一种牛卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种从绞股蓝中分离纯化出的天然产物，含 有该天然产物的牛卵母细胞体外成熟培养液及培养方法。
【背景技术】
[0002] 绞股蓝（Gynostemmapentaphyllum(Thunb. )Maki_no，GP)属萌芦科多年生蔓生草 本，又名七叶胆、五叶参等。因其叶有甜味在日本被称为"甘茶蔓"。性凉、苦、微甘，归肺、 脾、肾经。具有益气健脾，化痰止咳，清热解毒的功效，可用于治疗体虚乏力、虚劳失精、白细 胞减少症、高脂血症、病毒性肝炎、慢性胃肠炎、慢性气管炎。该植物主要生长于亚热带，全 世界约有16种和3个变种，我国有15种和3个变种，广泛分布秦岭及长江以南地区。
[0003] 绞股蓝主要化学成分为绞股蓝皂苷，分布于植物营养器官包括同化组织及韧皮部 薄壁细胞，其含量因植物的部位不同而有所差别，一般情况下绞股蓝叶中含量最高。目前从 绞股蓝中共分离得到140多种绞股蓝皂苷，其中绞股蓝皂苷3、4、8、12分别与人参皂苷Rbi、 他3、1?(1、&结构相同，为同物异名。此外，绞股蓝还含有黄酮类、糖类、萜类等多种化学成分。
[0004] 现代药理研究表明，绞股蓝是一种化学成分比较明确的植物，具有药效良好、毒副 作用小等特点。绞股蓝皂苷对胃癌、宫颈癌、舌癌等培养癌细胞均具有显著的细胞毒作用。 绞股蓝皂苷具有显著降低胆固醇（TCH)、甘油三脂（TG)、低密度脂蛋白（LDL)、升高高密度 脂蛋白（HDL)、保护血管内壁，阻止脂质在血管壁沉积，抗动脉硬化的作用。绞股蓝可以调 节氧在体内分解后产生的废物一一脂肪酸，达到降血脂的目的。绞股蓝皂苷具有明显降低 血粘稠度、调整血压功能、同时能防止微血栓形成并增加心肌细胞对缺氧的耐力，起到保护 心肌的作用。绞股蓝皂苷可提高衰老成纤维细胞增殖能力，且增殖效应呈时间和浓度依赖 性，延缓细胞衰老。绞股蓝具有免疫调节作用，其活性主要体现为：增强非特异性免疫、体液 免疫、细胞免疫；影响淋巴细胞转化和白细胞介素2分泌；增强自然杀伤细胞（NK)的功能。 此外，绞股蓝还可制成保健茶、饮料、食品添加剂等功能性食品，具有广阔的开发前景。
[0005] 随着现代繁殖生物技术的发展及胚胎体外生产技术的逐步完善，利用体外受精、 体细胞核移植等技术生产体外胚胎已呈现出广阔的应用前景。家畜胚胎体外生产尤其是体 细胞核移植是快速扩大优秀种群数量的有效途径。获得足够数量的成熟卵母细胞是胚胎体 外生产的前提条件。虽然，从活体动物采集卵母细胞已经在生产中得到了初步应用，但是这 种方法具有操作复杂、对母畜伤害大、需要精密仪器及获取卵母细胞数目少等不足。对于大 规模的通过体外受精或是体细胞核移植生产体外胚胎，从屠宰场采集的卵巢中抽取卵母细 胞并进行体外培养是获取成熟卵母细胞最有效、最经济的途径。
[0006]目前的研究表明，体外成熟的卵母细胞进行体外受精后，其受精、卵裂及早期胚胎 发育率较低，囊胚发育率低于50%，核移植胚胎的发育率更低，限制了胚胎体外生产技术在 实践中的推广应用。导致体外胚胎发育率低的一个主要原因是卵母细胞体外成熟及培养系 统的缺陷造成胞质未完全成熟所致。卵母细胞成熟包括核成熟和胞质成熟，只有二者均成 熟才具有受精能力和发育潜力。核成熟的标志是第一极体的排放，而胞质成熟的判断标准 尚未统一。卵母细胞受精后的前三个细胞周期的一切事件是由成熟过程中贮存在细胞质中 的rRNA、mRNA和蛋白质负责完成，因此胞质成熟对卵母细胞受精后发育潜力的影响显得尤 为重要。同样对用于核移植的受体卵母细胞，胞质的成熟质量将直接影响重构胚能否维持 正常的分裂及后期发育。因此，改进卵母细胞体外成熟培养条件对提高体外胚胎生产效率 意义重大。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种从绞股蓝中分离纯化出的天然产物，含有该天然产物 的牛卵母细胞体外成熟培养液及培养方法。
[0008] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0009] 具有下述结构式的化合物（I)，
[0010]
[0011] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将绞股蓝的干燥叶粉 碎，用80~90 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔吸附树脂除杂，先用10 %乙醇洗脱8个柱体积，再用 80 %乙醇洗脱6个柱体积，收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏；（c)步 骤（b)中80 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、12:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分 离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤 (d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液 等度洗脱，收集10~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。
[0012] 进一步地，所述的化合物（I)的制备方法中步骤（a)中热回流的乙醇为85%乙 醇。
[0013] 进一步地，所述的化合物（I)的制备方法中步骤（b)中所述大孔吸附树脂为 D101型大孔吸附树脂。
[0014] -种牛卵母细胞体外成熟培养液，所述牛卵母细胞体外成熟培养液组成如下：所 述化合物（I)50~70yg/mL，大豆苷元0.4~0.6yg/mL，青霉素90~110IU/mL，链霉 素90~110yg/mL，血清体积百分含量8%~20%，溶剂为常规培养液；所述常规培养液为 M199、DMEM、F12、MEM中的一种或多种。
[0015] 进一步地，所述培养液组成如下：所述化合物（I)60iig/mL，大豆苷元0? 5iig/ mL，青霉素100IU/mL，链霉素100yg/mL，血清体积百分含量10%，溶剂为M199培养液。
[0016] 利用所述牛卵母细胞体外成熟培养液进行牛卵母细胞体外培养及体外受精的方 法，所述方法包括：（1)配制牛卵母细胞体外成熟培养液；（2)将牛卵母细胞体外成熟培养 液在一次性塑料培养皿上形成体积为50~100yL的培养小滴，置38~39°C环境中预热 1~3小时，牛卵母细胞经冲洗后放入预热后的培养小滴，在38~39°C、5% 0)2的环境内 培养20~24小时；（3)用受精培养液在一次性塑料培养皿上形成体积为50~100yL的 受精小滴，置38~39°C环境中预热1~3小时，将储存在液氮罐中的冻精解冻，然后与步 骤⑵培养后的牛卵母细胞一同放入受精小滴，在38~39°C、5%C02的环境内培养15~ 18小时，进行受精，得到受精后的早期胚胎；(4)用胚胎体外培养液在一次性塑料培养皿上 形成体积为50~100yL的培养小滴，置38~39°C环境中预热1~3小时，将受精后的早 期胚胎冲洗后，放入培养小滴中，在38~39°C、5% 0)2的环境内培养。
[0017] 进一步地，所述的牛卵母细胞体外培养及体外受精的方法中步骤（3)所述受精培 养液为含5~10mg/mL肝素的B0液或者Tyrode's改良液。
[0018] 进一步地，所述的牛卵母细胞体外培养及体外受精的方法中步骤（4)所述胚胎体 外培养液为含体积百分比10 %血清的S0F培养液。
[0019] 所述的化合物（I)在制备牛卵母细胞体外成熟培养液方面的应用。
[0020] 有益效果：本发明提供了一种结构新颖的杂萜类化合物（I)，含有该化合物的牛 卵母细胞体外成熟培养液，和基于该培养液的牛卵母细胞体外成熟培养方法；本发明将化 合物（I)和大豆苷元组合应用于牛卵母细胞体外培养，相比于单独使用化合物（I)或 者大豆苷元，可以显著促进卵母细胞的细胞质成熟，解决了目前牛体外成熟的卵母细胞受 精后胚胎体外发育率低的问题。这可能与化合物（I)和大豆苷元联用对牛卵母细胞具有 保护作用有关。
【附图说明】
[0021] 图1为化合物（I)结构式；
[0022] 图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0024] 实施例1 :化合物（I)