一种食用菌快速制种方法与流程

本发明属于食用菌菌种生产技术领域，具体涉及一种食用菌快速制种的方法。

背景技术：

在食用菌生产中，菌种质量好坏直接决定了生产的成败，因此，菌种生产是食用菌生产过程中最为关键的第一步。目前生产上使用的食用菌菌种主要有2种，一种是传统的农业式栽培所使用的固体菌种。依据《食用菌菌种管理办法》(农业部于2006年6月1日颁布)，食用菌菌种生产实行母种、原种、栽培种的三级繁育程序。根据《食用菌菌种通用技术要求》(行业标准NY/T 1742-2009)，母种长满90mm平板所需最长时间为香菇14～16天、平菇7～9天、黑木耳14～16天、金针菇10～14天、双孢蘑菇28～32天、毛木耳14～16天；原种长满瓶最长时间为香菇50天、平菇30天、黑木耳45天、金针菇35天、双孢蘑菇45天、毛木耳35天；栽培种长满瓶所需最长时间分别为香菇45天、平菇25天、黑木耳40天、金针菇30天、双孢蘑菇40天、毛木耳30天。因此，这6类食用菌制种所需时间约为香菇110天、平菇62天、黑木耳99天、金针菇75天、双孢蘑菇113天、毛木耳79天。由此可知，传统的食用菌农业式栽培所用的固体菌种存在周期长、生产环节多、操作复杂、生长效率低、成本高、容易造成菌种污染等缺点，而且菌种污染(特别是母种污染)造成的生产事故，往往发生在大规模接种栽培袋后(菌种污染发现滞后)，造成的损失很大。另一种是食用菌工厂式生产所用的液体菌种。液体菌种通常是采用生物培养(发酵)设备，通过液体深层培养(发酵)的方式生产食用菌菌种，其具有制种快、出菇齐、转潮快、活力强、纯度高、防污染、缩短栽培周期和成本低等优点，适于进行标准化、工厂化和周年化生产，是食用菌的发展趋势。但是液体菌种制备存在需要较高投资的硬件设备，建设无菌接种间，技术要求高，需聘请专业技术人员等缺点；对于小的厂家或自做菌种的农户，使用发酵罐制作菌种难度很大。故农业式生产食用菌时基本上没有人采用液体菌种。

从上述可知，目前农业式栽培中所用的固体菌种亟需解决生产周期长和菌种污染发现滞后等问题。

技术实现要素：

针对传统的食用菌固体菌种生产中存在的生产周期长、生长效率低、菌种污染发现滞后等缺点，本发明目的在于提供一种食用菌快速制种方法。

本发明另一目的在于提供一种食用菌母种的繁殖方法。

本发明第三目的在于提供食用菌母种纯度的检测方法。

本发明第四目的在于提供一种检测用液体培养基。

本发明第五目的在于提供上述检测用液体培养基在食用菌菌种纯度检测上的用途。

为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：

本发明提供了一种食用菌快速制种方法，包括如下步骤:

(1)、母种繁殖：将食用菌母种按重量比1：10～20的比例加入到无菌水中，匀浆，得匀浆菌液；将匀浆菌液均匀分布在PDA平板培养基或马铃薯全粉培养基上；在适温、避光条件下培养3-7d，表面长满为止；

(2)、纯度检测：刮取步骤(1)中PDA平板培养基或马铃薯全粉培养基上长满的母种菌丝体，按照母种菌丝体与检测用液体培养基之间重量比为1:5～10的比例，将母种菌丝体置于检测用液体培养基中，匀浆；然后在25～28℃、避光条件下静置培养2d；观察检测用液体培养基是否浑浊，是否有异味；选留无浑浊、无异味的母种菌液；

(3)、母种稀释，接种栽培种培养基：将步骤(2)所得的无混浊，无异味的母种菌液，分装至无菌三角瓶中，按照重量比1：10～15的比例用无菌水稀释母种菌液；再按照重量比为5～8％的比例将稀释后的母种菌液接种到栽培种培养基上；接种时，先取下栽培种培养基外的菌种盖，拨出栽培种培养基中心的塑料棒，露出中央孔，将母种菌液倒入中央孔中，盖上菌种盖，平放菌袋，让菌液渗透到培养基壁上，摆放时，将菌袋翻面，使有菌液的一面朝上，菌液向培养基另一面渗透，从而达到培养基与菌液混合的效果；在适温、避光条件下进行培养，菌丝长满培养基为止，即得该食用菌的栽培种。

上述制种方法步骤(1)中所述的适温为23～29℃，根据食用菌不同，选择相应的最适温度，具体温度按照《食用菌菌种通用技术要求》(行业标准NY/T 1742-2009)表3的标准进行。

上述制备方法步骤(1)中所述的PDA平板培养基按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(1)中所述的马铃薯全粉培养基的组成成分及其比例为：马铃薯全粉10～20g，葡萄糖2～10g，琼脂粉12～20g，水1000ml。

所述的马铃薯全粉培养基的制备方法为：按照重量比称取马铃薯全粉、葡萄糖和琼脂粉，混合均匀,然后加入容器(如三角瓶)中，按比例加入水，摇匀，封上封口膜或牛皮纸，121℃灭菌30min，备用。其中马铃薯全粉、葡萄糖和琼脂粉皆可从市场上购买得到。

上述制种方法步骤(2)中所述的检测用液体培养基的组成成分及其比例为：葡萄糖20g，酵母粉2g，水1000ml。

所述的检测用液体培养基的制备方法为：按比例将葡萄糖、酵母粉加入到水中，混合均匀，在121℃灭菌30min即可。

上述制种方法步骤(3)中所述的栽培种培养基的原料是麦粒、木屑、棉籽壳或玉米芯等；按食用菌种类选择不同的原料制作的栽培种培养基。

上述制种方法步骤(3)中所述的适温为20～31℃；不同的食用菌选择不同的培养温度。具体温度根据《食用菌菌种通用技术要求》(行业标准NY/T1742-2009)中表6的规定的温度培养。

本发明还提供了一种食用菌母种的繁殖方法，包括将食用菌母种按重量比1：10～20的比例加入到无菌水中，匀浆，得匀浆菌液；将匀浆菌液均匀分布在PDA平板培养基或马铃薯全粉培养基上；在适温、避光条件下培养3-7d，表面长满为止。

上述繁殖方法中所述的适温为23～29℃，根据食用菌不同选择相应的最适温度，具体温度可参见《食用菌菌种通用技术要求》(行业标准NY/T1742-2009)表3的标准进行。

本发明还提供了食用菌母种纯度的检测方法，包括如下步骤：

(1)按照每1000ml水中含有葡萄糖20g和酵母粉2g的比例制作检测用液体培养基；

(2)刮取长满PDA平板培养基或马铃薯全粉培养基上的食用菌母种，按重量比1:5～10的比例，加入到步骤(1)制备的检测用液体培养基中，匀浆；再将检测用液体培养基在25～28℃、避光条件下静置培养2d；

(3)观察培养基是否混浊，是否有异味；无浑浊、无异味的即为无污染，纯度高的食用菌母种。

本发明还提供了一种检测用液体培养基，其组成成分及其比例为：葡萄糖20g，酵母粉2g，水1000ml。

上述检测用液体培养基在在食用菌菌种纯度检测上的应用。

本发明具有的优点和有益效果：(1)、本发明制种方法中母种经过纯度检测步骤，避免了菌种源头污染的风险。(2)、本发明方法菌种制作速度快，菌龄一致性高。(a)、本发明方法中母种采取菌种在培养基表面涂布的的方式制作，相比于常规的中央接种点萌发后菌丝向培养基周围漫延，本方法使培养基表面全部分布接种点，菌丝萌发后1天左右即长满平板，长满时间只有常规方法所需要的一半左右。(b)、采取母种直接接种栽培种培养基，省去了原种制作环节，制作菌种所需要时间大大缩短，如平菇所需要时间由常规的60天左右，缩短至13-16天；香菇所需要时间由常规的110天左右，缩短至24-26天。(c)常规制种时，菌丝从上表面生长至底部，所需的时间长，表面和底面的菌龄相差很多，如平菇相差20天左右，香菇相差40天左右。而本发明采用多点萌发，菌液接触至培养料的地方，均是萌发点，所以菌龄一致性很高，平菇相差3天左右，香菇相差7天左右。菌龄一致性高，则栽培袋上发菌速度大致相同，适宜出菇管理。(3)、本发明制种方法所需设备简单，生产成本低。传统的制种方式，由于有原种制作环节，培养时间很长，培养室周转率低，耗能高。而使用发酵罐进行液体培养，因为需要购买发酵罐，建设无菌接种间，聘请懂发酵的技术人员等，因而成本高。而本发明，只需要超净工作台，三角瓶，均匀器就可达到发酵罐制作液体菌种的效果，灵活机动。本发明适合中小型企业、个人制用菌种。

附图说明：

图1.母种纯度检测时未受到细菌污染的菌液照片。

图2.母种纯度检测时受到细菌污染的菌液照片。

图3.平菇使用本发明母种菌液接种后培养6天菌丝照片。

图4.平菇使用固体菌种接种后培养6天菌丝照片。

图5.金针菇使用本发明母种菌液接种后培养20天菌丝照片。

图6.金针菇使用固体菌种接种后培养20天菌丝照片。

图7.香菇使用本发明母种菌液接种后培养25天菌丝照片。

图8.香菇使用固体菌种接种后培养25天菌丝照片。

图9.黑木耳使用本发明母种菌液接种后培养25天菌丝照片。

图10.黑木耳使用固体菌种接种后培养25天菌丝照片。

图11.白灵菇使用本发明母种菌液接种后培养18天菌丝照片。

图12.白灵菇使用固体菌种接种后培养18天菌丝照片。

图13.杏鲍菇使用本发明母种菌液接种后培养18天菌丝照片。

图14.杏鲍菇使用固体菌种接种后培养18天菌丝照片。

具体实施方式：

以下通过实施例对本发明作进一步说明，但是对本发明不构成任何限制。

实施例1平菇菌种制作对比试验

按照如下方法进行：

(1)母种的快速繁殖在无菌条件下，按重量比1：15比例将母种加入到无菌水中，匀浆，得匀浆菌液；用无菌喷壶或涂布器将匀浆菌液均匀分布于PDA平板培养基表面，封上培养皿边缘，在25℃、避光条件下培养3～4天，菌丝长满平板，即为母种。

(2)母种纯度的检测在250ml三角瓶中装入检测用液体培养基(其组成成分为20g葡萄糖，2g酵母粉，水1000ml)100ml，121℃下30min灭菌，冷却至常温待用。将步骤(1)中长满的PDA平板培养基，1个平板对应1个三角瓶，刮取平板上全部培养基至三角瓶中，无菌条件下，匀浆；在25℃、避光条件下静置培养2d，得母种菌液；观察培养基是否混浊，是否有异味。培养基澄清(见图1)，无异味的，说明母种是纯的，可以进行下一步扩繁；否则，培养基混浊(见图2)，则母种污染，不能使用。

(3)母种稀释，接种栽培种培养基：将澄清、无异味的母种菌液，按照1：10的比例加入无菌水稀释；将灭过菌的麦粒培养基(组成成分为98％的麦粒，2％石膏，见NY/T 528-2010食用菌菌种生产技术规程附录B.5。麦粒用清水浸泡24-36h，捞起沥干，按比例加入石膏粉，混匀后，装袋，126℃灭菌2h,冷却至室温)，按重量百分比为为5％的接种量，接入稀释的母种菌液，摇匀。放入培养室，在25℃、避光条件下培养8-10天，长满培养袋为止。

同时用传统方法制作常规的固体菌种，分别接种麦粒(配方相同，直接从菌种口上倒入液体培养基或接入固体培养基到麦粒表面)，相同条件下培养。

结果使用本发明方法制作的母种菌液接种后培养6天(见图3)，菌丝接近布满麦粒，培养9天左右全部长满；而使用传统的固体菌种接种后培养6天(见图4)，菌丝刚萌发少许，最终培养23天长满。

从上述结果可以看出，相比于使用传统的固体菌种，使用本发明方法制作的平菇母种菌液接种麦粒，制种时间缩短60％。说明本发明方法食用菌制种周期短，制种速度快，且避免了母种污染的问题。

实施例2金针菇、香菇和黑木耳菌种制作对比试验

按照如下方法进行：

(1)母种的快速繁殖在无菌条件下，按重量比1：10的比例将金针菇、香菇或黑木耳母种加入到无菌水中，匀浆,得匀浆菌液；采用无菌喷壶或涂布器，将匀浆菌液均匀分布于PDA培养基表面，封上培养皿边缘，在25℃避光培养6～7天，菌丝长满平板，即为母种。

(2)母种纯度的检测方法同实施例1步骤(2)。

(3)母种稀释，接种栽培种培养基将步骤(2)中所得的澄清，无异味的母种菌液，按照重量比1：10用无菌水稀释。在灭过菌的木屑培养基(其组成成分为78％木屑，20％麸皮，1％蔗糖、1％石膏，见NY/T 528-2010食用菌菌种生产技术规程附录B.1.1。按比例称取木屑、麸皮、石膏，混匀，将蔗糖加入水中，按培养料：水的重量比为2：3，将水加入培养料中，混匀，使水充分被吸收，装袋，中央插入空心塑料棒，无棉盖体封口，126℃灭菌2h,冷却至室温)按重量百分比为5％的比例将稀释后的母种菌液接种到木屑培养基上，将母种菌液和培养基混匀。放入培养室，在25℃、避光条件下培养22～28天，长满菌种袋。

同时用常规的固体菌种，分别接种木屑培养基(配方相同，拨出中央的空心塑料棒，直接从菌种口上倒入液体培养基到中央；或接入固体培养基到木屑培养基表面)，相同条件下培养。

结果金针菇使用本发明方法制作的母种菌液接种后培养20天(见图5)，菌丝长满木屑培养基；而使用固体菌种接种后培养20天(见图6)，菌丝长满约4/5。

香菇使用本发明方法制作的母种菌液接种后培养25天(见图7)，菌丝接近长满木屑培养基；而使用传统的固体菌种接种后培养25天(见图8)，菌丝长满约4/5。

黑木耳使用本发明方法制作的母种菌液接种后培养25天(见图9)，菌丝接近长满木屑培养基；而使用传统的固体菌种接种后培养25天(见图10)，菌丝长满约1/2。

从上述对比试验结果可以看出，相比于使用传统的固体菌种，利用本发明方法制作的金针菇、香菇、黑木耳的母种菌液接种木屑培养基，制种时间缩短10天以上。说明本发明制种方法周期短、速度快，且能避免母种污染。

实施例3白灵菇、杏鲍菇菌种制作对比试验

按照如下方法进行：

(1)母种的快速繁殖在无菌条件下，按重量比1：10的比例将白灵菇或杏鲍菇母种加入到无菌水中，匀浆，得匀浆菌液；采用无菌喷壶或涂布器，将匀浆菌液均匀分布于PDA培养基表面，封上培养皿边缘，在25℃、避光条件下培养4～5天，菌丝长满平板，即为母种。

(2)母种纯度的检测同实施例1步骤(2)。

(3)母种稀释，接种栽培种培养基将步骤(2)中所得的澄清，无异味的母种菌液，按照重量比1：10的比例加入无菌水稀释。在灭过菌的棉籽壳培养基(其组成成分为99％棉籽壳，1％石灰，见NY/T 528-2010食用菌菌种生产技术规程附录B.3.1。按比例称取棉籽壳、石灰，按培养料：水的重量比为2：3，将水加入培养料中，混匀，使水充分被吸收，装袋，中央插入空心塑料棒，无棉盖体封口，126℃灭菌2h,冷却至室温)按重量百分比5％的比例将稀释的母种菌液接种到棉籽壳培养基上，摇匀；放入培养室，在25℃、避光条件下培养20～23天，长满菌种袋。

同时用常规的固体菌种，分别接种棉籽壳培养基(配方相同，拨出中央的空心塑料棒，直接从菌种口上倒入液体培养基到中央；或接入固体培养基到木棉籽壳培养基表面)，相同条件下培养。

结果白灵菇使用本发明方法制作的母种菌液后培养18天(见图11)，菌丝长满棉籽壳培养基的约2/3；而使用传统的固体菌种后培养16天(见图12)，菌丝长满约1/3。

杏鲍菇使用本发明方法制作的母种菌液接种后培养18天(见图13)，菌丝长满棉籽壳培养基的约4/5；而使用固体菌种接种后培养18天(见图14)，菌丝长满约1/3。

从上结果可以看出，相比于使用传统的固体菌种，用本发明方法制作的白灵菇、杏鲍菇的母种菌液接种棉籽壳培养基，制种时间缩短5-10天。说明本发明方法制种周期短，制种速度快，并且避免了母种污染的问题。

此外，上述结果还说明了利用本发明方法制种方法简单，所要求的设备简单，制作成本低。