猪脑心肌炎油乳灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪脑心肌炎油乳灭活疫苗，包括水相和油相，水相与油相的质量比为1:1～3；水相由灭活的猪脑心肌炎病毒培养物和吐温-80组成；油相由10号白油、司本-80和硬脂酸铝组成。本发明所制备的疫苗具有良好的免疫原性。
【专利说明】猪脑心肌炎油乳灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]猪脑心肌炎(Porcine encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)引起的一种以脑炎、心肌炎和母猪繁殖障碍为主要特征的人兽共患传染病。主要临床症状为脑炎、心肌炎、心肌周围炎及繁殖障碍等。自从1958年从患心肌炎的病猪中分离到EMCV以来，随后世界上一些养猪国家都有该病的发生、流行以及EMCV感染的报道，给养猪业造成了一定的经济损失，可引起仔猪致死性心肌炎，造成急性死亡，死亡率最高可达100% ;导致怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎。我国从病原学和血清学方面已经证实不少规模化猪场存在EMCV的感染，对养猪生产潜在的危害值得关注。猪脑心肌炎疫苗可以有效预防上述症状，减少养殖户的损失。
[0003]文献《猪脑心肌炎病毒的分离鉴定及RT-LAMP快速检测方法的建立》公开了猪脑心肌炎病毒的分离，但是所用毒株未经蚀斑纯化，未经纯化会有准种。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种猪脑心肌炎油乳灭活疫苗及其制备方法，本发明毒株制备的疫苗具有良好的免疫原性。
[0005]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是:一种猪脑心肌炎油乳灭活疫苗，所述疫苗包括水相和油相，水相与油相的质量比为1:1~3 ;水相由灭活的猪脑心肌炎病毒培养物和吐温-80组成；油相由10号白油、司本-80和硬脂酸铝组成。
[0006]优选的水相与油相的质量比为1:2。
[0007]猪脑心肌炎油乳灭活疫苗的制备方法，制备步骤如下:将分离的猪脑心肌炎病毒在BHK-21细胞上增殖，收获细胞培养物经甲醛灭活；该疫苗包括水相和油相，水相与油相的质量比为1:1~3 ;
水相的质量组成为:灭活的猪脑心肌炎病毒培养物95份，吐温-80 5份；将上述两种物质充分混匀均匀而成；
油相包括10号白油、司本-80和硬脂酸招，10号白油与司本-80的质量比为94:6，硬脂酸铝的质量为油相总质量的2%，将上述三种物质混合均与搅拌至透明，于115°C高压灭囷制成。
[0008]猪脑心肌炎病毒(porcine encephalomyocarditis virus)的分离方法，包括以下步骤:
(1)病毒的分离和培养:从发病猪场采集病料，病料经匀浆、冻融、离心、过滤后接种BHK-21细胞,盲传5代后进行病毒分离；
(2)病毒的鉴定:将盲传5代的细胞培养物提取RNA，用针对EMCV3D基因的特异性PCR引物Pl和P2对目的基因进行扩增，扩增产物克隆入pEASY-Blunt载体进行测序；Pl具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，P2具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
(3)病毒的纯化:鉴定好的EMCV进行蚀斑纯化，获得了纯化的EMCV。
[0009]脑心肌炎病毒(MECV)属于微RNA病毒熟iPicornaviridae~)，心病毒属(.Card1virus)的成员，与其同属的成员还有门哥病毒(Mengovirus),泰勒鼠源脑心肌炎病毒(Theiler，s murine encephalomyelitis, TMEV)0 病毒粒子直径约 25 ~30nm,呈 20面立方体对称，无囊膜，单股正链RNA病毒，基因组全长约7.8kb，含有一个大的开放阅读框(0RF)，编码分子量约为2.6X103kDa的多聚蛋白(polyprotein)。
[0010]PEASY-Blunt载体为市购商业载体。
[0011]10号白油为市购产品。
[0012]如无特殊说明本发明所用原料均为市售产品。
[0013]采用上述技术方案所产生的有益效果在于:本发明方法分离毒株在BHK-21细胞上生长良好，采用本发明毒株制备的疫苗具有良好的免疫原性。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为病毒生长曲线。
【具体实施方式】
[0015]一种猪脑心肌炎油乳灭活疫苗，所述疫苗包括水相和油相，水相与油相的质量比为1:2 ;水相由灭活的猪脑心肌炎病毒培养物和吐温-80组成；油相由10号白油、司本-80和硬脂酸铝组成。
[0016]猪脑心肌炎油乳灭活疫苗的制备方法，制备步骤如下:将分离的猪脑心肌炎病毒在BHK-21细胞上增殖，收获细胞培养物经甲醛灭活；该疫苗包括水相和油相，水相与油相的质量比为1:2 ;
水相的质量组成为:灭活的猪脑心肌炎病毒培养物95份，吐温-80 5份；将上述两种物质充分混匀均匀而成；
油相包括10号白油、司本-80和硬脂酸铝，10号白油与司本-80的质量比为94:6，硬脂酸铝的质量为油相总质量的2%，将上述三种物质混合均与搅拌至透明，于115°C高压灭囷制成。
[0017]猪脑心肌炎病毒(porcine encephalomyocarditis virus)的分离方法，包括以下步骤:
(1)病毒的分离和培养:从发病猪场采集病料，病料经匀浆、冻融、离心、过滤后接种BHK-21细胞,盲传5代后进行病毒分离；
(2)病毒的鉴定:将盲传5代的细胞培养物提取RNA，用针对EMCV3D基因的特异性PCR引物Pl和P2对目的基因进行扩增，扩增产物克隆入pEASY-Blunt载体进行测序；
Pl具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，P2具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
(3)病毒的纯化:鉴定好的EMCV进行蚀斑纯化，获得了纯化的EMCV。
[0018]具体步骤如下:
将猪脑心肌炎病毒株命名为BD2。
[0019]1.1生产用毒种猪脑心肌炎病毒分离株BD2由河北省兽医生物技术工程技术研究中心分离并保存。
[0020]1.2病毒增殖
配制细胞生长液和维持液。选择形态正常、生长旺盛的BHK-21细胞，将细胞瓶内的生长液弃去，接种1%EMCV，37°C吸附30min。然后加入维持液，置37°C继续培养。每天观察细胞病变(CPE)。当CPE达80%时收获病毒。反复冻融3次后收取病毒悬液。抽样，用96孔细胞培养板测定TCID5tlt5具体方法如下:将BHK-21细胞消化后，以约16个/mL的密度转入96孔细胞培养板，每孔100 UL0 37°C、5%C02、饱和湿度下培养过夜，形成80%左右的细胞单层，小心吸弃上清。将病毒以维持培养基进行10倍连续递增稀释，取各稀释度的病毒接种BHK-21细胞单层，每个梯度4孔，每孔100 μ L7CO2培养箱37°C吸附I h。小心吸弃上清，加入100 μ L维持培养基继续培养。16 h后，观察CPE，直至感染后36 h，记录各个梯度CPE的孔数。根据Reed-MUench法计算TCID5tl。病毒含量应≥107 ° TCID5(l/mL。
[0021]1.3病毒灭活
向病毒液中加入终浓度为0.3%的甲醛溶液，充分混匀后置37°C灭活24h，其间每隔4~6h振荡一次。
[0022]1.4半成品检验
1.4.1无菌检验
对灭活病毒液按照《中国兽药典》附录第15页进行检验，无菌生长；
1.4.2灭活检验
取灭活病毒，接种长成单层的BHK-21细胞，换成维持液，逐日观察细胞形态，连续2d，不出现CPE。盲传一代，亦不出现CPE。
[0023]1.5疫苗配制
先配置油相，将94份10号白油和6份司本-80混合，再按总量加入2%硬脂酸铝搅拌至透明，115°C高压灭菌后,取占疫苗总量的67%的油相加入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，在搅动油相的同时，缓慢加入占疫苗总量33%的水相，加完后再以12000rpm搅拌5~1min0水相由灭活24小时猪脑心肌炎病毒“BD2株”培养液95份，和5份吐温-80，充分混匀而成，水相占疫苗总量的33%。
[0024]1.6成品检验 1.6.1物理性状
剂型检验:将油乳疫苗滴于冷水表面，第一滴分散属于正常现象，以后各滴如果呈规则圆形，不向四周扩散，则证明为油包水剂型；
稳定性检验:取乳化好的疫苗样品，3000 rpm离心15 min,没有分层现象；
粘度检验:用I mL吸管(下口内径1.2mm，上口内径2.7 mm)，吸取室温25°C左右的疫苗I mL,令其垂直自然流下，记录流出0.4 mL所需要的时间，测三次，取平均值，在8秒以内。
[0025]1.6.2无菌检验选用硫乙醇酸盐培养基、酪胨琼脂、葡萄糖蛋白胨汤、血琼脂斜面及马丁琼脂斜面各2支。一支置37°C，一支置25°C，培养5d，观察。无菌生长。
[0026]1.6.3安全检验选用8周龄雄性BALB/c小鼠，五只各皮下注射疫苗0.5mL,观察14d，记录小鼠的存活情况。全部健活。
[0027]1.6.4效力检验
攻毒保护试验:选用8周龄雄性BALB/c小鼠，随机分组，每组单独隔离饲养。实验前选择五只小鼠检测其EMCV血清中和抗体和病毒核酸，均应为阴性。小鼠分成3组，每组10只。A组为疫苗接种组，每只皮下接种疫苗0.lmL，B组为对照组，每只接种不含病毒的疫苗
0.lmL。接种后，每天观察临床症状和死亡情况，一直到感染后14d。疫苗接种组保护8只，存活率至少80%，对照组接种病毒后，全部发病死亡。死亡前部分感染鼠后肢瘫痪，运动障碍；病毒中和试验(VN)采取固定病毒稀释血清法。具体操作如下:用2% FBS DMEM培养基将EMCV稀释为200 TCID50/0.lmL，同时将血清10倍比稀释。取50 μ L 200 TCID50的EMCV和50 μ L各个稀释度的血清混合，充分混匀，37°C孵育I h，将混合液加入铺有80~90%汇合率BHK-21细胞单层的96孔细胞板中，将细胞板置37°C 5%C02培养箱中培养24 h，记录细胞病变情况，按照Reed-Muench方法计算出能保护50%细胞孔不出现CPE的血清稀释度做为该血清中和效价。试验以免疫小鼠血清作为阳性对照，正常小鼠血清作为阴性对照；病毒核酸检测采用 RT-PCR，所用引物(P1: 5' -GGT GAG AGC AAG CCT CGC AAA GAC AG-3' ；P2:5' -CCC TAC CTC AC G GAA TGG GGC AAA G-3')，退火温度 55.0，扩增产物为 286bp。
【权利要求】
1.一种猪脑心肌炎油乳灭活疫苗，其特征在于:所述疫苗包括水相和油相，水相与油相的质量比为1:1~3 ;水相由灭活的猪脑心肌炎病毒培养物和吐温-80组成；油相由10号白油、司本-80和硬脂酸铝组成。
2.根据权利要求1所述的猪脑心肌炎油乳灭活疫苗，其特征在于:水相与油相的质量比为1:2。
3.一种猪脑心肌炎油乳灭活疫苗的制备方法，其特征在于:将分离的猪脑心肌炎病毒在BHK-21细胞上增殖，收获细胞培养物经甲醛灭活；该疫苗包括水相和油相，水相与油相的质量比为1:1~3 ; 水相的质量组成为:灭活的猪脑心肌炎病毒培养物95份，吐温-80 5份；将上述两种物质充分混匀均匀而成； 油相包括10号白油、司本-80和硬脂酸铝，10号白油与司本-80的质量比为94:6，硬脂酸铝的质量为油相总质量的2%，将上述三种物质混合均与搅拌至透明，于115°C高压灭囷制成。
4.根据权利要求3所述的猪脑心肌炎油乳灭活疫苗的制备方法，其特征在于:猪脑心肌炎病毒(porcine encephalomyocarditis virus)的分离方法，包括以下步骤: (1)病毒的分离和培养:从发病猪场采集病料，病料经匀浆、冻融、离心、过滤后接种BHK-21细胞,盲传5代后进行病毒分离； (2)病毒的鉴定:将盲传5代的细胞培养物提取RNA，用针对EMCV3D基因的特异性PCR引物Pl和P2对目的基因进行扩增，扩增产物克隆入pEASY-Blunt载体进行测序； Pl具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，P2具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列； (3)病毒的纯化:鉴定好的EMCV进行蚀斑纯化，获得了纯化的EMCV。
【文档编号】A61P31/14GK104027799SQ201410248845
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】袁万哲, 孙继国, 张玲玲, 张秀媛, 孙明潭, 景翠 申请人:河北农业大学