本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种食药用菌复合保水颗粒菌种的制备方法及应用。
背景技术：
传统的食药用菌菌种一般为固体粉料或液体培养液，接种时菌丝断裂，粉碎性损伤严重，抗压强度低，崩解时间短，保水能力差，营养配方不合理。栽培种常为袋装或瓶装，取用不方便，使用时在空气中暴露时间长，杂菌感染机会大，接种成活率相对较低；传统的瓶(袋)装栽培种接种孔的大小不一，加上取种量不容易控制，接种口的缝隙往往较大，在菌棒的搬运和操作过程中，人为挤压造成空气从缝隙处进出，夹带杂菌孢子或花粉孢子进入棒内，造成感染。致使菌种中途退化或引起子实体畸形变异，导致产量降低。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种可有效解决菌丝断裂、损伤严重、抗压强度高，崩解时间长，保水能力强，且采用合理的颗粒菌种营养配方的食药用菌复合保水颗粒菌种的制备方法及应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种食药用菌复合保水颗粒菌种的制备方法及应用，包括如下步骤：
(1)食药用菌菌丝发酵液的获得
①配制发酵培养基：玉米粉12-17g/l，葡萄糖28-32g/l，蛋白胨3-5g/l，黄豆粉8-12g/l，kh2po41-2g/l，硫酸镁0.7-0.8g/l，ph5.5-6.0；
②将发酵培养基经115-125℃高温灭菌15-30分钟，冷却后待用；
③将食药用菌的菌种接种于上述发酵培养基中进行发酵液培养，获得相应的食药用菌菌丝发酵液；
(2)营养颗粒的制备
①准备营养颗粒原料：棉籽壳，木屑，麸皮，豆饼粉，单糖或二糖，石膏粉，保水剂，粘合剂，水；再按照棉籽壳：木屑：麸皮：豆饼粉：单糖或二糖：石膏粉：保水剂：粘合剂：水(w/v)为(50-60)：(20-30)：(8-15)：(8-20)：(0.5-3)：(0.5-3)：(5-9)：(40-70)：(50-70)的配比进行营养颗粒原料的混配；
②按上述配比将营养颗粒原料混匀后送入制粒机中制成营养颗粒；
③将上述制成的营养颗粒经灭菌、干燥、降温后备用；
(3)食药用菌复合保水颗粒菌种的获得
将步骤(1)中制备的食药用菌菌丝发酵液接种于步骤(2)中制备的营养颗粒中，常温下萌发9-11天，真空封装，即得食药用菌复合保水颗粒菌种；其中，接种时，食药用菌菌丝发酵液体积与营养颗粒重量之比为1.1:1。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中食药用菌的菌种获取方法如下：
①配制固体pda斜面培养基：马铃薯180-220g/l，葡萄糖15-25g/l，蛋白胨4-6g/l，琼脂粉18-22g/l，ph7.0；无菌条件下，将1-2cm2的食药用菌菌块接入配制好的固体pda斜面培养基的试管中，置于24-26℃培养箱中培养7-10d，备用为食药用菌摇瓶液体菌种；
②配制种子培养基：玉米粉18-22g/l，葡萄糖18-22g/l，酵母膏4-6g/l，麦麸18-22g/l，豆饼粉8-12g/l，kh2po40.5-1.5g/l，硫酸镁0.4-0.6g/l，ph5.5；无菌条件下，将1-3块1-2cm2的食药用菌摇瓶液体菌种接入装有种子培养基的摇瓶中，在转速为140-160r/min的控温摇床上24-26℃振荡培养6-8d，最终获得用于后期发酵培养的食药用菌的菌种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中发酵液培养的培养方法为：将食药用菌的菌种按照接种量10％接入装有发酵培养基的摇瓶中，置27-29℃和140-160r/min摇床上振荡培养4-5d，获得相应的食药用菌菌丝发酵液。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中营养颗粒原料还包括以下原料：酵母粉0.8-1.2g，mgso40.08-0.12％，kh2po40.18-0.22％，葡萄糖18-22g，维生素b11-2片，180-220g玉米粉末煮水过滤液1000ml。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中保水剂为高吸水性树脂。
作为本发明的优选方式之一，所述高吸水性树脂具体为聚丙烯酸盐。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中粘合剂为淀粉粘合剂。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中最终获得的营养颗粒为抗压强度58.5n以上，崩解时间120s的营养颗粒。
作为本发明的优选方式之一，所述食药用菌为猴头菌；所述猴头菌菌株已于2016年1月4日送于武汉大学(中国，武汉)中国典型培养物保藏中心进行保藏并表现为存活，其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)的保藏编号为cctccm2016006。
本发明还公开一种食药用菌复合保水颗粒菌种的应用，用于食药用菌菌种的栽培制作的原种或直接作为栽培种。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明的食药用菌复合保水颗粒菌种能迅速将液体菌丝吸附生长到营养颗粒内部，不易受环境影响，能长期保持活力，性状稳定，不易老化；
(2)本发明的营养颗粒的抗压强度58.5n以上，崩解时间120s，按照1.1:1的接种量将食药用菌菌丝发酵液接种于营养颗粒充分发菌只需10d左右的时间，颗粒菌种与常用的棉籽壳菌种接种栽培菌丝生长速度、现蕾时间和生物学效率相似；
(3)本发明的工艺过程流畅，且制备得到的食药用菌复合保水颗粒菌种吸水力强，保水效果好，保质期长，便于保存与运输，适于工业化批量生产；
(4)可用于食药用菌菌种的栽培制作的原种也可作为栽培种使用，既可用于代料栽培，也可也可用于段木栽培。
附图说明
图1是实施例1-3中的一种食药用菌复合保水颗粒菌种的制备方法流程图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种食药用菌复合保水颗粒菌种的制备方法，包括如下步骤：
(1)食药用菌菌丝发酵液的获得
①配制固体pda斜面培养基：马铃薯180g/l，葡萄糖15g/l，蛋白胨4g/l，琼脂粉18g/l，ph7.0；无菌条件下，将1cm2的猴头菌(hericiumerinaceum)菌块接入配制好的固体pda斜面培养基的试管中，置于24℃培养箱中培养7d，备用为猴头菌摇瓶液体菌种；其中，所述猴头菌菌株已于2016年1月4日送于武汉大学(中国，武汉)中国典型培养物保藏中心进行保藏并表现为存活，其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)的保藏编号为cctccm2016006；
配制种子培养基：玉米粉18g/l，葡萄糖18g/l，酵母膏4g/l，麦麸18g/l，豆饼粉8g/l，kh2po40.5g/l，硫酸镁0.4g/l，ph5.5；无菌条件下，将1块1-2cm2的猴头菌摇瓶液体菌种接入装有种子培养基的摇瓶中，在转速为140r/min的控温摇床上24℃振荡培养6d，最终获得用于后期发酵培养的猴头菌的菌种；
②配制发酵培养基：玉米粉12g/l，葡萄糖28g/l，蛋白胨3g/l，黄豆粉8g/l，kh2po41g/l，硫酸镁0.7g/l，ph5.5；将发酵培养基经115℃高温灭菌15分钟，冷却后待用；
③将上述获得的用于后期发酵培养的猴头菌的菌种按照接种量10％接入装有发酵培养基的摇瓶中，置27℃和140r/min摇床上振荡培养4d，获得相应的食药用菌菌丝发酵液；
(2)营养颗粒的制备
①准备营养颗粒原料：棉籽壳，木屑，麸皮，豆饼粉，单糖或二糖，石膏粉，聚丙烯酸盐，淀粉粘合剂，水；再按照棉籽壳：木屑：麸皮：豆饼粉：单糖或二糖：石膏粉：保水剂：粘合剂：水(w/v)为50：20：8：8：0.5：0.5：5：40：50的配比进行营养颗粒原料的混配；
②按上述配比将营养颗粒原料混匀后送入制粒机中制成营养颗粒；
③将上述制成的营养颗粒经灭菌、干燥、降温后获得抗压强度58.5n，崩解时间120s的营养颗粒；
(3)食药用菌复合保水颗粒菌种的获得
将步骤(1)中制备的食药用菌菌丝发酵液接种于步骤(2)中制备的营养颗粒中，常温下萌发9天，真空封装，即得食药用菌复合保水颗粒菌种；其中，接种时，食药用菌菌丝发酵液体积与营养颗粒重量之比为1.1:1。
此外，步骤(2)中营养颗粒原料还包括以下原料：酵母粉0.8g，mgso40.08％，kh2po40.18％，葡萄糖18g，维生素b11片，180g玉米粉末煮水过滤液1000ml。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种食药用菌复合保水颗粒菌种的制备方法，包括如下步骤：
(1)食药用菌菌丝发酵液的获得
①配制固体pda斜面培养基：马铃薯220g/l，葡萄糖25g/l，蛋白胨6g/l，琼脂粉22g/l，ph7.0；无菌条件下，将2cm2的猴头菌(hericiumerinaceum)菌块接入配制好的固体pda斜面培养基的试管中，置于26℃培养箱中培养10d，备用为猴头菌摇瓶液体菌种；其中，所述猴头菌菌株已于2016年1月4日送于武汉大学(中国，武汉)中国典型培养物保藏中心进行保藏并表现为存活，其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)的保藏编号为cctccm2016006；
配制种子培养基：玉米粉22g/l，葡萄糖22g/l，酵母膏6g/l，麦麸22g/l，豆饼粉12g/l，kh2po41.5g/l，硫酸镁0.6g/l，ph5.5；无菌条件下，将3块2cm2的猴头菌摇瓶液体菌种接入装有种子培养基的摇瓶中，在转速为160r/min的控温摇床上26℃振荡培养8d，最终获得用于后期发酵培养的猴头菌的菌种；
②配制发酵培养基：玉米粉17g/l，葡萄糖32g/l，蛋白胨5g/l，黄豆粉12g/l，kh2po42g/l，硫酸镁0.8g/l，ph6.0；将发酵培养基经125℃高温灭菌30分钟，冷却后待用；
③将上述获得的用于后期发酵培养的猴头菌的菌种按照接种量10％接入装有发酵培养基的摇瓶中，置29℃和160r/min摇床上振荡培养5d，获得相应的食药用菌菌丝发酵液；
(2)营养颗粒的制备
①准备营养颗粒原料：棉籽壳，木屑，麸皮，豆饼粉，单糖或二糖，石膏粉，聚丙烯酸盐，淀粉粘合剂，水；再按照棉籽壳：木屑：麸皮：豆饼粉：单糖或二糖：石膏粉：保水剂：粘合剂：水(w/v)为60：30：15：20：3：3：9：70：70的配比进行营养颗粒原料的混配；
②按上述配比将营养颗粒原料混匀后送入制粒机中制成营养颗粒；
③将上述制成的营养颗粒经灭菌、干燥、降温后获得抗压强度70n，崩解时间120s的营养颗粒；
(3)食药用菌复合保水颗粒菌种的获得
将步骤(1)中制备的食药用菌菌丝发酵液接种于步骤(2)中制备的营养颗粒中，常温下萌发11天，真空封装，即得食药用菌复合保水颗粒菌种；其中，接种时，食药用菌菌丝发酵液体积与营养颗粒重量之比为1.1:1。
此外，步骤(2)中营养颗粒原料还包括以下原料：酵母粉1.2g，mgso40.12％，kh2po40.22％，葡萄糖22g，维生素b12片，220g玉米粉末煮水过滤液1000ml。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种食药用菌复合保水颗粒菌种的制备方法，包括如下步骤：
(1)食药用菌菌丝发酵液的获得
①配制固体pda斜面培养基：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，蛋白胨5g/l，琼脂粉20g/l，ph7.0；无菌条件下，将1.5cm2的猴头菌(hericiumerinaceum)菌块接入配制好的固体pda斜面培养基的试管中，置于25℃培养箱中培养8d，备用为猴头菌摇瓶液体菌种；其中，所述猴头菌菌株已于2016年1月4日送于武汉大学(中国，武汉)中国典型培养物保藏中心进行保藏并表现为存活，其在中国典型培养物保藏中心(cctcc)的保藏编号为cctccm2016006；
配制种子培养基：玉米粉20g/l，葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，麦麸20g/l，豆饼粉10g/l，kh2po41g/l，硫酸镁0.5g/l，ph5.5；无菌条件下，将2块1.5cm2的猴头菌摇瓶液体菌种接入装有种子培养基的摇瓶中，在转速为150r/min的控温摇床上25℃振荡培养7d，最终获得用于后期发酵培养的猴头菌的菌种；
②配制发酵培养基：玉米粉15g/l，葡萄糖30g/l，蛋白胨4g/l，黄豆粉10g/l，kh2po41.5g/l，硫酸镁0.75g/l，ph5.8；将发酵培养基经120℃高温灭菌20分钟，冷却后待用；
③将上述获得的用于后期发酵培养的猴头菌的菌种按照接种量10％接入装有发酵培养基的摇瓶中，置28℃和150r/min摇床上振荡培养4d，获得相应的食药用菌菌丝发酵液；
(2)营养颗粒的制备
①准备营养颗粒原料：棉籽壳，木屑，麸皮，豆饼粉，单糖或二糖，石膏粉，聚丙烯酸盐，淀粉粘合剂，水，酵母粉，mgso4，kh2po4，葡萄糖，维生素b1，玉米粉末煮水过滤液；先按照棉籽壳：木屑：麸皮：豆饼粉：单糖或二糖：石膏粉：保水剂：粘合剂：水(w/v)为55：23：10：10：1：1：7：50：65的配比进行营养颗粒原料的混配，再添加以下原料：酵母粉1g，mgso40.1％，kh2po40.2％，葡萄糖20g，维生素b12片，200g玉米粉末煮水过滤液1000ml；
②按上述配比将营养颗粒原料混匀后送入制粒机中制成营养颗粒；
③将上述制成的营养颗粒经灭菌、干燥、降温后获得目标营养颗粒；采用中华人民共和国国家标准gb15063-94和工业用酶制剂行标准测定目标营养颗粒的抗压强度和崩解时间，结果显示其抗压强度60n，崩解时间120s；
(3)食药用菌复合保水颗粒菌种的获得
将步骤(1)中制备的食药用菌菌丝发酵液接种于步骤(2)中制备的营养颗粒中，常温下萌发10天，真空封装，即得食药用菌复合保水颗粒菌种；其中，接种时，食药用菌菌丝发酵液体积与营养颗粒重量之比为1.1:1。
实施例4
本实施例的一种食药用菌复合保水颗粒菌种的应用，将上述实施例制备得到的食药用菌复合保水颗粒菌种用于食药用菌菌种的栽培制作的原种或直接作为栽培种。
实施例5
本实施例研究上述实施例过程中食药用菌菌丝发酵液接种的时间对营养颗粒发菌的影响：
分别取培养24h、48h、72h、96h和120h的食药用菌菌丝发酵液接种于营养颗粒，培养并记录菌丝长满营养颗粒所需时间，其结果如表1所示；
表1不同培养时间下食药用菌菌丝发酵液接种的营养颗粒充分发菌所需时间
结果分析：如表1所示，菌丝发酵液培养的时间24h，接种在猴头菌营养颗粒充分发菌的时间则需要30d；菌丝发酵液培养的时间120h，接种在营养颗粒充分发菌的时间则需要12d；因此，培养时间过短，菌丝生物量较小；培养时间过长，则菌丝易老化；菌丝发酵液培养的最佳时间为96h(4d)，此时，接种在营养颗粒菌丝生长速度快，菌丝长满颗粒所需时间为10d。
实施例6
本实施例研究上述实施例过程中食药用菌菌丝发酵液接种量对菌丝长满营养颗粒的影响：
分别取50ml、55ml、60ml和65ml接种量的食药用菌菌丝发酵液转入50g营养颗粒中，观察菌丝发酵液的添加量对营养颗粒的影响以及菌丝长满营养颗粒所需的时间，其结果如表2所示；
结果分析：如表2所示，菌丝发酵液接入50ml(1:1)的接种量过少，营养颗粒干燥，不利于猴头菌菌丝萌发、生长，需要40天才能长满营养颗粒；加入菌丝发酵液65ml(1.3:1)过多，营养颗粒潮湿易碎，菌丝容易发霉变质导致淘汰；接种量的大小会直接影响菌丝长满颗粒所需的时间。根据表2的结果表明，最佳接种量为食药用菌菌丝发酵液体积与营养颗粒重量之比为1.1:1，此时，营养颗粒湿度适中，猴头菌菌丝生长较快，长满营养颗粒需要10天。
表2食药用菌菌丝发酵液接种量对菌丝长满营养颗粒的影响
实施例7
本实施例研究上述实施例过程中食药用菌复合保水颗粒菌种保存期对菌丝生长速度的影响：
以猴头菌制备食药用菌复合保水颗粒菌种，分别采用瓶装和真空包装置室温下22℃保存，于第30天、第45天、第60天和第90天分别取样接入栽培培养基，测定菌丝的生长速度，其结果如表3所示；
结果分析：如表3所示，瓶装食药用菌复合保水颗粒菌种室温放置45d，接种栽培培养基，菌丝活力未受影响；保存60-75d，菌丝活力开始下降；保存90d时，菌种成熟现蕾。真空包装的食药用菌复合保水颗粒菌种保存90d，接种后仍显示较快的菌丝生长速度，但菌丝活力有下降趋势。
表3食药用菌复合保水颗粒菌种保存期对菌丝生长速度的影响
实施例8
本实施例研究上述实施例过程中食药用菌复合保水颗粒菌种相对于的棉籽壳菌种的菌丝生长速度、现蕾时间和生物学效率：
以猴头菌的食药用菌复合保水颗粒菌种和棉籽壳原种接种栽培培养基，进行发菌和出菇管理，测定菌丝生长速度、现蕾时间和生物学效率，其结果如表4所示；
结果分析：如表4所示，采用食药用菌复合保水颗粒菌种的菌丝生长速度为0.446cm/d，棉籽壳菌种接种栽培菌丝生长速度为0.432cm/d；食药用菌复合保水颗粒菌种的现蕾时间为37.6d，棉籽壳菌种的现蕾时间42.3d；食药用菌复合保水颗粒菌种的生物学效率126.1％，棉籽壳菌种的生物学效率120.4％；因此，使用食药用菌复合保水颗粒菌种与棉籽壳菌种接种栽培的菌丝生长速度相比略有增长0.014cm/d，现蕾时间上缩短了4.7d，生物学效率提高了5.7％，表明颗粒菌种各项指标能达到棉籽壳菌种水平，并且颗粒菌种的生长效果要好于棉籽壳菌种，从而也说明利用菌丝发酵液培养出来的颗粒菌种是可行的。
表4食药用菌复合保水颗粒菌种与棉籽壳菌种对比栽培试验结果
实施例9
本实施例研究上述实施例过程中食药用菌复合保水颗粒菌种与栽培菌种的子实体在营养成分的比较：
将食药用菌复合保水颗粒菌种与栽培菌种的子实体在营养成分上进行比较，测定蛋白质、脂类、多糖、粗纤维、灰分等含量，其结果如表5所示；
结果分析：如表5所示，猴头菌的食药用菌复合保水颗粒菌种与栽培菌种的子实体均含有较多的蛋白质、多糖；且颗粒菌种生长的子实体中蛋白质、多糖含量均高于栽培菌种的子实体，而颗粒菌种中粗纤维、总灰分、脂类总量明显少于栽培菌种的子实体；可见，颗粒菌种的子实体所含主要营养成分比栽培菌种的子实体高；猴头菌的食药用菌复合保水颗粒菌种的子实体营养成分的测定表明，猴头菌的蛋白质28.42％，多糖25.73％。说明颗粒菌种的子实体与栽培菌种的子实体具有相似的营养成分和生理功效。
表5猴头菌颗粒菌种和栽培菌种营养成分的比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。