉组织、肝脏组织、肾脏组织等中调控和指导基因表达。脑特异性启动子是 在脑组织中调控和指导基因表达的启动子。最优选地，第二启动子是Thyl. 2糖蛋白启动 子。第二启动子也可以是可控启动子。可控启动子可以是任何以可调控和/或可 诱导方式调控转基因表达的启动子，例如通过加入特异性诱导剂或抑制剂底物。本领域 已知多个可诱导细菌启动子(Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H ； Nat Biotechnol 1996 ； 14 (4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71 (1) 19-27 ；Liu HS, Lee CH,Lee CF,Su IJ,Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian celllines.Biotechniques. 1998 ；24(4) :624_8，630-2)。第三启动子可以是遍在型启动子或淋巴组织特异性启动子。优选地，第三启动子是I型MHC基因的启动子。同样优选地，第三转基因DNA序列 与增强子有效连接。更优选地，增强子是IgH增强子。第三启动子也可以是可控启动子。可控启动子可以是任何以可调控和/或可 诱导方式调控转基因表达的启动子，例如通过加入特异性诱导剂或抑制剂底物。本领域 已知多个可诱导细菌启动子(Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H ； Nat Biotechnol 1996 ； 14 (4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71 (1) 19-27 ；Liu HS, Lee CH,Lee CF,Su IJ,Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian celllines.Biotechniques. 1998 ；24(4) :624_8，630—2)。第四启动子可以是遍在型启动子或淋巴组织特异性启动子。优选地，第四启动子 是I型MHC基因启动子。同样优选地，第四转基因DNA序列与增强子有效偶联。更优选地，增强子是IgH增强子。第四启动子也可以是可控启动子。可控启动子可以是任何以可调控和/或可 诱导方式调控转基因表达的启动子，例如通过加入特异性诱导剂或抑制剂底物。本领域 已知多个可诱导细菌启动子(Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H ； Nat Biotechnol 1996 ； 14 (4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71 (1) 19-27 ；Liu HS, Lee CH,Lee CF,Su IJ,Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines.Biotechniques. 1998 ；24(4) :624_8，630-2)。由于非人类转基因动物也生产其自己的抗体，人重链和轻链可能会与内源重链和 轻链混合，从而形成混合的内源/转基因抗体。在是小鼠的情况下，可形成混合的小鼠/人 抗体。假如人重链和轻链在淋巴组织外生产，将不会有内源重链和轻链存在，因此可形成纯 的转基因抗体。因此，有效连接到第三和第四转基因DNA序列的启动子优选是既在淋巴组 织又在非淋巴组织中表达的启动子。转基因动物/转基因的整合转基因DNA序列被整合入所有或部分动物细胞，特别是生殖细胞中。整合入基因 组可以是暂时的或稳定的。优选地，整合是稳定的。转基因动物的第一、第二、第三和第四转基因DNA序列可以是杂合的或纯合的。转 基因动物的某些转基因DNA序列可以是杂合的(例如第一和第二转基因DNA序列)，而另外 的可以是纯合的(例如第三和第四DNA序列)。优选地，转基因动物的至少一条转基因DNA 序列是纯合的。转基因动物可以是任何非人类动物。优选地，非人类转基因动物是哺乳动物，更 优选地，非人类转基因动物是啮齿类动物如大鼠或小鼠，最优选地，非人类转基因动物是小 鼠°转基因动物的生产非人类转基因动物可以是任何非人类动物。优选的非人类转基因动物是哺乳动 物。更优选地，非人类动物是啮齿类动物如小鼠或大鼠。生产非人类转基因动物的方法 是本领域公知的。合适的方法公开在即Hogan B.，Beddington R.，Costantini F. & Lacy E. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual.第二版(1994). Cold Spring Harbor LaboratoryPress.中。转基因蛋白可以是遍在表达的。优选地，第一和第二转基因DNA序列编码的蛋白 质在神经元中表达。更优选地，第一和第二转基因DNA序列编码的蛋白质在脑组织中表达。 优选地，第三和第四转基因DNA序列编码的蛋白质在淋巴组织中表达，更优选地，第三和第 四转基因DNA序列编码的蛋白质既在淋巴组织又在非淋巴组织中表达。对上述非人类转基因动物进行遗传、分子和行为方式的分析。用途如上所述的四元转基因小鼠能用作治疗阿尔茨海默病的模型或用作预防AD的模 型。它允许研究人抗_Αβ抗体对鼠类AD模型中Αβ淀粉状蛋白病的发病和发展的效果。 由于转基因动物对转基因人mAbll抗体是免疫耐受的，用治疗性抗体如Mabll进行慢性治 疗的效果可以被测定。同时，可追踪对可溶性Αβ水平和血管淀粉状蛋白病的发展和动力学的效果。此外，如上所述的非人类四元转基因动物是测定用人抗体预防性治疗阿尔茨海默 病的功效和结果的有意义的工具。现在已经概括性地公开了本发明，参照特定的实施例及下述附图能更好地理解本 发明，包括在本文中的所述实施例仅是为了说明的目的，其并不意味着是对本发明的限制。


图1 显示了 APP加工的示意图。A)淀粉样蛋白前体蛋白。标明了三种分泌酶的 切割位点(α :α分泌酶，β 分泌酶，γ γ分泌酶)。图2 显示了淀粉样蛋白前体蛋白(APP)加工的示意图。APP能经历经由2途径的 蛋白水解加工。α-分泌酶的切割发生在Α-β结构域内并产生了大的可溶N-末端APP α 和非淀粉样蛋白生成的C-末端片段。g_分泌酶介导的该片段进一步的蛋白水解产生了非 淀粉样蛋白生成肽P3。备选地，分泌酶介导的APP切割在A β结构域的开头发生并产 生了较短的可溶N-末端，ΑΡΡβ，及淀粉样蛋白生成的C-末端片段(C99)。该C-末端片段 经由Y-分泌酶而进行的进一步切割产生了 Αβ。Y-分泌酶或多个Y-分泌酶的切割能 导致A β的C-末端异质性而产生A β 40和A β 42。圓细胞膜；_ APP β，■ A β，_ CTF图3 显示了遗传构建体的示意图。Α)包含植入在小鼠Thy 1. 2糖蛋白基因(MThy 1. 2)中的编码具有Κ60Ν、M671L 取代的人βΑΡΡ751(人0APP751-SFAD)的DNA的构建体。KPI :Kunitz蛋白酶抑制剂结 构域；Αβ β淀粉样蛋白肽；EI 外显子I ；EII 外显子II ；EIV 外显子IV ；ATG 起始密码 子；TAG 终止密码子。B)包含植入在小鼠朊病毒(pPrPHG)中的编码具有N141I取代的突变人早老蛋白 2(hPS2-N141I)的DNA的构建体。EI 外显子I ；E2 外显子2 ；UTR 非翻译区；ATG 起始密 码子；TAG 终止密码子。C)包含编码定向抗β _淀粉样蛋白肽的人抗体IgGl. 1 (Mabll)重链的DNA的构建 体。MHC-I :H-2k启动子区，VH:抗体重链的可变区，CH1-CH2-CH3 抗体重链的恒定区，IgH 增强子鼠IgH基因的转录增强子元件。D)包含编码定向抗β _淀粉样蛋白肽的人抗体IgGl. 1 (Mabll)轻链的DNA的构建 体。MHC-I :H-2k启动子区，VL 抗体轻链的可变区，CL 抗体轻链的恒定区，IgH增强子鼠 IgH基因的转录增强子元件。图4:显示了对人Αβ特异的人Ig Yl基因的完整编码序列(SEQ ID Ν0:10)，其被 克隆入用于转基因表达的表达载体PHSE3’中。在PCR扩增中使用的引物的位置和名称在 相应序列的上部或下部进行了显示。终止密码子显示为粗体。引导序列显示为粗体并加下 划线。图5 显示了对人A β特异的人IgK基因的完整编码序列(SEQ ID NO :11)，其被 克隆入用于转基因表达的表达载体PHSE3’中。在PCR扩增中使用的引物的位置和名称在 相应序列的上部或下部进行了显示。起始密码子和终止密码子显示为粗体。图6 显示了检测Β6. MabllxB6. PS2APP小鼠后代中的四元转基因的PCR电泳凝胶照片。泳道1 分子量标记，泳道2到7 :B6. Mabl 1χΒ6. PS2APP小鼠的后代小鼠。IgH :IgH特 异性PCR片段；IgL =IgL特异性PCR片段。PSEN2 :PS(N41I)特异性PCR片段。图7 显示了来源于B6.MAB11、B6. 152和B6. MAB11. 152小鼠的用于探测APP的脑 勻浆物的Western Blot。B6. MABll 转基因了 MABll重链和轻链的小鼠。B 6. 152 转基因了 PS2 (N141I) / APP瑞典突变型的小鼠。B 6· MAB11. 152 转基因了 MABll重链和轻链以及PS2 (附411)/APP 瑞典突变型的小鼠。APP:淀粉样蛋白前体蛋白，CTF :C-末端片段，Αβ 淀粉样蛋白肽。图8 显示了野生型、Mabll 转基因小鼠(Β6. MABl 1)、PS2 (Ν1411)/APPsw 二元转基 因小鼠(Β6. 152)和转基因了 MABll重链和轻链以及PS2(N141I)/APP瑞典(B6.MAB11. 152) 的四元小鼠额皮质组织切片的荧光显微照片。小鼠为8月龄，切片用鼠抗-Ab单克隆抗体 (BAP2/Alexa 555缀合物)染色。MABll在四元转基因小鼠中的转基因表达彻底阻止了斑 块形成。图9 显示了野生型、Mabll 转基因小鼠(B6. MABl 1)、PS2 (N1411)/APPsw 二元转 基因小鼠(B6. 152)和转基因了 MABll重链和轻链以及PS2 (W41I)/APP瑞典突变型(B6. MAB11. 152)的四元小鼠额皮质组织切片的荧光显微照片。小鼠为8月龄，切片用硫代黄素 染色。MABll在四元转基因小鼠中的表达彻底阻止了斑块形成。图10 显示了代表来源于Mabll转基因小鼠(A)和四元转基因小鼠(B6. MAB11. 152)⑶血浆的人IgG(即MAB11)的经测定水平的图。比较了不同的独立方法，⑴ Αβ抗原捕获且用Fc特异性检测抗体检测的人IgG—會一 ，(ii)抗人IgG(H+L)捕获且 用(H+L)特异性检测抗体检测的人IgG+及(iii)抗人IgG(H+L)捕获且用Fc特异性检 测抗体检测的人IgG+。图11 显示了用针对人IgG Mabll的探针检测来源于四元转基因小鼠 B6.MAB11. 152、Mabll转基因小鼠B6. MABll的脑勻浆物相对于非转基因背景(C57B1/6)的 Western Blot。为了测定可测量的Mabll最低量，以不同浓度(10、3、1、0· 3,0. 1和0. 03 μ g/ ml)将抗体加到非转基因小鼠B6(C57Bl/6)的脑勻浆物中。来自于非转基因小鼠的血浆是 外周中Mabll的对照。图12 显示了用Αβ探针检测16月龄小鼠脑勻浆物的western blot。脑取自非 转基因野生型C57B1/6小鼠、四元转基因小鼠B6. MABl 1. 152和PS2 (N141I) /APPsff 二元转基 因小鼠B6. 152。在第一泳道中，将MABll加入到没有脑勻浆物的样品缓冲液中作为阴性对 照。图13 显示了 Αβ在Β6. 152和Β6. ΜΑΒ11. 152小鼠脑勻浆物中分离后测量的不可 溶Αβ (Αβ40和42)的图(以ng/mg脑表示)。1-4 :PS2(N141I)/APPsw:元转基因小鼠(B6. 152) 1 = 4 月龄；2 = 8 月龄，3 = 12月龄，4 = 16月龄；5-8 四元转基因小鼠(B6.MAB11. 152) 5 = 4 月龄，6 = 8 月龄，7 = 12 月龄，8 = 16月龄。A)在雌性小鼠中测量的Αβ42，B)在雄性小鼠中测量的Αβ 42，C)在雌性小鼠中测量的Αβ 40，
D)在雄性小鼠中测量的Αβ 40。图14:显示了取自血管淀粉样蛋白沉积物和内皮细胞二重免疫染色的 Β6.ΜΑΒ11. 152皮质切片的以最大强度投射观察到的共聚焦扫描显微图像。图14Α和D分 别显示了在低放大倍数和高放大倍数染色的淀粉样蛋白沉积物的ΒΑΡ2染色。为了比较，图 14Β和E分别显示了在低放大倍数和高放大倍数利用⑶31 (内皮细胞标记物)染色的毛细 血管的分布。图14C和F显示了两种染色的叠加图像。图15 显示了以高分辨率取自二元转基因Β6. 152小鼠的、以最大强度投射观察到 的共聚焦扫描显微图像(Α到C)和取自四元转基因Β6.ΜΑΒ11. 152的皮质毛细血管的单个 共聚焦平面图像(D到F)。图15Α和D显示了淀粉样蛋白沉积物的ΒΑΡ2染色。图14Β和E 显示了⑶31 (内皮细胞标记物)染色。图14C和F显示了两种染色的叠加图像。
实施例除非另外指明，根据厂商说明书使用在实施例中提及的可商购的试剂。实施例1 转基因构建体(图1)APPSwe构建体编码人β ΑΡΡ751的cDNA由D. Goldgaber教授惠赠。通过定 点诱变引入瑞典家族性AD双突变(AFAD，K670N, M671L取代)。通过将大约2. 4kbp的 hu3 APP751SFAD cDNA 片段(SEQ ID NO :1，AC :X06989 的核苷酸 32-2369)插入到含有小 鼠Thy-L 2糖蛋白基因和启动子(SEQ ID NO :2，AC :M12379)的表达载体的XhoI位点而 产生Thyl. 2-hu0APP751SFAD转基因。该表达载体具有包含小鼠Thyl. 2基因的6. 8kbp NotI 片段(Andra K 等人，(1996)Expression of APP intransgenic mice -.a comparison of neuron-specific promoters. NeurobiolAging 17 183-190 ；Vidal M 等人’ (1990) Tissue-specific control elements ofthe Thy-lgene. EMBO J 9 :833_840)，其中位于外 显子2和4上的1. 5kbpBamHI-XhoI片段被XhoI克隆位点置换。在SEQ ID NO 4中给出 了该构建体的部分序列(核苷酸1-2602，MMTHYGP, AC :M12379(在27. 4. 1993时)，小鼠 Thy-L 2 糖蛋白基因(XbaI-BanI)，核苷酸 2603-4982，hp APP751SFAD(SmaI/HindIII-平末 端化，2400bp)，AC :Χ06989 (在 09. 01. 2003 时)，(nt 32-2400)具有 K670N, M671L,核苷酸 4983-6112，MMTHYGP, AC :M12379(在 27. 4. 1993 时)，XhoI-PolyA 位点(外显子 IV)PSEN2mut 构建体将 FAD 突变 N141I 引入人 PSEN2 cDNA (SEQ IDNO :9，AC L43964)。为了在转基因小鼠中表达，使用了基于小鼠朊病毒基因的载体(pPrPHG) (Fischer 等人，1996 ；Borchelt等人，1996)。包括朊病毒基因编码区的KpnI-NarI片段被删除并用 唯一的SceI位点代替。以平末端连接方式插入早老蛋白2编码序列并通过插入位点的测 序进行证实。Mabll构建体使用了具有针对人Ab肽特异性的编码同种型Yl的免疫球蛋白 (Ig)重链(H)的 cDNA(SEQ ID NO 10)和编码同种型 κ 的轻链(L)的 cDNA(SEQ ID NO 11) [Bardroff, M. et. al.，Anti-amyloid betaantibodies and their use. W003070760]。 ffl 过使用表1中的引物在PCR反应中扩增cDNA。为了定向插入到pHSE3’载体中，5’弓丨物含 有SalI (或适合的XhoI)位点，5’引物含有BamHI (或适合的BglII)位点[Pircher,H.，等 人，T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8. Ichain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3) :p. 719-27. ]。PCR 扩增的 cDNA 首先以两种限制酶SalI和BamHI进行酶切，然后分别插入到载体pHSE3，的相应位点。Ig cDNA在pHSE3，中的 表达被鼠I型MHC基因H-2K的启动子驱动并被位于克隆基因3’的鼠Ig H基因增强子增强 [Pircher, H.等人，T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chaintransgenic mice. Embo J, 1989. 8(3) :p. 719-27.]。该表达载体保证了 相应的插入基因产物在转基因小鼠T和B淋巴细胞中的高水平生产([Pircher，H.等人， T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.Ichain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3) :p. 719-27.])。然后将包括(从 5，到 3，)H_2K 启动 子、插入的cDNA、poly-A和拼接位点以及Ig H基因增强子元件的完整表达框利用XhoI限制 性酶切从载体上切除并进行琼脂糖凝胶纯化，再制备成用以微注射到受精小鼠卵母细胞中 的合适浓度(2μ g/ml，于IOmM Tris HC1/0. ImM EDTA，pH 7中)。通过测序编码抗_Αβ Ig H和L基因的完整cDNA证实cDNA的编码可能性。
引物名称序列限制性位点(粗体)SEQ. ID No:Gl.IlSalfor (5'IgH)5-ACGTGTCGACGCCGCCACCATGAAACACCTG-3'Sail (GTCGAC)12Gl.llBamrev (3'IgH)5 '-ACGTGG ATCCTC ATTTACCCGG AG AC AG-3 ‘BamHI (GGATCC)13K. IlXhofor (5'IgL)5ACGTCTCG AGGCCGCC ACC ATGGTGTTGC AG-3XhoI (CTCGAG)14ICllBglrev (3'IgL)5-ACGTAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG-3'BglII (AGATCT)15表1.克隆引物的序列实施例2.转基因小鼠的产生B6. PS2APP转基因小鼠(品系B6. 152)的产生基本按照先前公开的方法产生转 基因动物(Hogan CF,禾口 Lyacy E. 1995. Manipulating themouse embryo a laboratory manual. Ed 2. Plainview, NY :Cold SpringHarbor Laboratory)。携带 Thy_l_huAPP751SFAD 或Prp-hUPsen2(N141I)构建体的不含载体的线性片段以1 1比率混合并显微注射到 C57B1/6受精卵的雄性前核。在显微注射后，有活力的受精卵被植入假孕的B6CBAF1代孕母 鼠输卵管。种系中转基因的整合在Fl后代中通过PCR检测转基因进行检查。据通常的假 设，共注射的转基因整合到相同的染色体位点(Overbeek PA, Aguilar-Cordova E，Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM,禾口 Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1，31—37)。B6Mabll (抗-Αβ IgGl转基因小鼠)的产生按照先前公开在ΕΡ_Α_1748294中的 方法产生转基因动物。将先前部分(Mabll构建体)中描述的编码IgH和L基因的XhoI纯 化片段以1 1混合并显微注射获自C57BL/6雌性供体的受精卵母细胞以获得B6.Mabll动 物。在显微注射后，将有活力的受精卵植入假孕的B6CBAF1代孕母鼠输卵管。种系中转基因 的整合在Fl后代中通过PCR检测转基因进行检查。据通常的假设，共注射的转基因整合到 相同的染色体位点(Overbeek PA, Aguilar-Cordova Ε, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM,禾口Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identificationof transgenic mice. Transgenic Res. 1,31-37) 整个地，产生并繁殖了携带转基因 IgH 和L基因二者的5只二元转基因小鼠和仅携带IgH基因的1只一元转基因小鼠。B6. Mabll. PS2APP转基因小鼠(品系B6. Mabll. 152)的产生具有Mabll转基因 和人PSEN2mut及APPSw转基因二者的转基因小鼠通过杂交Mabll转基因的雄性杂合子和 huPSEN2mut和huAPPSw转基因的雌性纯合子而产生。产生的后代要么是所有转基因的杂合 子要么仅是huAPPSw和huPSEN2的杂合子。实施例3:PCR分析通过使用从取自10日龄小鼠组织生检样品分离的基因组DNA进行PCR分析检测 了转基因的存在。扩增片段对转基因特异并且不与内源性DNA序列交叉反应。B6. PS2APP小鼠(ΑΡΡ^λ突变型_PS2mut 二元转基因小鼠)使用引物5，-AAG TAT GTC CGC GCA GAA CAG AAG G_3’ (SEQ ID NO 5)禾口 5’ -CTG AGA TAT TTG AAG GAC TTG GGG AG-3，(SEQ. ID NO 6)扩增重叠huAPP和huThyl序列的932bp片段。相似地，使用 引物 5，-TCATTG GCT TGT GTC TGA CCC T—3，(SEQ. ID NO 7)禾口 5，-GCT TTCAAC GTC AGT AGG ACA A-3，(SEQ. ID NO 8)扩增重叠 huPSEN2mut 和朊病毒序列的 327bp 片段。huPSEN2 和huAPPSw转基因总是共分离。通过使用1 μ 1 (大约IOOng)自趾修剪组织获得的总DNA 进行了 PCR反应，PCR反应条件如下95°C 3分钟，[95°C 30秒，60°C 1分钟，72°C 1分钟]35 个循环，72 °C 5分钟。在1. 8%琼脂糖凝胶中观察了对应于huAPP转基因的932bp和对应于 huPS2转基因的327bp的PCR扩增DNA片段。B6.Mabll小鼠(Mabll 二元转基因小鼠)通过使用特异性引物扩增制备自尾部活 检样品的基因组DNA筛选出生自这些经显微注射的胚胎的小鼠中转基因的存在。在表2中 列出了使用的引物。通过使用1 μ 1 (大约IOOng)自尾部活检获得的总DNA进行了 PCR反 应，PCR反应条件如下90°C 1分钟，[94°C 10秒，64°C 30秒，72°C 90秒]30个循环，72°C 7 分钟。最后在1. 5%琼脂糖凝胶中分别观察了对应于转基因IgH和L基因的1270bp和660bp 的PCR扩增DNA片段。 表2.用于检测转基因的引物序列。MAB11. PS2APP小鼠(图2)将特异于MHC启动子区的引物5，-ATG
AAT TCA CAG TTT CAC TTC TGC ACC-3，(SEQ. ID NO 16)和分别特异于 Y 链和 κ 链的引物 5，-TGT ACT CCT TGC CAT TCA GC-3，(SEQ. ID NO 17)和 5，-GCT CAT CAG ATG GCG GGA AG-3，(SEQ. ID NO 18)加入多重 PCR 反应中的 huPSEN2 引物(SEQ. ID NO 7 和8)中。在存在所有转基因的情况下，扩增了具有不同大小的3个PCR产物分别对应于 huPSEN2,Hu Ig重链和hu Ig轻链转基因的327bp、600bp和1200bp的片段。通过使用1. 5 μ 1 (大约150ng)自趾修剪组织获得的总DNA进行了 PCR反应，PCR 反应条件如下95°C 1分钟，[95°C 30秒，62°C 40秒，72°C 80秒]30个循环，72°C 7分钟。 在1. 5%琼脂糖凝胶中观察了分别对应于huPS2、IgH和L转基因的327bp、大约660bp和 1200bp的PCR扩增DNA片段。实施例4:免疫组化将氟烷κ-麻醉的8月龄小鼠(野生型小鼠(C57B1/6)，Mab 11转基因小鼠， PS2 (Ν141Ι) /APPsw 二元转基因小鼠和PS2 (Ν141Ι) /APPsw/Mabll四元转基因小鼠)断头、 均分脑并在干冰中速冻。根据Paxinos和Franklin的方法，在_18°C使用Leica CM3050 S恒冷切片机以20微米额定厚度切割侧向 1. 92和1. 2mm间的旁矢状面恒冷箱切片，在 Superfrost Plus 玻片上包埋并保存在_20°C。淀粉样蛋白斑块的染色利用(by state of) 本领域的免疫荧光染色方法或用硫代黄素-S染色完成，硫代黄素是淀粉样蛋白斑块特异 性的染料。简言之，在PBS中水合切片并以在-20°C预冷的100%丙酮处理2分钟。以PBS 洗涤2次，每次2分钟，然后在溶于PBS的2%牛血清白蛋白和2%卵清蛋白中孵育15分钟 以封闭非特异性结合位点，然后用PBS进行洗涤并与高亲合力的0. 5mg/ml鼠单克隆抗体 (BAP-2)在室温孵育1小时，所述抗体被偶联到Alexa488荧光基团(Molecular Probes) W0 在乙醇/PBS (40/60体积％)中以0.0125%浓度进行硫代黄素-S染色。在双蒸水中漂洗玻 片后，使用荧光包埋介质(S3023，DAK0)包埋盖玻片。在图8(BAP_2)和图9(硫代黄素-S) 中显示了以同胞仔做对照的8月龄B6.MAB11. 152和B6. 152的结果，证实在B6.MAB11. 152 小鼠中淀粉样蛋白沉积物彻底缺失。按照上述8月龄动物的方法制备来源于B6. MAB11. 152 (20月龄)小鼠和 B6. 152(20月龄)皮质和近海马的组织玻片。以下述方法将组织玻片进行染色1.大鼠 /L抗-小鼠 CD31，10. 0 μ g/ml (Serotec, ID 1102) PBS溶液(ρΗ7· 4) +power Block (Ix)+10%山羊血清(pH7. 4)，在室温孵育1小时，以DakoCytomation Wash缓冲液 (Tris缓冲氯化钠溶液+吐温20)漂洗3次2.山羊 / 抗大鼠 IgG (H+L) ALEXA 488，1 100 (Molecular Probes, ID 1254) PBS 溶液(pH 7. 4)+10%山羊血清(ρΗ7· 4)，在室温孵育1小时，以DakoCytomation Wash缓冲 液(Tris缓冲氯化钠溶液+吐温20)漂洗3次3.小鼠 /BAP-2a ALEXA 555,5. O μ g/ml (EM Labor, ID 1296) PBS 溶液(pH 7. 4) +power Block (Ix)+10 % 山羊血清(pH7. 4)，在室温孵育 1 小时，以 DakoCytomation Wash缓冲液(Tris缓冲氯化钠溶液+吐温20)漂洗3次用DAPI将玻片染色5分钟，然后用DakoCytomation Wash缓冲液漂洗2次，然后 用50mM CH3COONH4中的4mM CuSO4. 5H20(pH5. 0)孵育30分钟。在双蒸水中漂洗玻片后，使 用荧光包埋介质(S3023，DAK0)包埋盖玻片。结果显示在图14到15中。在B6.MAB11. 152小鼠的皮层中，在细毛细血管中偶尔
16有血管淀粉样蛋白沉积物。然而，同样鼠龄的B6. 152小鼠在皮质毛细血管周围未显示任何 淀粉样蛋白。在更大的血管，如脑膜血管和心室血管，在B. MAB11. 152和B6. 152小鼠间观 察的血管淀粉状蛋白病的程度没有明显区别。实施例5 =Western-Blot分析和A β测量Western-Blot 分析用SDS-PAGE分离15 μ g总蛋白抽提物，随后转移到硝酸纤维素膜(Amersham， Hybond)。对于A β检测，在PBS (8. ImM磷酸氢二钠、1. 5mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、2. 7mM 氯化钾)中95°C加热膜5分钟以增加表位变性和表位提呈，用溶于PBST (PBS和0.05% (ν/ ν)吐温20)的5% (w/v)脱脂奶粉封闭，以第一抗体在4°C孵育过夜。对于APP检测，以 1μ g/ml 的浓度使用第一抗体 W0-2(Ida 等人，J Biol Chem. 1996，271 (37) :22908_1)。对 于早老蛋白2检测，使用了检测氨末端片段的单克隆抗体PST-20(LOetSCher等人J Biol Chem. 1997 Aug 15 ；272 (33) :20655_9)，对于 tau 抗体，Tau-5 (Invitrogen)，对于总 APP 抗 APP-CT20抗体(Calbiochem)，对于人APP，对人APP特异的抗体W0_2(Ida等人，J Biol Chem. 1996,271(37) :22908_1)。在4°C以PBST进行所有的洗涤步骤。按照厂商说明书 (Amersham)以偶联辣根过氧化物酶的抗-IgG抗体(Amersham)及随后的ECL检测系统检测 第一抗体的结合。A β 测量在10倍体积的含蛋白酶抑制剂混合物(Complete ，RocheDiagnostics GmbH，德 国曼海姆)的9M尿素、50mM Tris-HCl pH7. 4溶液中勻浆一个脑半球。通过在4°C以1500g 离心5分钟移除细胞碎片。使用BCA蛋白检测方法(Pierce，美国)测量上清中的蛋白浓度。按Czech等人描述的方法(J Neurochem, 2007. 101(4) :929_36)，通过使用液相电 化学发光法(LPECL)测定脑勻浆物中Αβ 40和Αβ 42的水平。简言之，用测试缓冲液(50mM Tris, 60mM NaCl，0· 5% BSA，1 %吐温 20，pH 7. 4)稀释M-280 顺磁珠(Bioveris)。将终体积 250 μ 1的50 μ 1脑抽提物与50 μ 1珠子和25 μ 1标记的抗体(检测A β 1-40用6E10_bio 和BAP24-tag，检测Αβ 1-42用6E10_bio和BAP24-TAG)在室温下轻轻晃动3小时进行孵 育。使用M-Series M8分析仪(Bioveris)定量ECL。测量以测试缓冲液稀释的不同稀释 度的脑勻浆物以保证线性信号反应并与合成的标准Aβ 1-40和Αβ 1-42肽(Bachem)进行 比较。以lmg/ml的浓度将Αβ肽溶解在DMSO中，分成小份并在-80°C冷冻保存。分别参 考Αβ 1-40和Αβ 1-42的标准曲线，以ng/mg脑勻浆物的形式表述结果。每个样品稀释度 双份进行测量并重复至少两次。实施例6 :B6. mabll. 152 小鼠中 mabll 的 qRT-PCR通过过70 μ M细胞滤网从切碎的整个脾脏分离脾细胞，连续稀释用于RNS抽提。用 激光显微切割从皮层获取脑样品，提供了收集到RNAlater 中的小脑和下拖。使用Qiagen 的 RNAeasy 试剂盒抽提 RNA。用 QuantiTectProbe RT-PCR 试剂盒(Qiagen)进行 PCR。根据 厂商说明书进行 TaqMan Assay (Applied Biosystems Inc)。探针为 muIGH6_Mm01718956_ 1111(18]\1 = 8-细胞标记物)，1111^ Mm00431827_ml (脑参考基因)，huHC_ 客户(基于 mabll IgGl const由ABI为客户定制)和huLC_客户(基于mabll Ig κ const由ABI为客户定 制)。
在LC480 (Roche Diagnostics)上进行PCR。利用Δ Ct法进行靶RNA的相对定量。 来自于非转基因小鼠的脑显微切割物未给出Mabll IgH和IgK RNA的阳性信号。在表3和 5中给出了 B6.mabll. 152小鼠的结果。ave Δ CpSDΔΔAPP的百分比
dlgHCX4.171. 320.0555. 5
dlgKCx2.410. 580.18818. 8
dlgHCb4.230. 750.0535. 3
dlgKCb2.930. 690.13113. 1
dlgHSub4.321. 120.0505. 0
dlgKSub2.711. 320.15315. 3表3 :huIgH和hulgK在B6.mabll. 152小鼠脑中的表达内源参考基因IgM和⑶20在野生型和转基因小鼠中的表达为细胞数目依赖性的。 只有在转基因小鼠中才能发现hulg的强烈且细胞数目依赖性的信号。在野生型小鼠中，与 实验背景相比，没有信号被检测到(参见表4和5)。细胞数IGH6_55 IGH6_56 CD20 hu IgHGl hulgKC10000 22. 2 25.0 24.9 29.024.41000 25. 5 28.0 28.0 32. 227. 3100 28.6 31.5 30.8 35.130.810 31. 2 34. 7 32.8 37.934.6132. 7 38. 1 33. 138. 0表4 :B6. mabll. 152 小鼠的 Ct。IGH6_55, IGH6_56 =内源 IgM 参考，CD20 =内源 ⑶20参考，hulgHGl，hulgKC =转基因特异性探针。细胞数IGH6_55 IGH6_56 CD20 hulgHGl hulgKC10000 20.823. 3 23. 2 44. 5 38.41000 24. 026. 4 26. 4100 27.229.7 29.6 38.5 36.310 30. 133. 5 32. 2 38. 1131. 936. 5 33. 5表5 野生型 C57B1/6 的 Ct。IGH6_55，IGH6_56 =内源 IgM 参考，CD20 =内源 CD20 参考，hulgHGl, hulgKC =转基因特异性探针。
权利要求
一种非人类转基因动物，其基因组包含a)编码人APP瑞典突变型或人APP伦敦突变型蛋白的第一转基因DNA序列，其中所述第一转基因DNA序列有效连接到第一启动子；b)编码含有N141I取代的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列，其中所述第二转基因DNA序列有效连接到第二启动子；c)编码定向抗淀粉样蛋白肽的抗体的轻链的第三转基因DNA序列，其中所述第三转基因DNA序列有效连接到第三启动子；d)编码所述抗体的重链的第四转基因DNA序列，其中所述第四转基因有效连接到第三启动子或第四启动子。
2.根据权利要求1所述的转基因动物，其中第三和第四转基因DNA序列编码抗Αβ抗 体Mab 11的轻链和重链。
3.根据权利要求1到2任一项所述的转基因动物，其中第一和第二启动子是神经元启 动子。
4.根据权利要求1到2任一项所述的转基因动物，其中第一和第二启动子是脑特异性 启动子。
5.根据权利要求1到4任一项所述的转基因动物，其中第三和/或第四启动子是I型 MHC基因的启动子。
6.根据权利要求1到5任一项所述的转基因动物，其中第三和/或第四启动子与IgH 增强子联合。
7.根据权利要求1到6任一项所述的转基因动物，其中动物对至少一种转基因DNA序 列是纯合的。
8.根据权利要求1到7任一项所述的转基因动物，其中动物是非人类哺乳动物。
9.根据权利要求1到8任一项所述的转基因动物，其中动物是小鼠。
10.根据权利要求1到9任一项所述的非人类转基因动物的后代，通过与相同或其他基 因型的动物繁殖获得。
11.源自根据权利要求1到9任一项所述的非人类转基因动物或其根据权利要求10的 后代的细胞系或原代细胞培养物。
12.源自根据权利要求1到9任一项所述的非人类转基因动物或其根据权利要求10的 后代的组织或器官外植体或其培养物。
13.源自根据权利要求1到9任一项所述的非人类转基因动物或其根据权利要求10的 后代的组织或细胞抽提物。
14.产生非人类转基因动物的方法，其基因组包含编码人APP瑞典突变型或APP伦敦突 变型、包含W41I取代的人早老蛋白2和定向抗β淀粉样蛋白肽的人类抗体的重链和轻链 的转基因DNA，所述方法包含a)共注射包含编码人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型的所述第一转基因DNA序列的 遗传构建体和包含编码具有W41I取代的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列的遗传构建 体到非人类受精卵或非人类胚胎干细胞中，并从所述受精卵或胚胎干细胞产生非人类二元 转基因动物；b)共注射包含第三转基因DNA序列的遗传构建体，其中所述DNA序列编码定向抗淀粉样蛋白肽的人抗体的轻链，和包含编码所述人抗体的重链的第四转基因DNA序列的遗传构 建体到非人类受精卵或非人类胚胎干细胞中，并从所述受精卵或胚胎干细胞产生非人类二 元转基因动物，c)将a)和b)的转基因动物进行交配并由此产生非人类四元转基因动物，其基因组包 含编码人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型、包含W41I取代的人早老蛋白2、定向抗β淀 粉样蛋白肽的人抗体的重链和轻链的转基因DNA。
15.产生非人类转基因动物的方法，该动物表达人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型、 包含Ν141Ι取代的人早老蛋白2和定向抗(人)β淀粉样蛋白肽的人抗体的重链和轻链， 所述方法包括a)共注射包含编码人APP瑞典突变型或APP伦敦突变型的所述第一转基因DNA序列的 遗传构建体，其中所述第一转基因DNA序列有效连接到第一启动子，和包含编码具有N141I 取代的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列的遗传构建体到非人类受精卵或非人类胚胎干 细胞中，其中所述第二转基因DNA序列有效连接到第二启动子，并从所述受精卵或胚胎干 细胞产生非人类二元转基因动物；b)共注射包含第三转基因DNA序列的遗传构建体，其中所述第三转基因DNA序列编码 定向抗人淀粉样蛋白肽的人抗体的轻链，所述第三转基因DNA序列被有效连接到第三启动 子，和包含编码所述人抗体的重链的第四转基因DNA序列的遗传构建体到非人类受精卵或 非人类胚胎干细胞中，其中所述第四转基因DNA序列有效连接到第四启动子，并从所述受 精卵或胚胎干细胞产生非人类二元转基因动物，c)将a)和b)的转基因动物进行交配并由此产生非人类四元转基因动物，其表达人 APP瑞典突变型或APP伦敦突变型、包含N141I取代的人早老蛋白2、定向抗β淀粉样蛋白 肽的人抗体的重链和轻链。
16.根据权利要求15所述的产生方法，其中第一和第二启动子是神经元启动子。
17.根据权利要求15所述的产生方法，其中第一和第二启动子是脑特异性启动子。
18.根据权利要求14到17任一项所述的产生方法，其中第三和第四转基因DNA序列编 码抗A β抗体Mab 11的轻链和重链。
19.根据权利要求14到18任一项所述的产生方法，其中第一启动子是Thyl.2糖蛋白 启动子。
20.根据权利要求14到19任一项所述的产生方法，其中第二启动子是朊病毒基因。
21.根据权利要求14到20任一项所述的产生方法，其中第三和/或第四启动子是I型 MHC基因启动子。
22.根据权利要求14到21任一项所述的方法产生的非人类四元转基因动物。
23.根据权利要求1到9和22任一项所述的非人类四元转基因动物作为阿尔茨海默病 治疗模型的用途。
24.根据权利要求1到9和22任一项所述的非人类四元转基因动物作为预防阿尔茨海 默病模型的用途。
全文摘要
本发明涉及非人类转基因动物，其基因组包含a)编码人APP瑞典突变型或人APP伦敦突变型蛋白的第一转基因DNA序列，其中所述第一转基因DNA序列有效连接到第一启动子；b)编码包含N141I取代的人早老蛋白2的第二转基因DNA序列，其中所述第二转基因DNA序列有效连接到第二启动子；c)编码定向抗淀粉样蛋白肽的抗体的轻链的第三转基因DNA序列，其中所述第三转基因DNA序列有效连接到第三启动子及；d)编码所述抗体的重链的第四转基因DNA序列，其中所述第四转基因有效连接到第三启动子或第四启动子，以及产生所述动物的方法。
文档编号C12N15/85GK101918564SQ200880113928
公开日2010年12月15日 申请日期2008年10月23日 优先权日2007年11月1日
发明者A·伊格莱希亚斯, B·波尔曼, H·罗特施赫 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司