猪圆环病毒II型口服病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种口服疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种口服猪圆环病毒疫苗及其制备方法和应用

背景技术：

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今发现最小的动物病毒之一，属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的单股环状负链DNA病毒，20面体对称，直径17-20nm，已知PCV具有两个血清型，即猪圆环I型病毒(PCV1)和猪圆环II型病毒(PCV2)，其中，PCV 1为非致病性病毒，PCV2为致病性的病毒。

尽管猪圆环病毒基因组结构简单，但对畜牧业的危害巨大，猪圆环病毒病是近几年影响世界养猪业的最重要的病毒性传染病之一。

我国猪圆环II型病毒(PCV2)的感染具有以下三大特征：

1)感染率高，感染面广：个体阳性率为21.7-87.3％，猪场阳性率为38.2-100％；

2)PCV2的感染率逐年上升：2003年为21.7％，2006年为38.3％，2008年为70.9％，2012年为83.2％；

3)PCV2与其他病原的混合感染严重：在感染PCV2病毒的血清中，经常能够检测到混合感染的蓝耳病毒PRRSV、伪狂犬病毒PRV、细小病毒PPV、肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、流行性腹泻病毒PEDV、猪流感病毒SIV等；有统计报道表明PCV2病毒二重感染率超过50％，与蓝耳病毒PRRSV共感染率为51.9％、伪狂犬病毒PRV共感染率为62.44％、细小病毒PPV共感染率为56.9％。

更为严峻的是，我国养猪业中的PVC2已呈现感染日龄早(产房哺乳仔猪即可感染)的状况。因此PCV2已被认为是世界养猪业的重要病原，能引起猪的免疫抑制，造成二重或者三重感染，发病率和死亡率高，给养猪业带来重大危害、和严重的经济损失。目前，PCV2疫苗已经成为继猪瘟、口蹄疫、蓝耳病和伪狂犬等疫苗后用量最大、用量最多的猪病疫苗品种，市场需求量大。

PCV2疫苗主要分为三类：全病毒灭活苗，PCV1-2重组病毒灭活疫苗，和类病毒颗粒亚单位疫苗。其中，PCV2亚单位疫苗(主要是类病毒颗粒疫苗)，已经证实免疫效果要优于全病毒灭活苗，比灭活疫苗在安全性、有效性和制造工艺上都有了很大改进，正在成为新一代基因工程疫苗发展的新趋势。

目前市场上销售的PCV-2Cap蛋白类病毒颗粒疫苗有两类：

A)一类是大肠杆菌制备的PCV2类病毒颗粒(原核表达)，PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV-2Cap蛋白，制备亚单位疫苗。大肠杆菌表达系统具有生长速度快、易培养、表达蛋白产量高等特点，但其表达的蛋白大多以无活性的包涵体形式存在，经过蛋白变性复性等一系列操作后，可以得到可溶性蛋白。但是原核表达容易出现不具备活性的包涵体，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果，成本高，生产周期长(每批次耗时约2-3个月)、效率低，获得的蛋白免疫原性较差；特别是大肠杆菌表达的蛋白虽然经过纯化，依然有可能残留内毒素，免疫动物会产生副反应。

B)另一类由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达制PCV2类病毒颗粒疫苗由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达的类病毒颗粒(真核表达)，用PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的PCV-2Cap蛋白，经纯化、与免疫佐剂混合后获得，在临床上以注射方式免疫，真核表达的工艺要求较高，产品中可能会混有杆状病毒颗粒，产生副反应，存在一定的生物安全风险。

另外，目前PCV2疫苗以注射为主，可用于口服的疫苗尚未见有报道。

技术实现要素：

针对目前PCV2疫苗存在的生产效率低、副反应大、不能口服等缺陷，本发明提供了一种可口服的PCV2疫苗。

本发明第一个方面是提供一种重组马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，由重组载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株制备。

所述重组载体通过将编码猪圆环病毒衣壳蛋白(本发明下文中也称为“猪圆环病毒衣壳蛋白Cap”或“Cap蛋白”)的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体所构建。

在一种优选实施例中，所述猪圆环病毒衣壳蛋白优选为猪圆环病毒II型病毒衣壳蛋白。

本发明第二个方面是提供一种制备所述猪圆环病毒II型病毒样颗粒的方法，包括：

所述重组马克斯克鲁维酵母重组工程菌培养发酵，在细胞内组装成猪圆环病毒II型病毒样颗粒；

收集培养发酵的菌，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒。

或者所述方法还包括如下构建所述重组马克斯克鲁维酵母重组工程菌的步骤：

将编码猪圆环病毒衣壳蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体，构建重组载体；

将重组载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建得到所述重组马克斯克鲁维酵母重组工程菌。

在一种优选实施例中，所收集的培养发酵的菌，可以单独作为猪圆环病毒II型病毒样颗粒产品，或者破裂后收集释放的病毒样颗粒作为猪圆环病毒II型病毒样颗粒产品，或破裂后的细胞破碎液或破碎液干燥产物作为猪圆环病毒II型病毒样颗粒产品。

本发明第三个方面是提供一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒口服药物和/或疫苗，包括所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒。

本发明第四个方面提供了一种制备猪圆环病毒II型病毒样颗粒药物和/或疫苗的方法，尤其是制备猪圆环病毒II型口服病毒样颗粒药物和/或疫苗(猪圆环病毒II型病毒引发的疾病的口服药物和/或疫苗)的方法，包括以所收集的培养发酵的菌或破裂后获得病毒样颗粒，作为活性成分或作为活性成分之一，制备猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。

在一种优选实施例中，收集菌体后，直接破壁，所得产物作为口服疫苗。

在一种优选实施例中，所收集的培养发酵的菌破裂后释放病毒样颗粒，加入保护剂制备猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。

其中，所述保护剂可以是蔗糖、乳糖、海藻糖中的一种或多种。

在另一种优选实施例中，所收集的培养发酵的菌破裂后，将细胞破碎液喷雾干燥制备猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。

本发明第六个方面是提供一种所述猪圆环病毒II型病毒样颗粒或猪圆环病毒II型病毒样颗粒的应用，优选为制备预防和/或治疗猪圆环病毒II型病毒引发的疾病的药物和/或疫苗。

在一种优选实施例中，所述猪圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列包括(优选地，为)：

1)SEQ ID No.1氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.1氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有猪圆环病毒核衣壳Cap蛋白活性的由SEQ ID No.1氨基酸序列衍生的蛋白质。

在一种优选实施例中，所述SEQ ID No.1所示猪圆环病毒衣壳蛋白中第226位苯丙氨酸被亮氨酸取代，如包括(并优选为)：SEQ ID No.2氨基酸序列。

在一种优选实施例中，编码所述猪圆环病毒衣壳蛋白的核苷酸系列包括、并优选为SEQ ID No.3所示序列

在一种优选实施例中，所述方法中，根据马克斯克鲁维酵母的密码子偏好性，对编码所述猪圆环病毒衣壳蛋白的核苷酸进行密码子优化，更优选为在保证编码猪圆环病毒衣壳蛋白序列相同的条件下进行密码子优化。

在一种优选实施例中，所述马克斯克鲁维酵母表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因和终止子基因序列，并优选为不含有无抗性基因序列、大肠杆菌起始复制序列。更优选地，所述马克斯克鲁维酵母表达载体包括、并优选组成为SEQ ID No.6所示核苷酸序列。

在一种优选实施例中，所述马克斯克鲁维酵母表达载体营养缺陷筛选标记基因。

在本发明的更一种优选实施例中，所述重组载体包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码猪圆环病毒衣壳蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列、营养缺陷筛选标记基因序列；更优选地，不含有无抗性基因序列、大肠杆菌起始复制序列。

本发明所述马克斯克鲁维酵母的营养缺陷型菌株，为马克斯克鲁维酵母敲除部分或全部特定营养基因所得。所述特定营养基因优选为选自URA3基因、HIS3基因、ADE2基因中的任意一种或几种，并优选为URA3基因。

其中，在一种更优选实施例中，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株在Uracil营养缺陷培养基中不能生长。

在本发明的优选实施例中，上述的马克斯克鲁维酵母优选为CGMCC No.10621。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年3月13日。

在本发明的一种优选实施例中，所述转化可以是电转化或化学转化中的任意一种或几种。

在本发明的一种优选实施例中，所述重组酵母培养所用培养基中含有葡萄糖、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾。

其中，所述猪圆环病毒II型病毒样颗粒或猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗优选为用于制备预防和/或治疗猪圆环病毒II型病毒引发的疾病的药物和/或疫苗。

所述应用优选为包括、但不限于用作口服疫苗、作为饲料添加剂、饮用水添加剂中的任意一种或几种。

其中，所述猪圆环病毒II型病毒引发的疾病包括、但不限于断奶仔猪多系统衰竭综合症、猪皮炎肾病综合症、仔猪先天性震颤和母猪繁殖障碍中的任意一种或几种。

在本发明的一种优选实施例中，所述任意疫苗可以是优选为固体制剂、液体制剂、半固体制剂、气体制剂中的任意一种或几种，并优选为固体制剂。

其中，所述任意疫苗可以是、但不限于干粉、颗粒、片剂、胶囊、膏剂、气雾剂、喷雾剂、溶液、悬液、乳液中的任意一种或几种。

在本发明的一种优选实施例中，所述任意疫苗也可以包括辅料，辅料优选为可以是、但不限于矫味剂、防腐剂、保湿剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、填充剂、粘合剂或抗粘结剂、助悬剂、颜料、释放阻滞剂、稀释剂、增溶剂、溶剂、絮凝剂或反絮凝剂、消泡剂或发泡剂、增稠剂、增塑剂、缓冲剂、pH值调节剂、乳化剂中的任意一种或几种。

在本发明的一种优选实施例中，所述任意疫苗也可以包括佐剂，佐剂优选为可以是、但不限于水包油、油包水、水包油包水佐剂中的任意一种或几种。

本发明上述各个方面以及各个实施例可以由本领域技术人员进行相互组合，各种组合也在本发明内容的范围之内。

本发明提供的猪圆环病毒II型病毒样颗粒或猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗、优选为口服疫苗，能够减少和预防感染PCV2所引起相关性临床症状，具有可口服、免疫效果好、安全性高、培养操作简单，产量高、生产成本低以及可大规模放大生产等优点。

附图说明

图1为Cap基因的PCR扩增DNA电泳图；

图2为Cap蛋白马克斯克鲁维酵母重组载体pUKD-N125/Cap示意图；

图3为猪圆环病毒II Cap蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达；其中，泳道1：Fim-1ura3Δ；泳道2：Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap重组酵母全细胞裂解液；泳道3：Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap重组酵母解液上清；

图4为马克斯克鲁维酵母表达猪圆环病毒II Cap蛋白的免疫印迹Western Blot检测达；其中，泳道1：Fim-1ura3Δ；泳道2：Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap重组酵母；

图5为马克斯克鲁维酵母表达PCV病毒样颗粒电子显微镜观察；

图6为Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap重组酵母中试发酵生长曲线；

图7为Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap重组酵母中试发酵过程中相同菌量下Cap蛋白表达水平；

图8为口服圆环病毒疫苗与注射进口疫苗免疫小鼠后血清中Cap IgG抗体水平比较；

图9为小鼠喂食口服圆环病毒疫苗的粪便中产生的Cap IgA抗体水平。

具体实施方式

实施例1，PCV衣壳蛋白重组表达载体pUKD-N125/Cap的构建

本实施例中，编码猪圆环病毒衣壳蛋白(上下文中也称为“猪圆环病毒衣壳Cap蛋白”、或“Cap蛋白”)的氨基酸序列的基因具有SEQ ID No.3的序列。根据马克斯克鲁维酵母的密码子偏好性，对Cap基因序列进行密码子优化，并将优化后的Cap基因序列进行人工合成。

所编码的Cap蛋白氨基酸序列可以是如SEQ ID No.1所示，或者SEQ ID No.1中226位的苯丙氨酸由亮氨酸替代(如SEQ ID No.2)。

利用PCR扩增的方法，以PCVN125-F(5'-TTTTTTTGTTAGATCCGCGGATGACATATCCAAGGAGGCGTTTC-3')和PCVN125-R(5'-AGCTTGCGGCCTTAACTAGTTCA CTTAGGGTTAAGTGGAGGGTCCTTAAG-3')为引物扩增Cap基因。经1％琼脂糖凝胶电泳后用DNA凝胶试剂盒回收700kb左右的片段(如图1)。

提供pUKD-N125载体(SEQ ID No.6)，该载体由PUKD-N118载体(参照中国发明专利申请201510562564.9实施例中PUKDN118)构建，构建方法如下：

正向引物5'-ACTAGTTAAGGCCGCAAGCTTTGATCTGATCTGC-3'和反向引物5'-TCCCCCGCGGATCTAACAAAAAAAAAATTAAATG-3'对PUKDN118质粒进行PCR扩增，扩增片段中包括了菊粉酶终止子、KmURA3启动子、KmURA3ORF、酵母自主复制序列和菊粉酶启动子；

利用Taq酶多扩增片段进行加A处理，然后将回收产物与PMD18-T载体连接；测序后，SacII和SpeI进行酶切得到pUKD-N125载体。

pUKD-N125载体中，包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子序列、马克斯克鲁维酵母的营养缺陷筛选标记基因URA3(KmURA3ORF)，不含有大肠杆菌序列。

采用Sac II和Spe II两个限制性酶切pUKD-N125载体，1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶试剂盒回收8kb左右的载体片段

Cap基因片段与载体片段的连接采用Gibson Assembly的方法，用NEB公司的Gibson Assembly无痕连接系统(产品编号E2611S/L)，构建重组载体pUKD-N125/Cap，如图2所示，编码Cap蛋白的基因序列(PCV2CAP)插入到载体内。

实施例2，PCV衣壳蛋白Cap蛋白在马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap的构建及Cap表达分析

提供马克斯克鲁维酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株Fim-1ura3Δ，该菌株的制备方法可参考中国专利公布文件CN105112313A实施例1公开的Fim-1(ura3Δ)的菌株的构建方法。

Fim-1ura3Δ接种于含3mL YEPD培养基的玻璃试管中，30℃摇床过夜培养至OD600为12-15。收集菌体，LiAc-TE溶液(100mM LiAc，10mM Tris-HCl,1mM EDTA)洗涤。

在菌体中依次加入carrier DNA，重组载体pUKD-N125/Cap，PEG溶液(40％PEG 4000、100m M LiAc、10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA)和终浓度为10mM DTT，充分混匀后，30℃水浴15min，47℃水浴15min，8000rpm瞬离，弃上清，加100μL无菌水悬浮菌体，涂SD平板(0.67％无氨基酵母氮源YNB、2％葡萄糖、2％琼脂)，30℃培养2-4天直至克隆形成。

重组菌的鉴定通过提取基因组，用Cap基因特异性PCVN125-F和PCVN125-R引物进PCR验证，扩增出700bp左右的条带的为阳性克隆，即为转入pUKD-N125/Cap重组载体的基因工程菌Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap。

实施例3，马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap表达Cap蛋白及病毒样颗粒的组装

PCR验证阳性的克隆接种于装有50ml的YP培养基(1％酵母抽提物(Yeast Extract)，2％葡萄糖)的三角摇瓶中，30℃、220rpm培养96h后离心收集细胞，采用高压均质的方法破碎细胞，细胞裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳SDS-PAG(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和PCV抗体免疫印迹Western Blot检测猪圆环病毒(PCV)Cap蛋白在克鲁维酵母的表达。

与对照菌Fim-1ura3Δ(第1泳道)对比，基因工程菌Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap的全细胞裂解液及上清(第2和第3泳道)中35-40kD大小多了一条蛋白条带(如图3)，该蛋白条带是猪圆环病毒的Cap蛋白，并且获得了可溶性表达。

进一步利用Western Blot验证Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap表达的Cap蛋白。实验步骤如下：将细胞裂解液样品经蛋白质电泳SDS-PAGE后，使用Bio-Rad公司的Trans-Blot将蛋白转移至硝酸纤维素膜上(220mA，100min)，然后将膜在含5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0、137mM NaCl、0.1％Tween 20)中的室温孵育2h，抗PCV抗体猪血清多抗1︰400稀释，4度过夜孵育后，TBST洗3遍，羊抗猪HRP酶标二抗1︰2500倍稀释，室温孵育1.5h，TBST洗3遍后，加入猪圆环病毒抗体A、B等量混合的显色液，观察结果。

结果：Fim-1ura3Δ(第1泳道)没有免疫印迹条带，而Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap样品(第2泳道)中25-35kD的条带免疫印迹，与Cap蛋白的理论分子量28kD基本一致，证实蛋白条带为圆环病毒的Cap蛋白(图4)。

利用电子显微镜成像技术，观察Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap表达圆环病毒的Cap蛋白是否完成自我组装成病毒样颗粒VLPs，发现摇瓶培养92h后Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap存在大小约17-20nm左右的病毒颗粒(如图5)。

实施例4，马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap发酵与口服疫苗的制备

马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1ura3Δ-pUKD-N125/Cap在5升的发酵罐中进行高密度发酵，利用合成培养基(含葡萄糖、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾等成分)，通过流加补料发酵，发酵48h后菌体密度OD600达271(如图6)，生物量达102g/L(细胞干重)，通过电泳检测与灰度扫描，PCV2Cap蛋白的产量达2g/L(如图7)。

发酵48小时后收集菌体，用去离子水洗涤3次，用磷酸缓冲液PBS重悬后，采用高压均质的方法破碎细胞，加入保护剂蔗糖或直接喷雾干燥制的口服猪圆环病毒II型口服病毒样颗粒疫苗。

实施例5，口服马克斯克鲁维酵母制备的圆环病毒疫苗免疫小鼠

选用6周龄健康雌性SPF级Balb/c小鼠，随机分组，每组各7只。第一组为空白组，喂食PBS(PBS)不做免疫；第二组为对照组，注射进口某公司圆环病毒II型疫苗(0.3mL/只)，第三组为免疫组：喂食本发明提供的猪圆环病毒II型口服病毒样颗口服疫苗(KM口服)，每只小鼠喂食剂量100μg Cap蛋白/次，首免1周后，按相同途径和剂量重复喂食4次(喂食时间：0天、7天、14天、21天、28天)。

喂食前小鼠眼眶后静脉丛取血，采取的血液放到37度培养箱中1h，然后4℃、3000rpm离心4min，用10μl的移液器吸取血清到新的EP内，放-20℃冰箱保存。采集的粪便称重，加入十倍的TBST(含有0.01％的叠氮化钠)，涡旋振荡混匀后，14000rpm离心10min，取上清于新的EP管内，做好标记，放-20℃冰箱。

小鼠血清中抗PCV cap IgG抗体的含量的检测采用武汉科前生物制品有限公司猪圆环病毒II型ELISA抗体检测试剂盒，检测步骤如下：

1)取抗原包被板，每孔加入TBST 200ul，静止3min后倒掉，在吸水纸上拍干，洗涤两次。

2)加入1︰100稀释的待检血清，37度培养箱内静止45min。

3)弃去孔中的样品，用吸水纸拍干后加入200ul TBST，静止3min后倒掉，拍干，共计洗涤5次。

4)每孔加入1︰33000稀释的羊抗鼠IgG酶标二抗，37度静置30min。

5)弃去板中的液体，清洗，方法同3)

6)加入100ul等量混合的底物液A和B，室温下避光显色10min。

7)每孔中加入硫酸反应终止液50ul，用酶标仪检测450nm下的吸光值。

小鼠喂食本发明制备的口服圆环病毒II型疫苗2周血清中产生抗体，小鼠血清产生抗PCV Cap IgG抗体(如图8)。免疫6周后，小鼠血清中的PCV Cap IgG抗体达到峰值，平均滴度达到10000以上，与进口注射疫苗(纯化PCV Cap蛋白)抗体水平相当，但本发明更早产生抗体。此外，口服本发明提供的圆环病毒疫II型疫苗产生的抗体能持续20周以上，并且抗体滴度保持在10000以上，说明本发明制备的口服圆环病毒具有很好的免疫效果。

粪便中抗PCV Cap IgA抗体含量的检测采用酶标二抗使用羊抗鼠IgAα链-HRP(英国abcam公司，货号ab97235)，操作方法同血清中抗PCV Cap IgG抗体的检测。参照图9，小鼠喂口服本发明圆环病毒疫苗(KM口服)28和35天后，粪便中的IgA抗体显著高于空白对照组(PBS)，说明本发明制备的圆环病毒口服疫苗能显著提高小鼠的粘膜免疫效果，产生PCV Cap IgA抗体。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。