产间苯三酚的海藻附生假单胞菌及人工培养方法与流程

本发明属于海洋微生物资源领域，具体的说是由海藻分离获得的假单胞菌(Pseudomonas thivervalensis)，菌株号TBF-165，通过人工培养发酵，可产生用途广的间苯三酚。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月29日，保藏编号CGMCC No.10934，分类命名赛维瓦尔假单胞菌Pseudomonas thivervalensis。

背景技术：

间苯三酚用途广，是重要的化工和医药中间体，可用于化工、医药、材料领域，如染料偶合、合成橡胶、轮胎增粘、纺织品与皮革染色等；同时也是性能优越的抗氧化剂和化学防腐剂，还可用于检验香草素、木质素、糖醛、多缩戊糖等；间苯三酚还是重要的制备心血管系统、抗癌、抗艾滋病及肝炎药物中间体，尤其是近几年黄酮类药物的兴起，更是凸显了间苯三酚的供需矛盾。

间苯三酚市场需求量大，经济价值较高，目前国内外生产主要靠化学合成，常用的2，4，6-三硝基甲苯为原料，经间苯三胺途径工业化生产间苯三酚的方法，污染环境且存在安全隐患；苯卤化物为原料成本高，工艺复杂，难于工业化生产；而以1，3，5-三异丙基苯为原料的工艺路线，虽然污染小，成本较低，但氧化阶段产物复杂，分离精制较困难。亟待探索对环境友好的生物生产途径来解决该难题。

与其它生物途径获得间苯三酚相比，微生物具有可人工培养发酵，成本低，产物的得率和纯度较高，容易工业化生产的优势。微生物生产最重要的是种质资源，因此获得产品的新种质资源是各国争夺自主知识产权的目标。

有报道推测荧光假单胞菌，产生2，4-二乙酰基间苯三酚的同时也产生间苯三酚，但未见荧光假单胞菌产生间苯三酚的科研证实，也未见有关假单胞菌属其它种类菌产生间苯三酚的报道，更没有关于海洋生境微生物产生间苯三酚的科研报道。

我国是海洋大国，海洋微生物资源很丰富，而相对于开发时间较久的陆地微生物，这一生境宝贵资源的开发时间较短，发现有用化合物的机率相对较大，我们由渤海采集的海藻分离获得一株假单胞菌可以产生间苯三酚，该菌株对环境没有污染，菌株人 工培养容易，所需培养材料价格低廉，各地市场可随处购买，培养周期短，容易实现产业化，开发前景好。

技术实现要素：

本发明目的是提供一株新发现的海洋生境假单胞菌Pseudomonas thivervalensis，该菌能通过人工培养方法生产间苯三酚。发明充分利用了海洋微生物这一新开发的天然资源，菌株经测定生物学及化学特性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环境没有污染，所用原料廉价，生产成本低，容易实现产业化，开发前景好。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，由渤海潮间带海藻分离获得了一株产间苯三酚新资源菌株，赛维瓦尔假单胞菌Pseudomonas thivervalensis菌株，菌株编号TBF-165，保藏编号为：CGMCC No.10934。

1)培养基配方为：蛋白胨15-20g/L，甘油7-10mL/L，K₂HPO₄，1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 8.0-10.0g/L，pH 7.0-7.5，琼脂16-18g；保藏编号为：CGMCC No.10934的TBF-165菌株，接入在上述培养基置25℃-28℃培养常规培养40-48小时，菌落表面光滑不透明，浊黄红色，在MPDA培养基上菌落呈蓝色，菌体杆状，直或微弯曲，革兰氏染色阴性，0.4-1.3μm×1.4-5.0μm，无荚膜与芽胞，极生鞭毛。生理生化特征：TBF-165菌株能在5％-10％NaCl的环境生长，明胶酶试验、硝酸盐还原、接触酶试验为阳性；淀粉水解、VP试验、吲哚反应为阴性，能利用柠檬酸盐和丙酸盐，氧化葡萄糖产酸，不能水解尿素；

2)用常规诱变育种与驯化方法对TBF-165菌株进行改造，采用死亡率大于90％紫外(250nm)氯化锂(氯化锂2.0％)复合诱变处理条件，通过生物学菌落特征对比从诱变平板中初步选取菌株，选择的菌株经高效液相色谱HPLC与亲本菌株比较峰值确定产量高的菌株，选出的菌株，加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl，15.0-20.0g/L，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，驯化培养30小时，加入55℃水浴热激活10分钟，转入相同的固体培养基纯化为单克隆菌落，连续传代10代，选择生物学与化学性状稳定的菌株做为选育的高产菌株；

3)改造好的TBF-165菌株加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 15.0-20.0g/L，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，琼脂16-18g，培养40-48小时，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入不加琼脂的培养液，转速150rpm，振荡培养35-40小时为种子液，再将种子液接入所需体积 的上述培养液中(根据需要可逐级放大)，25℃-28℃，150rpm，振荡培养65-72小时，获得发酵液，培养好的发酵液加入3倍的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯减压浓缩，即得到间苯三酚。选育的高产菌株产量由野生菌株原来的150mg/L提高到1126mg/L，提高了800.8％，菌株生物学与化学性状稳定

本发明有益效果：

1从海洋微生物中发现一个产间苯三酚的新种质资源，为我国绿色生产国民经济需求量大的间苯三酚提供一个新途径；

2为基因控制产间苯三酚提供一个新基因资源。目前虽然有多种产间苯三酚基因报道，但海洋生境微生物生存环境特殊，此菌株具有明显的海洋环境生长特性，其控制间苯三酚产生的基因也是新的基因资源；

3与已报道的产间苯三酚菌株相比，该菌株生长温度低，可节省能源，能利用资源丰富廉价的海藻，生产成本低，操作简单，开发前景好，容易实现产业化。

附图说明

图1是野生菌株与高产菌株产生间苯三酚HPLC测试峰比较图。

具体实施方式

本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中，本发明的具体技术步骤如下：

实施例1：TBF-165菌株的培养性状及生理生化测试

以保藏编号为：CGMCC No.10934的TBF-165菌株，经蛋白胨15-20g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 20.0-30.0g/L，琼脂16-18g，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，培养40-48小时，前期浊白色，后转变为浊红色，菌体杆状，直或微弯曲，革兰氏染色阴性，0.4-1.3μm×1.4-5.0μm，无荚膜与芽胞，极生鞭毛，常规生理生化测试结果如下表，结合16SrDNA测试结果，鉴定TBF-165菌株为假单胞菌属的赛维瓦尔Pseudomonas thivervalensis种。

菌株TBF-165生理生化特征

菌株培养40-48小时为一代，连续在相同培养基传代接种10代后，与原始菌株进行对比，各种性状相同，证明菌株生物学性状稳定。

实施例2：高产菌株的选育

为提高产量，降低成本，用常规诱变育种与驯化方法对TBF-165菌株进行，采用选取死亡率90％的处理条件为诱变合适条件，常规的紫外(250nm)氯化锂(氯化锂2.0％)复合诱变，通过生物学菌落特征对比从诱变平板中初步选取菌株，然后发酵提取，高效液相色谱HPLC确定选择产量高的菌株，选出的高产菌株加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 15.0-20.0g/L，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，驯化培养30小时，加入55℃水浴热激活10分钟，转入相同的固体培养基，纯化培养为单克隆菌落，连续传代培养10代，用上述方法观察比较其生物学指标及间苯三酚产量是否变化，选择生物学与化学性状稳定的菌株做为选育菌株，经选择获得一株高产菌株，产量由野生菌株原来的150mg/L提高到1126mg/L，提高了800.8％，(参见图1)高产菌株生物学与化学性状稳定.

实施例3：TBF-165菌株的人工培养及提取

以保藏编号为：CGMCC No.TBF-165菌株在海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl，15.0-20.0g/L，琼脂16-18g，pH 7.0-7.5，固体培养基25℃-28℃培养45-48小时，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入与上配方相同不加琼脂的培养液，转速150rpm，振荡培养35-40小时为种子液，再将种子液接入所需体积的上述培养液中(根据需要可逐级放大)，25℃-28℃，150rpm，振荡培养65-72小时，获得发酵液。培养好的发酵液用常规方法加入3倍体积的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯减压浓缩，即得到间苯三酚。