一种温度响应型智能细胞培养容器的制作方法与流程

本发明属于温度响应型细胞培养容器领域，特别涉及一种温度响应型智能细胞培养容器的制作方法。

背景技术：

对于贴壁生长的细胞，将其从细胞培养板、培养瓶或培养皿的壁面脱附转移是细胞工程和组织工程中最基本，也是最常涉及的实验操作之一。目前常用的细胞脱附方法是胰蛋白酶(简称胰酶，trypsin)消化法。胰酶是蛋白酶的一种，其在脊椎动物体内起到消化酶的作用，胰酶的作用是将细胞与细胞之间以及细胞与培养容器表面之间的细胞外基质蛋白(extracellularmatrix，ecm)水解，从而分离细胞，因此在动物细胞培养过程中可用于分散组织中的细胞以及使贴壁生长的细胞脱落。然而胰酶除了能消化细胞间的基质蛋白外，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用。因此在使用胰酶消化细胞时，需要严格第控制胰酶的浓度、作用时间、温度以及冲洗次数等参数。在弱碱性、温度为37℃的条件下，胰酶溶液的消化能力最强，但操作时稍有疏忽就容易对细胞的膜结构和功能的完整性造成破环，进而造成细胞活性的下降，甚至导致细胞死亡。

近年来，温度响应型表面被广泛地应用于细胞培养和组织工程等领域。2001年5月，日本cellseed公司成立，标志着温度响应型高分子材料正式进入实际的商用领域。该公司基于聚(n-异丙基丙烯酰胺)(poly(n-isopropylacrylamide),pnipam)温敏型高分子材料对细胞培养板进行改性涂层，得到了具有温度响应特性的细胞培养板。使用这种细胞培养板进行细胞培养，可简单的通过改变环境温度使细胞脱离细胞培养板壁面，避免了使用胰酶吹洗细胞的过程。相比于传统的细胞脱附方式，这种细胞培养板为细胞的脱附转移提供了高效、对细胞无伤害、无需外加化学试剂的手段。虽然基于pnipam的细胞培养板已被商业化使用，但研究者们始终未放弃对制作温度响应型细胞培养板的研究，这主要是由于目前制作温度响应型表面的方法还存在各种局限性。

目前，将pnipam高分子修饰在细胞培养板表面的方法主要有化学接枝法和物理沉积法。化学接枝法主要通过电子束照射法(见yamada,n.；okano,t.；sakai,h.,etal.makromolekularechemierapidcommunications1990,11(11),571.)、等离子体处理法(见okano,t.；yamada,n.；sakai,h.,etal.journalofbiomedicalmaterialsresearch1993,27(10),1243.)、以及表面活性自由基聚合等方法(见takahashi,h.；nakayama,m.；yamato,m.,etal.biomacromolecules2010,11(8),1991.)将pnipam高分子刷接枝在细胞培养板表面；物理沉积法主要是利用静电作用将pnipam高分子链或pnipam纳米凝胶颗粒沉积在细胞培养板表面(见schmidt,s.；zeiser,m.；hellweg,t.,etal.advancedfunctionalmaterials2010,20(19),3235.)。

尽管以上提到的化学或物理方法都可以实现细胞的可控脱附，但使用现有方法仍然存在以下不足：(1)化学法的工艺复杂，需要对细胞培养板的表面进行多步表面化学修饰；制作周期长；化学方法使用的试剂在反应结束后难以去除，导致生物相容性差，例如，使用用原子转移自由基聚合(atrp)法对细胞培养板进行修饰时，需要用到铜盐试剂，铜离子在反应后难以从聚合物内部去除，存在一定的生物毒性；使用的设备及试剂的价格昂贵；对细胞培养容器的材质、尺寸和形状都有严格要求，例如，在对不同材质的细胞培养容器进行修饰时，需要单独设计表面修饰路线，并合成不同的活性分子对细胞培养容器进行表面处理，对于一些材质难以被修饰的细胞培养容器，化学方法就不适用了，通过化学方法对细胞培养容器进行表面修饰时，所使用的设备的反应器尺寸都是一定的，因此对细胞培养容器的尺寸严格限制，对于电子束照射法和等离子体照射法，如果细胞培养容器具有复杂的形状，则电子束或等离子体无法透过细胞培养容器对其内表面进行修饰，因此对细胞培养容器的形状有严格限制；(2)物理法对基材的表面性能也有严格要求，一般需要先合成具有不同带电基团的聚电解质，然后使用聚电解质分别对pnipam高分子链、pinpam纳米凝胶、细胞培养板进行表面电荷修饰，最终使pnipam高分子链或pnipam纳米凝胶颗粒与细胞培养板以静电作用固定；静电结合力弱，修饰后的细胞培养板的使用稳定性差。这些问题不但会增加温度响应型细胞培养板的制作成本，而且极大的降低了其制作效率。因此，开发设计出一种简单、廉价、高效的方法来制作使用稳定性好的温度响应型细胞培养容器，对于推动温度响应型细胞培养容器的市场化发展具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种温度响应型智能细胞培养容器的制作方法，以简化温度响应型智能细胞培养容器的制作工艺并降低生产成本。

本发明提供的温度响应型智能细胞培养容器的制作方法，于步骤如下：

(1)将聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒均匀分散在温度为4～25℃、ph值为7～10的灭菌tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，将盐酸多巴胺溶解于纳米凝胶颗粒分散液中得到修饰液；

(2)将修饰液加入细胞培养容器中使修饰液浸没细胞培养容器的待修饰部位，在有氧条件下于20～40℃反应至少3h将聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒固定在细胞培养容器上，然后用去离子水清洗经过前述处理的细胞培养容器以去除与细胞培养容器结合不稳定的聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒，再将清洗后的细胞培养容器在20～50℃干燥去除细胞培养容器表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养容器的制作。

上述方法的步骤(1)中，将盐酸多巴胺加入纳米凝胶颗粒分散液中，然后超声使盐酸多巴胺溶解得到修饰液，超声的方式能够使盐酸多巴胺快速溶解，从而尽可能地避免多巴胺分子在溶解的过程中发生自聚合，以保证后续操作时聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒在细胞培养容器上固定的稳定性。

上述方法的步骤(2)中，最好是在步骤(1)中的修饰液配制好后立即将修饰液加入细胞培养容器中使修饰液浸没细胞培养容器的待修饰部位，这能够尽可能地避免多巴胺分子在对细胞培养容器进行修饰前发生自聚合，以保证后续操作时聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒在细胞培养容器上固定的稳定性。

上述方法的步骤(1)中，按照聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗与tris缓冲液的质量比为1:(100～500)的比例将聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗均匀分散到tris缓冲液中。

上述方法的步骤(1)中，按照盐酸多巴胺与纳米凝胶颗粒分散液的质量比为1:(200～1000)的比例将盐酸多巴胺溶解于纳米凝胶颗粒分散液中。

上述方法的骤(1)中，tris缓冲溶液的浓度为10～20mmol/l。

上述方法的步骤(1)中，灭菌缓冲液是指采用过滤灭菌、高压灭菌等方式对缓冲液进行灭菌处理。

上述方法的步骤(2)中，优选在20～40℃反应3～12h将聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒固定在细胞培养容器上。

上述方法的步骤(2)中，将修饰液加入细胞培养容器中使修饰液浸没细胞培养容器的待修饰部位，在空气氛围中于20～40℃反应至少3h将聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒固定在细胞培养容器上。

上述方法中，所述细胞培养容器为细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养皿。细胞培养容器的材质可为任意材质，例如，对于现有的聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材质等材质的商业化的细胞培养容器都是适用的。

上述方法中，所述聚(n-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒采用现有方法进行制备，例如可采用沉淀聚合的方法合成(见pelton,r.advancesincolloid&interfacescience2000,85(1),1.)。

本发明所述方法将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养容器上的原理：修饰液中的多巴胺分子在有氧条件下(例如在空气氛围中)会发生氧化自聚合作用，多巴胺分子中的邻苯酚基团去质子化生成苯醌基团，进而与自身的氨基发生迈克尔加成反应并形成复杂的三聚体寡聚物结构，而此时细胞培养容器的待修饰部位是浸没在修饰液中的，修饰液中多巴胺自聚合生成的多巴胺寡聚物分子在细胞培养容器的待修饰部位和pnipam纳米凝胶颗粒表面同时附着沉积，然后多巴胺的寡聚物分子会进一步的发生自聚合反应，在pnipam纳米凝胶颗粒与细胞培养容器上形成聚多巴胺纳米粘附层，这两者间的聚多巴胺纳米粘附层充当“粘合剂”的作用将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养容器上。pnipam纳米凝胶颗粒在细胞培养容器表面的固定作用力为共价键与非共价键的协同作用，例如，聚多巴胺内的多巴醌与氨基之间的迈克尔加成反应产生的共价键作用、含氮及含氧基团与氢原子之间的氢键作用、质子化的带正电的氨基与芳香环间的阳离子-π作用以及芳香环与芳香环之间的π-π堆积作用都会使pnipam纳米凝胶颗粒与细胞培养容器之间产生较强的结合力，从而将pnipam纳米凝胶颗粒稳定地固定在细胞培养容器上。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种制作温度响应型智能细胞培养容器的新方法，该方法的操作非常简单，只需要经过一步溶液浸泡即可实现pnipam纳米凝胶颗粒在细胞培养容器表面的稳定固定，有效克服了现有化学法操作复杂、现有物理法固定后表面稳定性差，以及二者共同存在的对细胞培养容器的表面性能有严格要求的不足，因此本发明为温度响应型智能细胞培养容器的制作提供了简单、廉价和高效的通用方法。2.本发明所述方法利用多巴胺在溶液中自聚合为聚多巴胺的过程中所产生的粘附特性将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养容器表面，由于多巴胺在自聚合后可以在自然界中大多数的材料表面形成稳定的聚多巴胺纳米粘附涂层，因此本发明所述方法可适用于不同材质、不同尺寸、不同形状的商品化细胞培容器，具有适用性广的特点。

3.本发明所述方法利用多巴胺自聚合反应过程中产生的粘附特性将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养容器上，该方法结合了物理沉积法的简易性和化学接枝法的稳定性，pnipam纳米凝胶颗粒在细胞培养容器表面的固定作用力为共价键与非共价键的协同作用，因此通过本发明方法制作的温度响应型智能细胞培养容器具有良好的使用稳定性。

4.本发明所述方法中使用的多巴胺分子及其聚合后的聚多巴胺高分子属于茶多酚的衍生物，由于多酚类物质本身存在于人体中，加之本发明的方法无需使用有机溶剂，因而本发明方法制作的温度响应型智能细胞培养板具有良好的生物相容性，可直接用于细胞及组织的培养。细胞毒性测试表明，使用本发明所述方法制作的温度响应型智能细胞培养板细胞，经过24小时细胞培养后，细胞活性值约为95％，经过72小时细胞培养后，细胞活性值约为105％，说明生物相容性良好。

5.实验表明，使用本发明所述方法制作的温度响应型智能细胞培养容器进行细胞培养，通过改变环境温度即可使细胞脱离细胞培养容器壁面，无需外加化学试剂、对细胞无伤害，并且细胞脱附效率高，温度响应型智能细胞培养容器经过多次使用后，pnipam纳米凝胶颗粒仍然稳定地固定在细胞培养容器上，使用稳定性高。

5.本发明所述方法中使用的多巴胺分子及其聚合后的聚多巴胺高分子属于茶多酚的衍生物，由于多酚类物质本身存在于人体中，因此本发明方法制作的温度响应型智能细胞培养板具有良好的生物相容性，可直接用于细胞及组织的培养。细胞毒性测试表明，使用本发明所述方法制作的温度响应型智能细胞培养板细胞，经过24小时细胞培养后，细胞活性值约为95％，经过72小时细胞培养后，细胞活性值约为105％，说明生物相容性良好。

6.本发明所述方法不需要特殊的仪器和昂贵的实验试剂，在常规条件下即可完成温度响应型表面的制备，因此本发明所述方法在简单的工艺条件下即可推广应用，易于实现工业化生产。

附图说明

图1是实施例1中制作温度响应型智能6孔细胞培养板过程中的光学图，其中，图a为左边2孔含有刚配置好的修饰液的细胞培养板，图b为左边2孔含有自聚合一段时间后的修饰液的细胞培养板，图c为制作完成的温度响应型智能细胞培养板。

图2是实施例1制作的温度响应型智能细胞培养板孔板底面的扫描电镜图。

图3是本发明所述温度响应型细胞培养板表面对细胞的可控脱附与贴附的示意图，图中，1—t>lcst时，收缩后呈现疏水状态的pnipam纳米凝胶颗粒、2—t>lcst时，在相对疏水的细胞培养板表面贴壁生长的细胞、3—细胞表面的外基质蛋白、4—聚多巴胺纳米粘附涂层、5—细胞培养板的孔板基材、6—t<lcst时，溶胀后呈现亲水状态的pnipam纳米凝胶颗粒、7—t<lcst时，在亲水状态从细胞培养板上脱附的细胞。

图4是实施例2中使用普通细胞培养板对小鼠胚胎成纤维细胞进行培养的光学显微镜图，其中，图a是环境温度为37℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图b是环境温度为25℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图c是在25℃反复吹洗后，细胞在孔板表面的贴附状态，图中标尺为200μm。

图5是实施例2中使用温度响应型智能细胞培养板对小鼠胚胎成纤维细胞进行培养的光学显微镜图，其中，图a是环境温度为37℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图b是环境温度为25℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图c是在25℃轻轻吹洗后，细胞在孔板表面的贴附状态，图中标尺为200μm。

图6是实施例2中温度响应型智能细胞培养板对小鼠胚胎成纤维细胞的温度响应的脱附效率。

图7是实施例2中不同温度下小鼠胚胎成纤维细胞在温度响应型智能细胞培养板板孔表面的贴附和脱附状态的扫描电镜图，其中，图a为37℃条件下，细胞在孔板表面呈现铺展生长的贴附图，图b为25℃条件下，细胞在孔板表面呈现球状收缩的脱附图。

图8是实施例2中第二次循环使用温度响应型智能细胞培养板对小鼠胚胎成纤维细胞进行培养的光学显微镜图，其中，图a是环境温度为37℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图b是环境温度为25℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图c是在25℃轻轻吹洗后，细胞在孔板表面的贴附状态，图中标尺为200μm。

图9是实施例2中温度响应型智能细胞培养板在第二次循环使用后对小鼠胚胎成纤维细胞的温度响应的脱附效率。

图10是实施例2中温度响应型智能细胞培养板经过第二次循环使用后的板孔内表面的扫面电镜图。

图11是实施例3中使用温度响应型智能细胞培养板对细胞进行24h和72h的培养后的细胞活性测试结果。

具体实施方式

以下通过实施例并结合附图对本发明所述温度响应型智能细胞培养容器的制作方法作进一步说明。

下述各实施例中，采用沉淀聚合的方法(见pelton,r.advancesincolloid&interfacescience2000,85(1),1.)合成聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)纳米凝胶颗粒；所述盐酸多巴胺购自西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)化学品公司，三羟甲基氨基甲烷(tris)购买自科龙化工科技有限公司。

实施例1

本实施例中，制作温度响应型智能细胞培养板的步骤如下：

(1)采用过滤灭菌法对去离子水进行灭菌处理得到灭菌去离子水，将三羟甲基氨基甲烷(tris)加入灭菌去离子水中搅拌均匀形成tris溶液，tris的浓度为15mmol/l，向tris溶液中缓慢滴入稀盐酸调节其ph值至8.5得到灭菌tris缓冲液。

将pnipam纳米凝胶颗粒按照pnipam纳米凝胶颗粒与tris缓冲液的质量比为1:200的比例加入温度为25℃的上述tris缓冲液中，在40w的功率下超声20min使纳米凝胶颗粒均匀分散在tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，按照盐酸多巴胺与纳米凝胶分散液的质量比为1:500的比例向纳米凝胶颗粒分散液中加入盐酸多巴胺，在40w的功率下超声30s使盐酸多巴胺充分溶解得到修饰液。

(2)立即将修饰液加入聚苯乙烯材质的6孔细胞培养板的板孔内(见图1a)，在25℃的水浴中振荡反应12h将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养板的板孔壁面上，由于多巴胺发生自聚合反应，此时板孔内的溶液呈现为灰黑色(见图1b)，将溶液从板孔内倒出，然后用去离子水对细胞培养板的板孔内表面进行洗涤以去除与细胞培养板结合不稳定的pnipam纳米凝胶颗粒，再将清洗后的细胞培养板在30℃干燥去除细胞培养板表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养板的制作(见图1c)。

通过扫描电镜对温度响应型智能细胞培养板的板孔底面进行表征，结果如图2所示，由图2可知，pnipam纳米凝胶颗粒均匀地固定在细胞培养板的板孔底面上。

实施例2

本实施例中，制作温度响应型智能细胞培养板的步骤如下：

(1)采用过滤灭菌法对去离子水进行灭菌处理得到灭菌去离子水，将tris加入灭菌去离子水中搅拌均匀形成tris溶液，tris的浓度为10mmol/l，向tris溶液中缓慢滴入稀盐酸调节其ph值至7得到灭菌tris缓冲液。

将pnipam纳米凝胶颗粒按照pnipam纳米凝胶颗粒与tris缓冲液的质量比为1:100的比例加入温度为20℃的上述tris缓冲液中，在50w的功率下超声10min使纳米凝胶颗粒均匀分散在tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，按照盐酸多巴胺与纳米凝胶分散液的质量比为1:200的比例向纳米凝胶颗粒分散液中加入盐酸多巴胺，在50w的功率下超声60s使盐酸多巴胺充分溶解得到修饰液。

(2)立即将修饰液加入聚丙烯材质的6孔细胞培养板的板孔内，在20℃的水浴中振荡反应10h将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养板的板孔壁面上，将板孔内的溶液倒出，然后用去离子水对细胞培养板的板孔内表面进行洗涤以去除与细胞培养板结合不稳定的pnipam纳米凝胶颗粒，再将清洗后的细胞培养板在20℃干燥去除细胞培养板表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养板的制作。

以下通过实验考察细胞在本实施例制作的温度响应型智能细胞培养板内的可控贴附与脱附行为。

本发明的温度响应型细胞培养板表面对细胞的可控脱附与贴附的示意图见图3，当细胞培养环境的温度高于pnipam的lcst(～32℃)时，pnipam纳米凝胶网络处于疏水收缩的状态，此时细胞表面的外基质蛋白与pnipam纳米凝胶网络之间产生疏水缔合的作用，细胞贴附在pnipam纳米凝胶沉积的板孔表面上铺展生长，当细胞培养环境的温度低于pnipam的lcst(～32℃)时，pnipam纳米凝胶网络处于亲水溶胀的状态，此时pnipam纳米凝胶网络与细胞表面的外基质蛋白间的结合位点被水分子占据，疏水缔合作用减弱，导致细胞从pnipam纳米凝胶沉积的板孔表面脱附并呈球形状态悬浮在细胞培养液中。

①直接使用普通细胞培养板对小鼠胚胎成纤维细胞进行过夜培养，并在不同条件下拍摄光学显微镜照片，结果如图4所示，图4a是环境温度为37℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图4b是环境温度为25℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图4c是在25℃使用缓冲液反复吹洗后，细胞在孔板表面的贴附状态。比较图4a～c可知，经过降温处理，或者是经过降温处理和反复冲洗后，小鼠胚胎成纤维细胞在孔板内仍然稳定地贴附，说明该普通细胞培养板无法通过响应环境温度的变化使细胞从其表面脱附。

②在与步骤①相同的培养条件下，使用本实施例制备的温度响应型智能细胞培养板对小鼠胚胎成纤维细胞进行过夜培养，并在不同条件下拍摄光学显微镜照片，结果如图5所示，图5a是环境温度为37℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图5b是环境温度为25℃时细胞在孔板表面的贴附状态，图5c是在25℃使用缓冲液对孔板轻轻吹洗后，细胞在孔板表面的贴附状态。由图5a可知，经过一段时间的培养后，小鼠胚胎成纤维细胞在本实施例制作的温度响应型智能细胞培养板的板孔内的生长状态良好，并且细胞数明显高于采用普通细胞培养板培养的时的细胞数，说明本发明所示方法制作的温度响应型细胞培养板具有良好的生物相容性。由图5b可知，当环境温度由37℃降至25℃后，小鼠胚胎成纤维细胞在温度响应型细胞培养板的板孔表面呈球形状态，经过轻轻的吹洗，细胞即可从温度响应型细胞培养板的板孔表面脱附(见图5c)，细胞在板孔表面的贴附和脱附比例如图6所示，脱附率约为95％。细胞在温度响应型智能细胞培养板的板孔表面的形貌图如图7所示，由图7可知，在37℃条件下，细胞呈现铺展生长状态(见图7a)，在25℃条件下，细胞呈球形脱附状态(见图7b)。

③第二次循环使用温度响应型细胞培养板进行细胞培养

使用步骤②细胞脱附后的温度响应型细胞培养板进行二次细胞培养，并在不同条件下拍摄光学显微镜照片，结果如图8所示，由图8可知，经过过夜培养后，小鼠胚胎成纤维细胞在温度响应型细胞培养板的板孔内的二次生长状态良好(见图8a)，环境温度由37℃降至25℃后，细胞在温度响应型细胞培养板的板孔内呈球形状态(见图8b)，经过轻轻的吹洗，细胞即可从温度响应型细胞培养板的板孔表面脱附(见图8c)，细胞在板孔表面的贴附和脱附比例如图9所示，细胞脱附率约为94％。在细胞脱附后，采用扫描电镜对二次使用后的细胞培养板的板孔底面进行表征，结果如图10所示，由图10可知，pnipam纳米凝胶颗粒的在孔板底面仍然保持稳定的、均匀的固定，说明本发明所述方法制作的温度响应型智能细胞培养板具有良好的使用稳定性。

实施例3

本实施例中，制作温度响应型智能细胞培养板的步骤如下：

(1)采用过滤灭菌法对去离子水进行灭菌处理得到灭菌去离子水，将tris加入灭菌去离子水中搅拌均匀形成tris溶液，tris的浓度为20mmol/l，向tris溶液中缓慢滴入稀盐酸调节其ph值至10得到灭菌tris缓冲液。

将pnipam纳米凝胶颗粒按照pnipam纳米凝胶颗粒与tris缓冲液的质量比为1:500的比例加入温度为25℃的上述tris缓冲液中，在50w的功率下超声30min使纳米凝胶颗粒均匀分散在tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，按照盐酸多巴胺与纳米凝胶分散液的质量比为1:1000的比例向纳米凝胶颗粒分散液中加入盐酸多巴胺，在50w的功率下超声40s使盐酸多巴胺充分溶解得到修饰液。

(2)立即将修饰液加入聚氯乙烯材质的96孔细胞培养板的板孔内，在40℃的水浴中振荡反应3h将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养板的板孔壁面上，将板孔内的溶液倒出，然后用去离子水对细胞培养板的板孔内表面进行洗涤以去除与细胞培养板结合不稳定的pnipam纳米凝胶颗粒，再将清洗后的细胞培养板在40℃干燥去除细胞培养板表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养板的制作。

以下考察本实施例制备的温度响应型智能细胞培养板的细胞毒性。

通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(cck-8)对本实施例制作的的温度响应型智能细胞培养板进行细胞毒性测试，结果见图11，在经过24小时细胞培养后，其细胞活性值约为95％，在经过72小时细胞培养后，其细胞活性值增加至105％。以上实验结果表明本发明方法制作的温度响应型智能细胞培养板具有良好的生物相容性。

实施例4

本实施例中，制作温度响应型智能细胞培养板的步骤如下：

(1)采用过滤灭菌法对去离子水进行灭菌处理得到灭菌去离子水，将tris加入灭菌去离子水中搅拌均匀形成tris溶液，tris的浓度为12mmol/l，向tris溶液中缓慢滴入稀盐酸调节其ph值至8得到灭菌tris缓冲液。

将pnipam纳米凝胶颗粒按照pnipam纳米凝胶颗粒与tris缓冲液的质量比为1:300的比例加入温度为20℃的上述tris缓冲液中，在45w的功率下超声20min使纳米凝胶颗粒均匀分散在tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，按照盐酸多巴胺与纳米凝胶分散液的质量比为1:600的比例向纳米凝胶颗粒分散液中加入盐酸多巴胺，在50w的功率下超声60s使盐酸多巴胺充分溶解得到修饰液。

(2)立即将修饰液加入聚苯乙烯材质的12孔细胞培养板的板孔内，在20℃的水浴中振荡反应8h将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养板的板孔壁面上，将板孔内的溶液倒出，然后用去离子水对细胞培养板的板孔内表面进行洗涤以去除与细胞培养板结合不稳定的pnipam纳米凝胶颗粒，再将清洗后的细胞培养板在25℃干燥去除细胞培养板表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养板的制作。

实施例5

本实施例中，制作温度响应型智能细胞细胞培养瓶的步骤如下：

(1)采用过滤灭菌法对去离子水进行灭菌处理得到灭菌去离子水，将tris加入灭菌去离子水中搅拌均匀形成tris溶液，tris的浓度为13mmol/l，向tris溶液中缓慢滴入稀盐酸调节其ph值至9得到灭菌tris缓冲液。

将pnipam纳米凝胶颗粒按照pnipam纳米凝胶颗粒与tris缓冲液的质量比为1:350的比例加入温度为25℃的上述tris缓冲液中，在40w的功率下超声25min使纳米凝胶颗粒均匀分散在tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，按照盐酸多巴胺与纳米凝胶分散液的质量比为1:700的比例向纳米凝胶颗粒分散液中加入盐酸多巴胺，在40w的功率下超声45s使盐酸多巴胺充分溶解得到修饰液。

(2)立即将修饰液加入聚乙烯材质的细胞培养瓶中，在35℃的水浴中振荡反应6h将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养瓶的内壁上，将细胞培养瓶内的溶液倒出，然后用去离子水对细胞培养瓶内表面进行洗涤以去除与细胞培养瓶结合不稳定的pnipam纳米凝胶颗粒，再将清洗后的细胞培养瓶在35℃干燥去除细胞培养瓶内表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养瓶的制作。

实施例6

本实施例中，制作温度响应型智能细胞培养皿的步骤如下：

(1)采用过滤灭菌法对去离子水进行灭菌处理得到灭菌去离子水，将tris加入灭菌去离子水中搅拌均匀形成tris溶液，tris的浓度为14mmol/l，向tris溶液中缓慢滴入稀盐酸调节其ph值至9.5得到灭菌tris缓冲液。

将pnipam纳米凝胶颗粒按照pnipam纳米凝胶颗粒与tris缓冲液的质量比为1:450的比例加入温度为4℃的上述tris缓冲液中，在50w的功率下超声25min使纳米凝胶颗粒均匀分散在tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，按照盐酸多巴胺与纳米凝胶分散液的质量比为1:800的比例向纳米凝胶颗粒分散液中加入盐酸多巴胺，在50w的功率下超声50s使盐酸多巴胺充分溶解得到修饰液。

(2)立即将修饰液加入聚苯乙烯材质的细胞培养皿中，在40℃的水浴中振荡反应5h将pnipam纳米凝胶颗粒固定在细胞培养皿的壁面上，将细胞培养皿内的溶液倒出，然后用去离子水对细胞培养皿的内表面进行洗涤以去除与细胞培养皿结合不稳定的pnipam纳米凝胶颗粒，再将清洗后的细胞培养皿在50℃干燥去除细胞培养皿表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养皿的制作。