一株白花丹参内生真菌BDF09及其应用的制作方法

本发明涉及微生物以及医药技术领域，特别是涉及一种具有抗凝血功能的白花丹参内生镰刀菌(fusariumsp.)bdf09及其抗凝血功能应用。

背景技术：

心血管疾病是影响人类健康的主要疾病之一，目前临床上采用的抗血栓药物肝素，近年来发现其不能抑制与纤维蛋白结合的凝血酶，这已成为血栓复发的关键因素。因此，研究安全有效、适于长期服用的抗凝血、抗血栓药物具有重要意义。

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参salviamiltiorrhizabge.的干燥根及根茎，是最常用的活血化瘀中药之一。丹参中主要功效物质包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类化学成分。白花丹参(salviamiltiorrhizabge.f.alba)是紫花丹参的白花变异种，可有效改善血液流变学指标、降低血液粘稠度、降低血浆纤维蛋白原、抑制血小板聚集、阻止血栓形成、扩张微血管、改善微循环。白花丹参除了有紫花丹参的作用和用途外，对治疗血栓闭塞性脉管炎具有独特疗效。但由于过度采挖，白花丹参野生资源濒临绝迹。因此，寻找一种可行的替代方法来生产这些药用活性物质成为当今的研究热点。

内生真菌(endophyticfungi)是指在植物生活史中某一段时期生活在植物组织内，对植物没有引起明显病害症状的真菌。目前发现内生真菌在植物体内是普遍存在的，但从不同植物体内分离到的内生真菌的种类和数量具有很大的差异，少则数种，多则百余种，主要与气候环境、取样策略、培养条件以及植物本身的感染性等有关。内生真菌有时能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分。丹参内生菌的次生代谢产物可构成一个庞大的化合物库,是发现新的抗凝血物质的天然资源。目前尚未发现从丹参分离的具有抗凝血功能的内生真菌。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明从白花丹参根中分离到一株具有抗凝血活性的菌株镰刀菌(fusariumsp.)bdf09，通过研究其菌丝体的不同溶剂提取物对家兔的体外凝血时间(ct)的影响以及不同溶剂提取物对凝血酶时间(tt)、凝血酶原时间(pt)和活化部分凝血酶时间(aptt)等指标的影响，评价bdf09的抗血栓以及抗凝血作用，为研制安全无毒的新型抗凝血类药物提供新的资源和途径。

本发明的目的之一在于提供一株具有抗凝血活性的菌株镰刀菌(fusariumsp.)bdf09，该菌株已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmccno.11414。

本发明所述的镰刀菌(fusariumsp.)bdf09，从药用植物白花丹参(salviamiltiorrhizabge.f.alba)的根中分离出来。该菌株在pda培养基上的菌落表面呈白紫色绒状、背面紫色，生长迅速。光学显微镜镜检，菌丝体无色，小型分生孢子为单胞或双胞大型分生孢子有少许弯曲。

本发明的目的之二在于提供上述镰刀菌(fusariumsp.)bdf09的培养方法，所述方法包括菌株活化的步骤和活化后菌株在液体培养基中发酵培养的步骤。

具体的，菌株活化培养基为pda培养基，菌株发酵培养的液体培养基为pdb培养基，培养条件为25℃、有氧培养，如摇床(25℃，150r/min)振荡培养。

本发明的目的之三在于提供上述镰刀菌(fusariumsp.)bdf09的发酵培养物、菌丝体的有机溶剂提取物。上述镰刀菌(fusariumsp.)bdf09的发酵培养物、菌丝体的有机溶剂提取物均具有抗凝血、抗血栓功能。

优选的实施方案中，镰刀菌(fusariumsp.)bdf09的菌丝体的有机溶剂提取物，包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮提取物。

所述有机溶剂提取物为通过有机溶剂提取之后挥发掉有机溶剂的提取物粉体、水溶液或其他提取物溶解液。

本发明的目的之四在于提供一种抗凝血物质的制备方法，所述制备方法包括：培养镰刀菌(fusariumsp.)bdf09，收集菌丝体并用有机溶剂萃取，合并、浓缩和蒸干后得到抗凝血物质。

优选的实施方案中，制备方法为：白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09，采用pdb培养基液体发酵培养，摇床(25℃，150r/min)振荡培养7d，收集菌丝体并用有机溶解萃取多次，合并、浓缩和蒸干后得到抗凝血物质。

本发明的目的之五在于提供上述镰刀菌(fusariumsp.)bdf09及其发酵培养物、菌丝体的有机溶剂提取物在制备抗凝血药物中的应用。

此外，本发明的目的还包括提供一种药物组合物，所述药物组合物包括上述镰刀菌(fusariumsp.)bdf09的发酵培养物、菌丝体的有机溶剂提取物。

医药组合物所用的辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约5％至约95％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，如非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明还包括上述上述镰刀菌(fusariumsp.)bdf09及其发酵培养物、菌丝体的有机溶剂提取物或上述药物组合物与至少一种其它心血管疾病药物药物合用。如可与本发明新颖化合物组合使用的其它心血管疾病药物包括具有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗再狭窄症及/或抗凝血、血管舒张活性的药物等。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明首次从白花丹参根中分离到一株具有抗凝血活性的内生真菌，为白花丹参野生资源寻找一种可行的替代方法来生产抗凝血药用活性物质。

(2)本发明所述的白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09，其液体发酵培养基为pdb培养基，摇床(25℃，150r/min)振荡培养7d，收集菌丝体并用甲醇萃取3次，合并、浓缩和蒸干后得到甲醇粗提的供试品。从家兔固定耳缘静脉或兔耳中央动脉采血。血液在从体内取出开始计时，测试bdf09菌丝体粗提物对家兔凝血时间(ct)的影响。结果发现，没有添加任何抗凝剂的空白对照在214s左右即凝固；阳性对照组(0.2％肝素钠)不凝；菌株bdf09菌丝体甲醇粗提物(生理盐水作为溶剂)不凝，与阳性对照组效果相同；同样发现乙醇、乙酸乙酯、丙酮粗提物对家兔凝血时间(ct)都有延长率，说明bdf09具有较好的抗凝血效果。

(3)从家兔取血9ml，缓缓加入含有3.8％的柠檬酸钠抗凝剂1ml的离心管中(9：1)，充分混匀，3000r/min离心15min，收集上清液。取出3支试管，分别标记为空白对照组、阳性对照组、实验组(内生真菌bdf09菌丝体不同溶剂提取液)。结果表明，加入bdf09菌丝甲醇粗提物、无水乙醇粗提物、丙酮粗提物样品组对家兔凝血酶时间(tt)有延长作用；bdf09菌丝甲醇粗提物、乙酸乙酯粗提物和丙酮粗提物对家兔凝血酶原时间(pt)有延长作用；bdf09发酵菌丝甲醇粗提物、乙酸乙酯粗提物和丙酮粗提物样品组均可以显著延长家兔活化部分凝血酶时间(aptt)。

(4)本发明提供了一株具有较好的抗凝血作用的白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09。本发明的提供的bdf09菌丝体甲醇粗提物和丙酮提取物对家兔全血凝血时间(ct)、凝血酶时间(tt)、活化部分凝血酶时间(aptt)、凝血酶原时间(pt)都具有一定延长作用；菌丝体乙醇粗提物对家兔全血凝血时间(ct)、凝血酶时间(tt)、凝血酶原时间(pt)都具有一定延长作用；乙酸乙酯粗提物对家兔全血凝血时间(ct)、活化部分凝血酶时间(aptt)具有一定延长作用。aptt、pt和tt是各自独立的基础性凝血途径筛查指标。其中，aptt和tt的延长与内源系统凝血酶的抑制有关，pt是反映外源性凝血途径的指标。说明甲醇粗提物和丙酮粗提物对于内源性和外源性凝血途径都具有一定的延长作用且内源性凝血途径尤为明显，乙酸乙酯和乙醇粗提物只作用于内源性凝血途径。本发明提供的白花丹参内生镰刀菌bdf09可为生产新型抗凝血类药物提供新的资源和途径。

附图说明

图1.白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09在马铃薯葡萄糖培养基上的菌落特征

图2.白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09在光学显微镜下的形态特征

图3.白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09的系统发育树

图4.白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09在pdb培养基中的液体发酵

图5.白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09菌丝体的不同溶剂粗提物

图6.白花丹参内生镰刀菌菌株bdf09菌丝体甲醇粗提物对家兔体外凝血时间(ct)的影响，a.0.9％生理盐水，b.阳性对照0.2％肝素钠，c.bdf09甲醇粗提物

具体实施方式

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明涉及一种白花丹参内生型的镰刀菌(fusariumsp.)bdf09，具体涉及内生镰刀菌的分离鉴定、液体发酵、粗提物的制备和体外抗凝血功能。

本发明提供如下实施方案：

(1)本发明所述的白花丹参内生真菌bdf09，通过严格的表面消毒，从药用植物白花丹参(salviamiltiorrhizabge.f.alba)的根中分离出来。

(2)本发明所述的白花丹参内生真菌bdf09，在pda培养基上的菌落表面呈白紫色绒状、背面紫色，生长迅速。光学显微镜镜检，菌丝体无色，小型分生孢子为单胞或双胞大型分生孢子有少许弯曲，初步确定为镰刀菌属(fusariumsp.)。

(3)本发明所述的白花丹参内生真菌bdf09，其基因组dna提取方法采用改进sds法，利用its通用引物its1和its4，进行its扩增分析，得到长度为515bp的单一dna条带，提交genbank数据库中进行blast比对，筛选相似度最高的序列，经鉴定为镰刀菌属(fusariumsp.)。

(4)本发明所述的白花丹参内生镰刀菌bdf09(fusariumsp.)bdf09，已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmccno.11414。

实施例一:白花丹参内生镰刀菌bdf09的分离筛选

采集健康无病症的白花丹参(salviamiltiorrhizabge.f.alba)完整植株，去腐叶，用清水洗去泥沙及其它杂质，冲洗干净，置于滤纸上自然风干。将丹参的根切成约0.5cm的小段，置于干净的培养皿中。在超净工作台中，用75％乙醇处理2min，无菌水冲洗5次，0.1％升汞处理5min，再用无菌水冲洗5次，最后再用75％酒精漂洗30s，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干多余水分。用无菌的刀片将材料外皮剥去后，切成0.2cm×0.2cm的小片，置于添加青霉素的pda培养基中，25℃恒温培养7天。同时将上述经表面灭菌的材料不做任何处理直接种植于pda培养基中，同条件培养，检查表面消毒是否彻底。培养3～7d后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取材料切口处长出的形态不同的菌丝，转接到新鲜pda培养基上进一步培养，纯化3～4次以保证所得菌落为纯培养，将此菌株命名为bdf09。

实施例二：白花丹参内生镰刀菌bdf09的鉴定

(1)形态鉴定：

bdf09在pda培养基上的菌落表面呈白紫色绒状、背面紫色，生长迅速(图1)。光学显微镜镜检，菌丝体无色，小型分生孢子为单胞或双胞大型分生孢子有少许弯曲，初步确定为镰刀菌属(fusariumsp.)(图2)。

(2)分子鉴定：

采用改良sds法提取基因组dna；利用its通用引物its1和its4，通过pcr扩增其its序列，得到长度为515bp的单一dna条带，其itsrdna序列为：tgggataggactcactcccaacccctgtgacataccacttgttgcctcggcggatcagcccgctcccggtaaaacgggacggcccgccagaggacccctaaactctgtttctatatgtaacttctgagtaaaaccataaataaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcaaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcacagcttggtgttgggactcgcgttaattcgcgttccccaaattgattggcggtcacgtcgagcttccatagcgtagtagtaaaaccctcgttactggtaatcgtcgcggccacgccgttaaaccccaacttctgaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa(seqidno:1)

在genbank数据库中进行blast比对后，选择同源性高于97％的菌株进行系统发育分析(图3)，结果发现，bdf09与fusariumoxysporumku528856.1，fusariumsp.f22eu091005.1，f.oxysporumku325321.1和f.oxysporumkf998987.1.聚在同一分支中，它们its序列的相似性达到99％。因此，将丹参内生真菌bdf09鉴定为镰刀菌属(fusariumsp.)。

综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》和分子鉴定，本发明菌株bdf09确定为镰刀菌属(fusariumsp.)。该菌株于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno11414。

实施例三：bdf09液体发酵及其代谢产物粗提物的制备

挑取在pda培养基上活化的内生真菌bdf09接种在pdb培养液中，摇床(25℃，150r/min)振荡培养7d(图4)。6000rpm离心10min，收集菌丝体，分别用乙醇、甲醇、乙酸乙酯和丙酮萃取3次，合并、浓缩和蒸干后，用生理盐水作为溶剂，配成10mg/ml的乙醇粗提物、甲醇粗提物、乙酸乙酯和丙酮粗提物(图5)。

实施例四：bdf09菌丝体粗提物对家兔ct的影响

bdf09菌丝体甲醇粗提物对家兔ct的影响结果见图6，表1。从图6和表1中可以看出，没有添加任何抗凝剂的空白对照在113.8s左右即凝固；阳性对照组样品不凝；菌株bdf09菌丝体甲醇粗提物不凝，与阳性对照组效果相同；乙醇、乙酸乙酯、丙酮都有延长率，分别为303.5％、273.6％和336.6％。

表1菌株bdf09菌丝体粗提物对家兔凝血时间(ct)的影响

注:延长率＝(不同药物浓度对应的凝血时间－空白对照凝血时间)/空白对照凝血时间

实施例五：bdf09菌丝体不同溶剂粗提物对家兔tt的影响

bdf09菌丝体粗提物对家兔tt的影响结果见表2。从表2中可以看出，空白对照在25.6s时出现纤维蛋白丝，加入肝素钠的阳性对照样品不凝；加入bdf09菌丝甲醇粗提物、无水乙醇粗提物、丙酮粗提物样品组对家兔tt均有延长作用，延长率分别为126.5％、125.6％和130.7％。乙酸乙酯粗提物没有明显延长作用。

表2bdf09菌丝体粗提物对家兔tt的影响

实施例六：bdf09菌丝体不同溶剂粗提物对家兔pt的影响

bdf09菌丝体不同溶剂粗提物对家兔pt的影响结果见表3。从表3中可以看出，阴性对照在15.08s时出现纤维蛋白丝，加入肝素钠的阳性对照样品不凝，加入bdf09菌丝甲醇粗提物、乙酸乙酯粗提物和丙酮粗提物对家兔pt有一定延长作用，而无水乙醇粗提物对家兔pt没有延长作用。

表3bdf09菌丝粗提物对家兔对pt的影响

实施例七：bdf09菌丝体不同溶剂粗提物对家兔aptt的影响

bdf09菌丝体不同溶剂粗提物对家兔活化部分凝血酶时间(aptt)的影响结果见表4。从表中可以看出，阴性对照在28s时出现纤维蛋白丝，加入肝素钠的阳性对照样品不凝；加入bdf09菌丝甲醇粗提物、乙酸乙酯粗提物和丙酮粗提物样品组均可以显著延长家兔活化部分凝血酶时间(aptt)。其中，甲醇粗提物抗凝作用更为明显，延长率为108.3％，无水乙醇粗提物没有明显延长作用。

表4bdf09菌丝体粗提物对家兔对aptt的影响

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

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