辛酰化Ghrelin在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用
【专利摘要】本发明提供了一种牛卵母细胞体外前成熟液，所述前成熟液以牛卵母细胞体外培养液为基质，所述基质中含有辛酰化的Ghrelin。本发明通过辛酰化Ghrelin体外培养抑制牛卵母细胞减数分裂的恢复，从而使得卵母细胞核和细胞质同步成熟，进而提高了牛卵母细胞的质量以及体外发育能力。能够成为新型的减数分裂制剂药物在畜牧业生产上推广应用，具有良好的市场效应和社会效应。
【专利说明】
辛醜化Ghre I i n在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及家畜配子胚胎工程技术领域，具体设及辛酷化化relin在促进牛卵母 细胞体外成熟中的应用。
【背景技术】
[0002] 牛卵母细胞体外成熟（In Vitro Maturation, IVM)作为胚胎体外生产技术（In Vitro Production，IVP)的=大技术环节之一，是一项重要的繁殖生物技术，也是决定体外 胚胎生产的关键技术。其通过体外成熟培养屠宰场废弃卵巢有腔卵泡来源卵母细胞获得大 量可用卵子，可W为育种、克隆、性别控制、细胞核移植、转基因动物生产等提供丰富的成熟 卵源，变废为宝。
[0003] 卵母细胞体外成熟是指卵母细胞离开卵泡环境后，在体外一定培养条件下能够自 发恢复减数分裂进程，并获得能够正常受精W及进一步发育的能力。卵母细胞的体外成熟 是一个复杂的生理过程，主要包括细胞核成熟和细胞质成熟。但在体外成熟过程中，虽然能 够使卵母细胞在体外环境下完成减数分裂，但是由于离开了卵泡液，细胞质在未发育好的 情况下细胞核恢复减数分裂，导致细胞核、细胞质成熟不同步，运样就会造成卵母细胞质量 W及受精后胚胎发育能力较差，因此限制了此项技术的利用效率，细胞核、细胞质同步成熟 成为亟待解决的问题。
[0004] 鉴于W上原因，许多学者开发了卵母细胞体外两段成熟培养方法，即通过体外使 用减数分裂抑制剂暂时可逆的阻止卵母细胞减数分裂恢复，同时促进胞质发育，然后移出 减数分裂抑制环境，进行体外成熟。其中发明专利CN 102899286 A公开了卵母细胞体外成 熟的培养液W及分段培养方法。
[0005] 化relinWhre在印欧语系作词根，意为"grow")。目前，我国学术界对化relin尚没 有统一的译名，所W有生长激素促释放剂、生长激素促分泌素、生长激素释放肤、生长素和 脑肠肤等多种称谓。Ghrelin含28个氨基酸残基组成，其中经测定，发现在血液和组织中 GhrelinW两种主要形式存在:N端辛酷化和脱酷化修饰的化relin。
[0006] Ghrelin的功能除了具有调节生长素的分泌、胃肠生理活动、能量代谢、屯、血管活 动等功能外，还具有调节生殖的作用。越来越多的研究表明，Ghrelin在生殖轴的不同层次 影响着动物的生殖。其中，对激素的分泌有着十分重要的调节作用。同时，化relin还具有调 节动物的发情，胚胎的发育等功能。
[0007] 但是，辛酷化化relin在牛卵母细胞体外分段成熟培养W及进一步用于体外受精、 胚胎生产的作用尚不确定，目前尚无此方面的研究报道。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种牛卵母细胞体外成熟前培养液。
[0009] 本发明另一目的是提供一种促进牛卵母细胞体外成熟的培养液及方法。
[0010] 本发明再一目的是提供辛酷化化relin在促进牛卵母细胞成熟中的应用及辛酷化 Ghrelin在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减数分裂抑制剂药物中的应用。
[0011]所述牛卵母细胞体外前成熟培养液W牛卵母细胞体外培养液为基质，在所述基质 中含有辛酷化Ghrelin。
[001 ^ 优选地，所述辛酷化趾re 1 in浓度为10-50ng/mL，更优选，所述辛酷化Ghrel in浓度 为50ng/mL。
[0013] 优选地，所述基质为不含h邱e S的TCM199培养液。
[0014] 本发明还提供牛卵母细胞体外成熟方法，其是将牛卵母细胞在上述牛卵母细胞体 外前成熟培养液中培养，然后进行体外成熟培养。牛卵母细胞采集后在添加辛酷化Ghrelin 的细胞培养液内前成熟处理6h，然后在成熟液内成熟28h，成熟后的卵母细胞进行体外受 精，然后进行体外胚胎培养。
[001引优选地，所述牛卵母细胞为3-8mm的卵丘-卵母细胞复合体。
[0016] 优选地，所述前成熟培养的培养时间为化;所述辛酷化化relin浓度为10-50ng/ mL，更优选所述辛酷化G虹el in浓度为50ng/mL，所述基质为不含hepes的TCM199培养液。
[0017] 优选地，所述体外成熟培养的成熟培养液为含有FSH 10iig/ml，LH10iig/ml，E2化 g/ml，肝素钢lOiig/ml，半脫氨酸lOiig/ml，10%FBS的TCM199培养液;培养时间为2她。
[0018] 成熟培养后的卵母细胞还用于体外受精或体外胚胎生产。
[0019] 进一步，本发明提供辛酷化趾relin在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。
[0020] 进一步，本发明提供辛酷化化relin在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减 数分裂抑制剂药物中的应用。
[0021] 有益效果：
[0022] 1)本发明应用辛酷化化relin前成熟处理牛卵母细胞，促进细胞核和细胞质成熟 同步，提高了卵母细胞的质量W及体外发育能力，促进了卵裂率W及囊胚率。辛酷化 Ghrelin可W作为新型的卵母细胞减数分裂抑制剂药物在家畜胚胎工程上推广应用。
[0023] 2)本发明所述的辛酷化化relin为体内存在的生物活性肤类物质，对卵母细胞的 毒害作用小。
【具体实施方式】：
[0024] W下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范围。实验用卵 巢采自河北省大厂县屠宰场，牛辛酷化化relin多肤由北京中科亚光生物科技有限公司合 成。
[0025] 实施例1卵母细胞成熟培养
[0026] (1)卵母细胞采集
[0027] 使用含有2ml抽卵液(含25mM hepes M199+l%PVA+200uM IBMX+1%双抗）的 10ml 注射器从屠宰场获取的牛卵巢表面抽取直径3-8mm卵泡。将吸取卵母细胞后的吸卵液放入 7cm3国产培养皿中，在体视显微镜下挑选出胞质均匀，且有3层及W上紧密卵丘颗粒细胞包 裹的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-00巧te omplexes，COCs)用于体外前成熟培养。
[00%] (2)卵母细胞前成熟处理
[0029] 将挑选出的COCs在洗卵液(含h邱es M199+1%PVA巧OOuM IBMX+1%双抗）中清洗3 次，在含有辛酷化化relin的前成熟液（添加1-lOOOng/ml浓度辛酷化化relin的M199培养 液）中清洗3次，然后放入预先在C〇2培养箱中平衡化的前成熟培养液的培养滴中（3.5cm3培 养皿，6化1体积培养液/滴，20枚COCs)，培养条件为含5 % C〇2的空气，溫度38.5 °C，饱和湿 度，培养时间为化。前成熟后一部分COCs脱去颗粒细胞，4%多聚甲醒固定后DAPI染色在显 微镜下观察辛酷化化relin对牛卵母细胞减数分裂的抑制情况(未添加辛酷化化relin的前 成熟液培养的COCs为对照），统计卵母细胞维持在生发泡(germinal vesicle，GV)阶段的数 目。前成熟后的卵母细胞进行下一步成熟培养用于检测发育能力W及受精能力。同时，收集 培养后的前成熟培养液，用于雌二醇、孕酬W及cAMP和MPK的检测。结果见表1-3。
[0030]表1不同浓度辛酷化趾relin体外前成熟处理对牛卵母细胞减数分裂的影响 「nmi 1
[0032] 注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
[0033] 表1实验结果表明50ng/ml辛酷化化relin处理化后抑制了牛卵母细胞减数分裂， 卵母细胞维持在GV阶段的比例显著高于与对照(P<0.05)。
[0034] 表2不同浓度辛酷化化relin前处理对牛卵母细胞卵丘细胞复合体雌二醇和孕酬 分泌的影响
[0035]
[0
[0037] 表2结果显示:5化g/ml的化relin能够促进颗粒细胞中雌二醇和孕酬的分泌。
[0038] 表3不同浓度化relin前处理对牛卵母细胞卵丘细胞复合体cAMP和MAPK分泌的影 响 「nnoni
[0040] 表3结果显示，G虹elin体外处理牛卵丘卵母细胞复合体化对卵丘细胞内MAPK分泌 有影响，50ng/ml处理浓度卵丘细胞内MAPK W及MPF水平最低。由此推测，G虹e 1 in在50ng/ml 处理浓度抑制卵母细胞GV抓发生主要是通过抑制MAPK的活性来实现的。有研究表明，在正 常情况下，MAPK在GVBD之前被激活，通过抑制mytl来活化MPF，从而刺激卵母细胞的GVBD。 [0041 ] (3)卵母细胞成熟培养
[0042] 前成熟处理后的牛卵母细胞在成熟液中进行体外成熟培养2她。
[0043] 在本发明中针对当前常用的体外成熟培养液进行了调整，本发明配置的成熟液A (F細 10μg/ml，LH 10μg/ml，E2 lμg/ml，肝素钢 10μg/ml，半脫氨酸 10μg/ml，10%FBS的 TCM199培养液）W及常规成熟液B(添加 FSH 10μg/ml，LH liig/ml，E2 lμg/ml，EGF lOng/ml， 10%FBS的TCM199培养液），成熟培养时间为2她，同时没有经过前成熟处理的卵母细胞设定 为对照。
[0044] 实施例2体外受精与体外胚胎生产
[0045] 用实施例1卵母细胞成熟培养的卵母细胞进行进一步实验。
[0046] (1)体外受精
[0047] 采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液(B0液+20mg/mlBSA+20mg/mL 肝素钢+l〇〇mg/mL链霉素+100IU/mL青霉素）中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中（放入量 为每60iil受精液，20枚卵母细胞），未添加辛酷化化relin的前成熟液培养的卵母细胞为对 照;然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在2ml洗精液(B0液+3.38mg/mL咖啡因）上浮30min， 之后取上清600-800]il放入1.5ml离屯、管离屯、（1800转，离屯、5min)2次，离屯、后除去上清加入 受精液最终体积为20化1，取40iU处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓 度为1 X 106精子/ml，培养条件为5 % C〇2的空气，溫度38.5 °C，饱和湿度，受精时间为化。
[004引（2)体外胚胎生产
[0049] 受精后的合子在前期发育液(CR1液+6mg/ml BSA，lOOul/滴)洗涂3次后采用微滴 两步法培养:首先在10化1前期发育液(20枚左右合子)培养2d，计数卵裂胚胎后移入10化1 后期发育液(CRl液+10%FBS)培养5d，隔天半量换液，培养条件为5%C02的空气，溫度38.5 °C，饱和湿度，胚胎发育第7天计数囊胚数。结果见表4、表5。
[0050] 表4辛酷化Ghrelin前处理对体外牛卵母细胞受精后卵裂率的影响 「nn。1
[0052]注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05);卵裂率=卵裂数/卵母细胞数
[0053]表5辛酷化Ghrelin前处理对体外牛卵母细胞受精后囊胚率的影响 r00541
[0055] 注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05);囊胚率=囊胚数/卵母细胞数
[0056] 实验结果表明辛酷化化rel in前成熟处理化后进行体外成熟培养，在成熟培养2她 后卵裂率(表4)和囊胚率(表5)均显著高于对照(P<0.05)。成熟液A的效果要优于B，差异显 著。
[0057] 结论：由W上结果可知辛酷化化relin能抑制牛卵母细胞减数分裂进程，促进牛卵 母细胞体外发育能力，提高牛卵母细胞受精后卵裂率和囊胚发育率W及胚胎质量。因此，辛 酷化Ghrelin可作为潜在的减数分裂抑制剂应用于牛的卵母细胞体外培养。
【主权项】
1. 一种牛卵母细胞体外前成熟培养液，其特征在于，以牛卵母细胞体外培养液为基质， 在所述基质中含有辛酰化Ghrelin。2. 根据权利要求1所述的牛卵母细胞体外前成熟培养液，其特征在于，所述辛酰化 611代1;[11浓度为1〇-50即/111匕3. 根据权利要求1或2所述的牛卵母细胞体外前成熟培养液，其特征在于，所述辛酰化 611代1;[11浓度为5〇]^/111匕4. 根据权利要求1或2所述的牛卵母细胞体外前成熟培养液，其特征在于，所述基质为 不含hepes的TCM199培养液。5. 牛卵母细胞体外成熟培养的方法，其是将牛卵母细胞在权利要求1-4任一项所述的 牛卵母细胞体外前成熟培养液中培养，然后进行体外成熟培养。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛卵母细胞为3-8mm的卵丘-卵母细胞 复合体。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛卵母细胞的前成熟培养时间为6h。8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述体外成熟培养的培养液为含有FSH 10 μg/ml，LH 10μg/ml，E 2 lμg/ml，肝素钠10μg/ml，半胱氨酸10μg/ml，10%FBS的TCM199培养 液。9. 辛酰化Ghrel in在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。10. 辛酰化Ghrelin在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减数分裂抑制剂药物中 的应用。
【文档编号】C12N5/075GK106047799SQ201610621595
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月1日
【发明人】许晓玲, 刘彦, 白佳桦, 冯涛, 宋玉清, 肖霖力, 肖银霞
【申请人】北京市农林科学院