主动免疫治疗慢性哮喘的呈递il-33的vlp疫苗构建方法
【专利摘要】本发明提供一种主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，包括以下步骤：从小鼠提取IL-33总RNA，通过逆转录得到IL33总cDNA，用设计的特异性引物将得到的总cDNA通过PCR扩增，得到编码IL-33成熟片段基因，将该基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg33，将该质粒转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上，用IPTG诱导、纯化，得到呈递IL-33的病毒样颗粒疫苗。只需几次免疫注射该疫苗即可诱导强的针对自身分子的、有持续作用的中和性抗体，以调控免疫应答，达到调控哮喘疾病进程的目的。
【专利说明】主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种抗细胞因子病毒样颗粒疫苗——IL-33病毒样颗粒疫苗的制备方法，及其在哮喘中的治疗用途，属于医学生物【技术领域】。
【背景技术】
[0003]白细胞介素-33 (简称IL-33)是一个于2005年利用生物信息学技术发现的新细胞因子，属于IL-1家族成员。丰富地表达于人平滑肌细胞和支气管上皮细胞以及树突状细胞。主要功能是促进Th2型免疫应答，其作用在于IL-33具有很强的刺激Th2的分化与激活的功 能。通过刺激Th2细胞因子的表达，IL-33可促进B细胞合成IgE，促进肥大细胞募集，成熟和存活，刺激嗜酸性粒细胞与嗜碱性粒细胞的存活和效应功能等。
[0004]哮喘是一个严重的气道炎性疾病，其病理机制没有完全弄清楚。许多证据证明IL-33在过敏性气道炎症中有重要作用。全基因组关联研究显示IL-33的基因多态性与哮喘易感性有关。
[0005]在严重哮喘中IL-33水平增加。在动物模型中使用IL-33诱导出气道高反应性和肺部杯状细胞增生，加剧了嗜酸性粒细胞介导的气道炎症，增加了选择性活化的巨噬细胞的极化从而促进了气道炎症。过敏原诱导的Th2细胞和相应的细胞因子以及相关的适应性免疫是促进过敏性哮喘发生的主要原因。IL-33通过激发Th2样的免疫反应来体现它的病理效应。一些能对IL-33的刺激起反应的细胞也参与到哮喘的发病机理中。在激素抵抗型儿童哮喘患者中，IL-33促进了气道重塑。因此，IL-33是治疗哮喘的有效靶点。
[0006]虽然有药物治疗手段，但目前对哮喘的治疗主要是对炎症的抑制及支气管扩张，如吸入糖皮质激素和β 2受体激动剂，口服白三烯受体拮抗剂等。这类药物能减少哮喘发作次数、减轻发作时的体征，患者需长期甚至终生按时用药。然而，上述药物并未对哮喘真正治愈，如果停止治疗，病人将出现病情反复甚至恶化。气道重塑及持续性肺功能损失一旦建立，目前的炎症控制等医疗手段无法对其逆转。
[0007]在治疗一些过敏和自身免疫病中，抗细胞因子疫苗是一种新的和有希望的方法。疫苗策略可能战胜单克隆抗体的一些功能，例如几次免疫注射后就能提供持久的干预效果，对治疗慢性病是很方便的。乙肝病毒核心抗原(简称HBcAg或载体)在大肠杆菌里能够有效的组装成病毒样颗粒，具有极强的免疫原性并且已经广泛的应用于插入目的抗原的疫苗载体。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术手段不能有效治疗哮喘的问题，构建一种有效的包含了 IL-33成熟蛋白全分子的病毒样颗粒疫苗，只需几次免疫注射该疫苗即可诱导强的针对自身分子的、有持续作用的中和性抗体，以调控免疫应答，从而达到调控哮喘疾病进程的目的。
[0009]本发明所述的IL-33成熟蛋白病毒样颗粒疫苗(简称HBcAg33或疫苗)，以IL-33成熟蛋白作为组成之一，选择具有强免疫原性的乙肝病毒核心抗原作为载体(简称载体)，通过基因工程的方法，将编码IL-33的成熟片段与乙肝病毒核心抗原连接并在大肠杆菌中高效表达。
[0010]本发明通过下列技术方案实现:一种主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于包括以下步骤:
1)、从小鼠提取IL-33总RNA，通过逆转录得到IL33总cDNA，用设计的特异性引物将得到的总cDNA通过PCR扩增，得到编码IL-33成熟片段基因，所述特异性引物设计如下:
编码IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac 编码IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac
2)、将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA载体，再将步骤I)得到的编码IL-33成熟片段基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg33 ；
3)、将步骤2)得到的重组质粒PHBcAg33转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上；
4)、用IPTG诱导步骤3)的转化有重组质粒PHBcAg33的大肠杆菌DH5α或BL21，高效表达IL-33目的蛋白，并用饱和度为40%和30%的硫酸铵、体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，对IL-33目的蛋白进行密度梯度离心纯化，最后用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化IL-33目的蛋白，得到呈递IL-33的病毒样颗粒疫苗。
[0011]所述步骤2)的编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg (1-149个氨基酸)的基因库收录号为:GQ377581。
[0012]所述步骤3)中的编码IL-33成熟片段基因的基因库收录号为:ΑΥ905582。
[0013]所述步骤2)的重组质粒构建如下:
编码截断的HBcAg基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中5’端和3’端分别有BamH I和EcoR I的酶切位点，并用内切酶Nde I和Pst I酶切后克隆到pThioHisA中，得到质粒PHBcAg ;然后再用BamH I和EcoR I将编码IL-33成熟片段基因的DNA插入到pHBcAg中，得到带有目的蛋白的重组质粒pHBcAg33，经过测序，重组质粒的目的基因与基因库中的序列一致。
[0014]所述步骤4)中的目的蛋白的诱导和纯化经过下列步骤:
1)将25°C下IPTG诱导4小时的I升菌液离心后，收集菌体；
2)用0.02摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液20毫升，将步骤I)收集的菌体重新悬起来，用超声波破碎菌体后离心分离，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸铵，室温下放置30分钟后离心，收集沉淀，所述硫酸铵在25°C条件下达到的饱和度为40% ;再用20毫升饱和度为30%的硫酸铵溶液洗涤收集的沉淀，共洗涤三次；最后用0.02摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液溶解洗涤后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通过体积比为27%、33%和39%的碘克沙醇进行密度梯度离心，具体操作为；从5毫升离心管的底部到顶部依 次加入1.4毫升体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每个体积比的碘克沙醇之间形成明显界限，室温放置过夜；次日每个体积比的碘克沙醇之间的界限消失，向离心管中加入700微升磷酸缓冲液溶解样品，在16°C，50000转/分钟条件下，离心4小时；之后每200微升取一次样品，经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，将目的蛋白较多的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到呈递IL-33病毒样颗粒疫苗。
[0015]所述步骤4)得到的呈递IL-33病毒样颗粒疫苗用于主动免疫治疗哮喘。
[0016]所述编码截断的乙肝病毒核心抗原基因的核苷酸序列如下: catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgactt
ctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacggattcggtggcggtggcggaccagcatccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttt aa 。
[0017]所述编码IL-33成熟片段基因的核苷酸序列如下: agcatccaaggaacttcacttttaacacagtctcctgcctccctgagtacatacaatgaccaatctgttagt
tttgttttggagaatggatgttatgtgatcaatgttgacgactctggaaaagaccaagagcaagaccaggtgctactacgctactatgagtctccctgtcctgcaagtcaatcaggcgacggtgtggatgggaagaaggtgatggtgaacatgagtcccatcaaagacacagacatctggctgcatgccaacgacaaggactactccgtggagcttcaaaggg gtgacgtctcgcctccggaacaggccttcttcgtccttcacaaaaagtcctcggactttgtttcatttgaatgcaagaatcttcctggcacttacataggagtaaaagataaccagctggctctagtggaggagaaagatgagagctgcaacaatattatgtttaagctctcgaaaatc。
[0018]所述截断的乙肝病毒核心抗原与编码IL-33成熟片段连接后的基因核苷酸序列如下:
catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatc gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagct
attctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacggaagcatccaaggaacttcacttttaacacagtctcctgcctccctgagtacatacaatgaccaatctgttagttttgttttggagaatggatgttatgtgatcaatgttgacgactctggaaaagaccaagagcaagaccaggtgctactacgctactatgagtctccctgtcctgcaagtcaatcaggcgacggtgtggatgggaagaaggtgatggtgaacatgagtcccatcaaagacacagacatctggctgcatgccaacgacaaggactactccgtggagcttcaaaggggtgacgtctcgcctccggaacaggccttcttcgtccttcacaaaaagtcctcggactttgtttcatttgaatgcaagaatcttcctggcacttacataggagtaaaagataaccagctggctctagtggaggagaaagatgagagctgcaacaatattatgtttaagctctcgaaaatcttcggtggcggtggcggaccagcatccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgt ttaa。
[0019]本发明的优点和效果如下:
1)制备简单:利用基因工程技术在原核系统即可实现高水平的重组表达及易获得有效纯化；
2)免疫原性强:一个颗粒由180或240个亚基组成，因此允许插入的表位高拷贝的、高度有序的暴露在颗粒表面，这样的结构可破坏机体识别异与己的能力，有利打破耐受。
[0020]3)安全:乙肝核心抗原作为疫苗载体的安全性已在FDA批准的一项疟疾疫苗的I/II期临床试验中获得考察，无明显的不良反应发现。
[0021]4)只需要有限的免疫次数和较低剂量的疫苗蛋白注射，即可以诱导强的可持续存在并作用的中和抗体。
[0022]5)本发明采用主动免疫的方法，通过基因重组的IL-33病毒样颗粒疫苗，在小鼠中诱导强的、持续存在的中和性的自身抗体。
[0023]6)在哮喘模型中，HBcAg33诱导了从Th2偏向于Thl样的应答。 [0024]7)显著抑制了 BALF中的嗜酸性粒细胞、IL-33水平和杯状细胞的粘液分泌从而抑制了气道炎症。
[0025]8)抑制了气道对乙酰胆碱刺激所产生的气道高反应性。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1:重组质粒pHBcAg33的构建；
图2:编码IL-33成熟片段的诱导表达(左)和免疫印迹检测(右)；
图3:编码IL-33成熟片段蛋白碘克沙醇密度梯度离心；
图4:电镜观察到乙肝病毒核心抗原形成病毒样颗粒；
图5:电镜观察到编码IL-33的成熟蛋白形成病毒样颗粒；
图6:没有使用传统佐剂的疫苗诱导了持续存在和高滴度的IL-33特异抗体；
图7:疫苗滴鼻免疫诱导了系统的IgA反应；
图8:疫苗滴鼻免疫和皮下免疫均能诱导IgG反应；
图9-11:疫苗单独使用以及和不同的佐剂联合使用后的IgGl、IgG2a和IgGl/IgG2a反
应；
图12:支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒细胞数目；
图13:支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-33水平；
图14:肺组织病理切片，苏木精一伊红(H&E)染色和过碘酸雪夫染色；
图15-17:疫苗免疫后，对粘液、血管周围炎症和支气管周围炎症病理评分；
图18-20:乙酰胆碱刺激后小鼠的呼吸道功能检测，包括气道阻力、组织阻力和组织弹性。
【具体实施方式】
[0027]下面通过实施例对本发明做进一步描述。
实施例
[0028]I)用RNAiso Plus从小鼠肺组织进行常规的总RNA提取；并用逆转录试剂盒通过常规的逆转录将得到的总RNA逆转录为总cDNA ;用设计的特异性引物将得到的总cDNA通过PCR扩增，得到编码IL-33成熟片段基因，所述特异性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体如下:
编码IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac编码IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac并在下列PCR体系(20微升)下:5’端引物:0.2微升，3’端引物:0.2微升，IOX PCRbuffer: 2微升，dNTP: 1.6微升，Taq酶:0.2微升，cDNA模板:1微升，双蒸水:14.8微升，进行下列PCR扩增:94 °C预变性2min，94°C变性30S，52°C退火30S，72°C延伸45S，共30个循环，72 °C延伸lmin，得到PCR扩增产物，用常规纯化回收试剂盒纯化所得PCR扩增产物后，用BamH I和EcoR I酶切，酶切后再用试剂盒纯化，得到编码IL-33成熟片段基因；
2)、将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中5’端和3’端分别有BamH I和EcoR I的酶切位点，并用内切酶Nde I和Pst I酶切后克隆到pThioHisA中，得到质粒pHBcAg ;然后再用BamH I和EcoR I将步骤I)得到的编码IL-33成熟片段基因的DNA插入(连接)到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到带有目的蛋白的重组质粒pHBcAg33，经过生工生物工程(上海)股份有限公司测序，该目的基因与基因库中的序列一致，为阳性克隆，其中连接体系(10微升)如下:载体:I微升，IL-33DNA:1微升，T4连接酶:1微升，IOX T4酶buffer:1微升，双蒸水:6微升，室温连接3小时；
3)、将步骤2)所得连接产物——重组质粒pHBcAg33转化到100微升大肠杆菌DH5α感受态细胞上；
4)、用IPTG诱导步骤3)的转化有重组质粒PHBcAg33的大肠杆菌DH5α，高效表达IL-33目的蛋白，并用饱和度为40%和30%的硫酸铵、体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，对IL-33目的蛋白进 行下列密度梯度离心纯化:
4.1)将25°C下IPTG诱导4小时的I升菌液离心后，收集菌体；
4.2)用0.02摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液20毫升，将步骤4.1)收集的菌体重新悬起来，用超声波破碎菌体后离心分离，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸铵，室温下放置30分钟后离心，收集沉淀，所用硫酸铵在25°C条件下达到的饱和度为40% ;再用20毫升饱和度为30%的硫酸铵溶液洗涤收集的沉淀，共洗涤三次；最后用0.02摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液溶解洗涤后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通过体积比为27%、33%和39%的碘克沙醇进行下列密度梯度离心:从5毫升离心管的底部到顶部依次加入1.4毫升体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每个体积比的碘克沙醇之间形成明显界限，室温放置过夜后，每个体积比的碘克沙醇之间的界限消失，在所述离心管中加入700微升磷酸缓冲液进行溶解，在16°C、50000转/分钟条件下，离心4小时；之后每200微升取一次样品，经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，将目的蛋白较多的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到呈递IL-33病毒样颗粒疫苗，_70°C保存备用。
[0029]本发明实施例得到的疫苗经下列动物实验:
一、检测实施例所得疫苗的免疫原性
O免疫原:单独的实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗(2(^g)、实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗+弗氏佐剂、实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗+铝佐剂。
[0030]2 )动物:6-8周Balb/c雌鼠，随机分3组，4只/组。
[0031]3)方法:分别在对应组的小鼠背部皮下三点免疫I)的三种免疫原，每隔一周免疫一次,共三次；每一次免疫后一周大腿静脉采血检测抗体水平(血清稀释度为1:1000)。
[0032]4)检测结果显示:与两个佐剂组相比，单独使用IL-33病毒样颗粒疫苗也能诱导强的针对自身分子的中和性抗体。第二次激发后(第五周)，IL-33特异的抗体滴度达到256000。在免疫的小鼠中，IL-33特异的抗体持续存在至少三个月。其中有弗氏佐剂组的抗体水平更高、更强，持续的时间最长。
[0033]二、实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗单独使用以及和两种佐剂联合使用的免疫应答特点
O免疫原:单独的实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗(分为背部皮下免疫和滴鼻免疫两组，2(^g)、实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗+弗氏佐剂、实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗+招佐剂。
[0034]2 )动物:6-8周Balb/c雌鼠，随机分4组，4只/组。
[0035]3)方法:第一组小鼠背部皮下三点免疫IL-33病毒样颗粒疫苗；第二组小鼠滴鼻免疫IL-33病毒样颗粒疫苗；第三组小鼠背部皮下三点免疫IL-33病毒样颗粒疫苗+弗氏佐剂；第四组小鼠背部皮下三点免疫IL-33病毒样颗粒疫苗+铝佐剂。每隔一周免疫一次，共三次；每一次免疫后一周大腿静脉采血检测抗体水平(血清稀释度为1:1000)。
[0036]4)结果显示:检测滴鼻免疫和使用不同佐剂的皮下免疫的IgGJP IgG2a反应,其中使用了不同佐剂的皮下免疫组中，诱导的IgG1A平相似；而滴鼻免疫显著降低了 IgG1水平；在4个组中，诱导了不同的IgG2a水平。这些结果显示，滴鼻免疫和弗氏佐剂免疫组产生了最强的IgG2a反应，而铝佐剂和IgG2a水平最低。滴鼻免疫组和铝佐剂组有显著差异。滴鼻免疫组的IgG1AgG2a比例显著低于皮下免疫。
[0037]三、实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗用于过敏性气道炎症的动物模型
O免疫原:实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗20 μ g、20 μ g载体、磷酸盐缓冲液(简称PBS, 0.02摩尔/升，0.15摩尔/升氯化钠，pH 7.4)对照。
[0038]2)动物:6-8周Balb/c雌鼠，随机分3组，8只/组。
[0039] 3)方法:分别在对应组的小鼠背部皮下三点免疫I)的三种免疫原，每隔一周免疫一次,共三次；每一次免疫后一周,大腿静脉采血检测抗体水平(血清稀释度为1:1000)。第三次免疫后一周，每一只鼠用500微升的鸡卵清白蛋白溶液腹腔注射致敏，其中鸡卵清白蛋白溶液是用10微克鸡卵清白蛋白与2毫克铝佐剂溶解在500微升磷酸盐缓冲液中得到的溶液，腹腔注射致敏后2周，每一只鼠用50微克的鸡卵清白蛋白溶液滴鼻致敏，每天一次，连续三天，该滴鼻用的鸡卵清白蛋白溶液是用50微克的鸡卵清白蛋白溶解在40微升的磷酸盐缓冲液中得到的溶液；第三天滴鼻致敏后24小时杀小鼠，并从心脏采血，分离血清用于抗体水平检测；再用I毫升冰冷的0.15摩尔/升氯化钠，pH 7.4的磷酸盐缓冲液灌洗肺，得到支气管肺泡灌洗液(简称BALF)用于检测IL-33水平；再将肺组织保存在福尔马林中，用于组织病理分析。
[0040]4)结果显示:实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗显著抑制了气道炎症和粘液分泌。在OVA哮喘小鼠动物模型中，与载体组和PBS模型对照组相比，实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗免疫组的小鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞和IL-33水平明显降低；在肺组织中，H&E染色显示疫苗免疫组的小鼠肺组织炎症和杯状细胞增生明显降低。
[0041]四、实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗用于乙酰胆碱刺激的小鼠检测肺组织和气道功能
O免疫原:实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗、乙肝病毒核心抗原载体、磷酸盐缓冲液(0.02摩尔/升即0.15摩尔/升氯化钠，pH 7.4的磷酸盐缓冲液)。
[0042]2) fIexiVent小动物呼吸机检测气道活性。
[0043]3)动物:6-8周Balb/c雌鼠，随机分3组，3-4只/组。
[0044]4)方法:第一组小鼠背部皮下三点免疫实施例的IL-33病毒样颗粒疫苗；第二组小鼠用乙肝病毒核心抗原载体免疫；第三组小鼠用磷酸盐缓冲液免疫；每隔一周免疫一次，共三次。麻醉小鼠，通过在气管内插入一个套管雾化，三组小鼠分别接受一系列的乙酰胆碱稀释液的刺激。
[0045]5)结果显示:IL_33病毒样颗粒疫苗抑制了对乙酰胆碱刺激产生的气道高反应性。呼吸功能检测包括气道阻力、组织阻力和组织弹性。在载体对照组中所有这些指标都增加；而疫苗免疫组中，所有这些指标都被明显抑制。
[0046]本发明提供的疫苗，经主动免疫，即通过疫苗的方式诱导针对自身蛋白的抗体来调控靶细胞、靶分子功能，只需要有限的免疫次数和较低剂量的疫苗蛋白注射，即可以诱导强的可持续存在并作用的中和抗体；产生的中和抗体是自身蛋白，不存在被动给予的异源拮抗物对机体免疫系统产生的不良作用，也不需要单克隆抗体同源化处理。实现主动免疫策略的关键是打破免疫耐受，诱导中和性自身抗体。外源性T细胞表位的引入是重要的环节。常规手段是把自身蛋白与异源性蛋白或表位化学偶联或基因重组，这样的疫苗能诱导自身抗体，但免疫原性常较弱，需使用强的免疫佐剂。
[0047]本发明所述的IL-33病毒样颗粒疫苗是疫苗研究的一个热点，尤其对于自身抗体的诱导，病毒样颗粒具有独特的优势。其特点为:1)制备简单:利用基因工程技术在原核系统即可实现高水平的重组表达及易获得有效纯化；2)免疫原性强:一个颗粒由180或240个亚基组成，因此允许插入的表位高拷贝的、高度有序的暴露在颗粒表面，这样的结构可破坏机体识别异与己的能力，有利打破耐受。此外，乙肝核心抗原的特异序列可直接激活B细胞的抗原呈递功能，其能力是常规抗原呈递细胞的IO5倍。这样的病毒样颗粒疫苗可诱导高强度的、持续的自身抗体应答，而不需要常规的免疫佐剂；3)安全:乙肝核心抗原作为疫苗载体的安全性已在FDA批准的一项疟疾疫苗的I/II期临床试验中获得考察，无明显的不良反应发现；此外，利用乙肝核心抗原的大量动物实验也未发现小鼠出现明显不良病征。
[0048]本发明采用主动免疫的方法，通过基因重组的病毒样颗粒疫苗，在小鼠中诱导中和性的自身抗体，以抑制哮喘疾病机理中重要的细胞因子如IL-13，TNFa和IL-33的功能，探讨对过敏原反复刺激所引起的慢性哮喘特征的发展所产生的影响。通过对关键疾病指标的发展及相关的调控和效应细胞与分子的研究，本发明对揭示慢性哮喘疾病机理以及IL-13, TNFa和IL-33在其中的作用具有重要意义，同时为哮喘的临床治疗提供新的思路。
[0049]序列表
编码IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac编码IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac编码截断的乙肝病毒核心抗原基因的核苷酸序列:catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacggattcggtggcggtggcggaccagcatccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttt aa
编码 IL-33 成熟片段基因的核苷酸序列:agcatccaaggaacttcacttttaacacagtctcctgcctccctgagtacatacaatgaccaatctgttagttttgttttggagaatggatgttatgtgatcaatgttgacgactctggaaaagaccaagagcaagaccaggtgctactacgctactatgagtctccctgtcctgcaagtcaatcaggcgacggtgtggatgggaagaaggtgatggtgaacatgagtcccatcaaagacacagacatctggctgcatgccaacgacaaggac tact ccgt ggagcttcaaaggg gtgacgtctcgcctccggaacaggccttcttcgtccttcacaaaaagtcctcggactttgtttcatttgaatgcaagaatcttcctggcacttacataggagtaaaagataaccagctggctctagtggaggagaaagatgagagctgcaacaatattatgtttaagctctcgaaaatc
编码截断的乙肝病毒核心抗原与编码IL-33成熟片段基因连接后的基因的核苷酸序
列:
catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatc gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagct
attctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacggaagcatccaaggaacttcacttttaacacagtctcctgcctccctgagtacatacaatgaccaatctgttagttttgttttggagaatggatgttatgtgatcaatgttgacgactctggaaaagaccaagagcaagaccaggtgctactacgctactatgagtctccctgtcctgcaagtcaatcaggcgacggtgtggatgggaagaaggtgatggtgaac atgagtcccatcaaagacacagacatctggctgcatgccaacgacaaggactactccgtggagcttcaaaggggtgacgtctcgcctccggaacaggccttcttcgtccttcacaaaaagtcctcggactttgtttcatttgaatgcaagaatcttcctggcacttacataggagtaaaagataaccagctggctctagtggaggagaaagatgagagctgcaacaatattatgtttaagctctcgaaaatcttcggtggcggtggcggaccagcatccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgt ttaa。
【权利要求】
1.一种主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于包括以下步骤: 1)、从小鼠提取IL-33总RNA，通过逆转录得到IL-33总cDNA，用设计的特异性引物将得到的总cDNA通过PCR扩增，得到编码IL-33成熟片段基因，所述特异性引物设计如下: 编码IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac 编码IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac 2)、将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA载体，再将步骤I)得到的编码IL-33成熟片段基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg33 ； 3)、将步骤2)得到的重组质粒PHBcAg33转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上； 4)、用IPTG诱导步骤3)的转化有重组质粒PHBcAg33的大肠杆菌DH5α或BL21，高效表达IL-33目的蛋白，并用饱和度为40%和30%的硫酸铵、体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，对IL-33目的蛋白进行密度梯度离心纯化，最后用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化IL-33目的蛋白，得到呈递IL-33的病毒样颗粒疫苗。
2.如权利要求1所述的主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于所述步骤2)的 重组质粒构建如下: 编码截断的HBcAg基因由专业公司合成，其中5’端和3’端分别有BamH I和EcoR I的酶切位点，并用内切酶Nde I和Pst I酶切后克隆到pThioHisA中，得到质粒pHBcAg ;然后再用BamH I和EcoR I将编码IL-33成熟片段基因的DNA插入到pHBcAg中，得到带有目的蛋白的重组质粒pHBcAg33。
3.如权利要求1所述的主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于所述步骤4)中的目的蛋白的诱导和纯化经过下列步骤: 1)将25°C下IPTG诱导4小时的I升菌液离心后，收集菌体； 2)用0.02摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液20毫升，将步骤I)收集的菌体重新悬起来，用超声波破碎菌体后离心分离，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸铵，室温下放置30分钟后离心，收集沉淀，所述硫酸铵在25°C条件下达到的饱和度为40% ;再用20毫升饱和度为30%的硫酸铵溶液洗涤收集的沉淀，共洗涤三次；最后用0.02摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液溶解洗涤后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通过体积比为27%、33%和39%的碘克沙醇进行密度梯度离心，具体操作为；从5毫升离心管的底部到顶部依次加入1.4毫升体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每个体积比的碘克沙醇之间形成明显界限，室温放置过夜；次日每个体积比的碘克沙醇之间的界限消失，向离心管中加入700微升磷酸缓冲液溶解样品，在16°C，50000转/分钟条件下，离心4小时；之后每200微升取一次样品，经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，将目的蛋白较多的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到呈递IL-33病毒样颗粒疫苗。
4.如权利要求1所述的主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于所述步骤4)得到的呈递IL-33病毒样颗粒疫苗用于主动免疫治疗哮喘。
【文档编号】A61K39/385GK104001168SQ201410248884
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】马雁冰, 龙琼, 黄惟巍, 姚宇峰, 杨旭, 孙文佳, 金晓媚, 李杨, 褚晓杰, 刘存宝 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所