用于诱导对病毒免疫性的方法

专利名称：用于诱导对病毒免疫性的方法
技术领域：
本发明涉及用于诱导对病毒、且特别是经历过突变的病毒的免疫性的方法。更为特别地，本发明涉及用表达含有改变或缺失优势免疫表位的病毒突变形式包被(env)糖蛋白的构建体增加细胞毒T淋巴细胞(CTL)抗病毒反应的方法。
以env糖蛋白免疫HIV-感染的患者是对已形成的逆转录病毒感染进行主动免疫治疗的实验方法。然而，成功的HIV疫苗治疗临床试验不仅不得不克服初级HIV分离物中的env糖蛋白的显著多样性，而且必需克服对AIDS病理发生为关键性的env-CD4之间相互作用(Siliciano，1996，当前微生物免疫学主题(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)205159-79)。此相互作用不仅提供HIV趋性的分子基础(Hwang等，1991，科学(Science)25371-74)，而且启动HIV-感染患者中造成CD4+细胞耗竭和免疫缺陷形成的数种有害事件。
在HIV-感染的患者中，CD4+T细胞丧失的速度超过经胸腺分化和/或成熟T细胞克隆扩增而产CD4+细胞的速度(Siliciano，1996，当今微生物免疫学主题.205159-79)，提示无论直接还是间接的细胞病理学机制均造成AIDS形成过程中CD4+T细胞的耗竭(Oyaizu等，1993，血液(Blood)823392-3400)。这些机制包括与合胞体形成有关的细胞-细胞融合(Sodroski等，1986，自然(Nature)322470-474)，在抗-gp120抗体存在下CD16+细胞裂解性效应细胞的破坏(Lyerly等，1987，美国自然科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)844601-4605)或由gp120特异性CD4+细胞的破坏(Stanhope等，1993，免疫学(Immunol.)1504672-4686)，随机的VβT细胞缺失(Boyer等.，1993，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)92437-441)和由结合gp120与CD4的交联然后抗原驱动活化所诱导的凋亡(Banda等，1992，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1761099-1106；Corbeil，J.，M.Tremblay，和D.D.Richman，实验医学杂志18339-48)。
在gp120的可变区域中，V3环称为HIV优势中和区(dominantneutralizing domain)，其在不同HIV分离物中表现出高度的可变性(Hwang等，1991，科学25371-74)。V3区也涉及病毒进入过程中en-CD4受体后(postreceptor)结合步骤(Freed等，1991，病毒学杂志(J.Virol.)65190-194)，并且其结构可影响HIV分离物对靶细胞中β-趋化因子受体存在的应答能力(Trkola等，1996，自然384184-181)。后者的相互作用在决定病毒细胞趋性和合胞体形成表型的细胞事件中起重要作用(Lapham等，1996，科学274602-604)。此外，因为在HIV感染患者中的大部分中和抗体(30％-80％)识别线性V3环序列(Vogel等，1994，免疫学杂志.1531895-1904)。这些抗体可能主要造成未感染CD4+T细胞ADCC-介导的细胞裂解。
gp120的V3环是同时诱导体液和细胞介导的抗HIV免疫性的env糖蛋白的优势区，但也已知其经历频繁的突变(Siliciano，1996，当今微生物免疫学主题.205159-79；Hwang等，1991，科学25371-74)。由V3环突变表位在体内诱导的次级反应可能驱动长时间的免疫活化，从而导致由于高的T细胞转换造成的再生能力的加速耗竭(Wolthers等，1996，科学2741543-1547)。此外，在细胞表面表达或HIV感染细胞释放的全长env糖蛋白可触发与env-CD4相互作用有关的有害事件，该相互作用是AIDS病理发生的中心环节(Siliciano，1996，当今微生物免疫学主题.205159-79)。
鉴于前述有关现有技术中免疫患者从而抵抗频繁突变病毒的方法的缺陷，显然在本领域中存在这样的必要，即需要一种重新指导针对这些病毒包膜糖蛋白保守表位免疫反应的方法，这样诱导对多株病毒的细胞免疫，而不诱导与该包膜糖蛋白与其细胞受体间相互作用有关的有害效应。
因此，本发明的一个目的是提供以足以诱导抗病毒细胞免疫的量施用给病人编码此病毒包膜糖蛋白核酸而诱导对病毒的细胞免疫的方法，其中的包膜糖蛋白(a)含有修饰的优势免疫表位；和(b)诱导对该包膜糖蛋白保守表位的细胞免疫。
本发明的另一个目的是提供一种新的诱导抗病毒细胞免疫的方法，包括(a)将编码此病毒包膜糖蛋白的核酸导入抗原呈递细胞(APC)，其中的包膜糖蛋白含有修饰的优势免疫表位，和(b)给有需要的患者施用足以诱导对该病毒保守表位的细胞免疫量的APC。
本发明的另一目的是提供用于制备抗病毒疫苗的方法，包括
(a)将编码此病毒的包膜糖蛋白的核酸导入载体DNA或脂质体，其中的包膜糖蛋白含有修饰的优势免疫表位；和(b)将该载体DNA或脂质体与适当的佐剂混合。
本发明的另一个目的是提供用于制备抗病毒疫苗的方法，包括(a)将编码此病毒的包膜糖蛋白的核酸导入抗原呈递细胞(APC)，其中的包膜糖蛋白含有修饰的优势免疫表位；和(b)将此APC与适当的佐剂混合。
本发明的另一个目的是提供用于诱导抗病毒细胞免疫性的疫苗，包括(a)在其表面表达该病毒的包膜糖蛋白的细胞，其中的包膜糖蛋白含有修饰的优势免疫表位和(b)佐剂。
对于前面和其它的目的，本发明的优势和特征在下文中将变得显而易见，通过参照本发明下面优选实施方案的详细描述和附属的权利要求，可更为清楚地理解本发明的特性。
附图简述当通过参照下面详细描述且结合附图可更好地理解本发明，从而可容易地获得对本发明和其许多附带的优势的更为彻地的理解，其中

图1是显示HIV env基因的WT和DV3突变体的表达。将以痘苗病毒感染并表达WT与ΔV3突变体env糖蛋白的JA2细胞与HIV-感染患者血清进行免疫沉淀并于SDS-PAGE(8％丙烯酰胺)上加以分析。以CR19痘苗病毒感染的细胞用作阴性对照。
图2显示对由vv-WTP-2和vv-7ΔV3-感染的JA2细胞表达的env糖蛋白的免疫荧光染色与免疫沉淀。对于免疫荧光染色，将以重组痘苗病毒感染并表达WTP-2(A)和7ΔV3(B)包膜糖蛋白的细胞与HIV-感染患者血清(HIV+血清)、G3-523或F105mAb孵育，然后用FITC-偶联的第二抗体染色，并且通过流式细胞术分析(右组)。用CR19株痘苗感染并以HIV+血清染色的细胞用作阴性对照。感染细胞的放射性标记细胞裂解物用相同的抗-gp120抗体加以沉淀并通过SDS-PAGE加以分析(左组)。
图3显示由抗-CD3mAb(实心柱)和以vv-WTP-2感染的自体LCLs(空心柱)或以vv-7ΔV3感染的自体LCLs(阴影柱)在HIV-感染患者的PBMC中对env-特异性CTL反应的诱导。通过用vac-感染的细胞作为阴性对照，在抗vv-WTP-2-感染JA2细胞的批量培养物(E∶T比例为20∶1)中51Cr释放分析(左组)，和通过抗以HIV-1IIIB分离物感染JA2细胞的有限稀释分析(右组)测定env-特异性CTL效应物。env-特异性CTLp的频率计为对HIVenv测得的CTLp频率与未感染对照靶子之间的差异，并且标准化为每106个PBMC中CTLp的数目。
图4显示env肽诱导的HIV感染患者417的env肽诱导的PBMC抗JA2细胞的CTL活性(A)和患者HIV分离物与天然病毒变异体中D1、I-10和D2肽的抗原性变化(B)。(A)患者417的PBMC以0.5μM的浓度用env-特异性肽刺激并在第14天在抗以vv-WTP-2(左组)和vv-7ΔV3(右组)感染的靶细胞的51Cr-释放分析中进行测试。以vac感染的细胞用作对照，并且CTL活性计为CTL对env与对照靶子反应之间的差异。(B)通过RT-PCR扩增从PBMC中分离的病毒env RNA而测定患者417中D1、I-10和D2表位自身病毒序列的抗原性变异。将PCR扩增产物克隆入BlueScript并用引物进行测序。从用下面的登记号可从NCIB EntreZ数据库中得到的序列获得HIV分离物的抗原性变异HXB2为K03455；JRFL为U63632；SF2为K02007；并且CM240为U54771。
图5显示在HIV-血清反应阴性个体env-特异性抗体与PBMC存在下ADCC介导的以vv-WTP-2和vv-ΔV3感染的同种异体LCL的裂解。通过仅仅从vv-ΔV3或vv-WTP感染靶细胞的百分细胞毒性中减去与vac-感染靶子之间的背景反应性而计算ADCC特异性裂解。E∶T比例为50∶1。以标准差＜5％一式三份进行所有实验条件三次。结果代表三次独立的实验。
图6显示在以表达全长和ΔV3突变形式env糖蛋白的痘苗病毒感染后的SupT-1细胞(A和B)中和在抗-CD3mAb-活化的IL-2-依赖性T细胞(C)中对env-介导凋亡的检测。以vac、vv-WTP-2和vv-7ΔV3感染SupT-1细胞，并且在感染后的16小时的单个培养物中通过DNA含量频率分布(A)和DNA凝胶电泳(B)分析凋亡。未感染细胞用作阴性对照。为了定量诱导活化的(细胞)凋亡，在以抗-CD3mAb刺激之前2小时将T淋巴细胞与表达env-糖蛋白的固定细胞孵育。72小时后经以PI染色核通过流式细胞术监测凋亡的诱导。
优选实施方案描述通过修饰病毒糖蛋白的优势免疫表位，本发明者现已确定存在对细胞介导免疫反应的诱导和ADCC-介导的env表达细胞的裂解、合胞体形成和凋亡的减少或丧失。下面的定义进一步阐明本发明。
这里所述的氨基酸残基优选为“L”异构形式。然而，只要该多肽维持免疫球蛋白结合所需的功能特性，可用任何的D-氨基酸残基代替“L”异构形式的残基。NH2指存在于多肽氨基末端的自由氨基。COOH指存在于多肽羧基端的自由羧基。与标准的多肽命名法(生化杂志(J.Biol.Chem.)，2433552-59(1969))保持一致，氨基酸残基的简写形式示于下面的对应表中对应表符号氨基酸单字符 三字符YTyr 酪氨酸GGly 甘氨酸FPhe 苯丙氨酸MMet 甲硫氨酸AAla 丙氨酸SSer 丝氨酸IIle 异亮氨酸LLeu 亮氨酸TThr 苏氨酸VVal 缬氨酸PPro 脯氨酸KLys 赖氨酸HHis 组氨酸QGln 谷氨酰胺EGlu 谷氨酸WTrp 色氨酸RArg 精氨酸DAsp 天冬氨酸NAsn 天冬酰胺CCys 半胱氨酸应该注意到所有的氨基酸残基序列在这里用其左右方向为常规的氨基末端到羧基末端方向的形式表示。此外，应该注意到在氨基酸序列的起始端或末端的短线表示与一个或更多个氨基酸残基其它序列间的肽键。列出上表从而将三字符与单字符概念对应起来，它们可能在文中交替出现。
“复制子”为在体内作为DNA复制自主单位，即，能够在其自身控制下复制而起作用的任何遗传单位(如，质粒，染色体、病毒)。
“载体”为另一种DNA片段可附着到其上从而导致该附着片段复制的复制子，如质粒、噬菌体或粘粒。
“DNA分子”指单链或以双链螺旋形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)多聚体形式。该术语仅指此分子的一级与二级结构，并且并不将其限定于任何特定的三级形式。因此，该术语包括特别在线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子结构过程中，在此可根据常规的方式描述序列，仅给出沿DNA非转录链(即，具有与mRNA同源序列的链)5’到3’方向的序列。
“复制起点”指参与DNA合成的那些DNA序列。
DNA“编码序列”是当置于适当调节序列控制下在体内被转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子所决定。编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、甚至为合成的DNA序列。多聚腺苷酸化信号和转录终止序列一般将位于编码序列的3’端。
转录和翻译控制序列为提供编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列，如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子等。
“启动子序列”为能够在细胞中结合RNA聚合酶并且起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。为了定义本发明的目的，启动子序列在其3’末端与转录起始位点相连接并向上游(5’方向)延伸，包括启动高于背景的可检测到水平的转录所必需的最低数目的碱基或元件。在启动子序列内部将发现有转录起始点(由核酸酶S1作图而方便地加以定义)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合区(共有序列)。真核启动子将经常但不总是含有“JAJA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10到-35共有序列外还含有Shine-Dalgarmo序列。
“表达控制序列”为控制和调节另一种DNA序列转录与翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后翻译成由该编码序列所编码的蛋白时，此编码序列在细胞中转录和翻译控制序列的“控制之下”。
“信号序列”可被包括在编码序列前面。此序列编码多肽N-末端的信号肽，其与宿主细胞发生通讯从而指导该多肽至细胞表面或将此多肽分泌至培养基中，并且在蛋白离开细胞之前由宿主细胞切下信号肽。可发现信号序列与多种天然原核和真核蛋白有关。
这里用于指本发明探针的术语“寡核苷酸”定义为由2个或更多个核糖核苷酸，优选多于三个核糖核苷酸所组成的分子。其确切的大小将依赖于许多因素，这些因素反过来又依赖于该寡核苷酸的最终功能。
这里所用的术语“引物”指纯化限制性消化产物中天然产生的或合成制备的寡核苷酸，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时，即在核苷酸与诱导剂如DNA聚合酶存在下且在适当温度与PH时，其能够作为合成起始点而起作用。此引物可以为单链或双链并且必需足够长以在诱导剂存在时引发所需延伸产物的合成。此引物的确切长度将依赖于多种因素，包括温度，引物的来源和使用的方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性此寡核苷酸引物一般含有15-25个或更多个核苷酸，尽管其可以含有更少的核苷酸。
这里的引物被选定为与特定靶DNA序列不同链“基本上”是互补的。这意味着该引物必须足够互补从而与其各自的链杂交。因此，该引物序列不一定反映模板的确切序列。例如，可将非互补的核苷酸片段附着到引物的5’末端，该引物序列的其余部分互补于该链。作为选择，如果该引物序列与此链序列具有足够的互补性从而与其杂交且因此形成用于合成此延伸产物模板时，可将非互补碱基或更长的序列分散于此引物中。
如这里所使用的，术语“限制性内切核酸酶”与“限制性酶”指细菌酶，其中的每种酶在特定的核苷酸序列处或其附近切割双链DNA。
当DNA被导入细胞内时，此细胞已被外源或异源DNA所“转化”。此转化DNA可能整合(共价连接)或不整合入构成该细胞基因组的染色体DNA中。例如，在原核、酵母及哺乳动物细胞中，转化DNA可存在于游离体(episomal)元件如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞为转化DNA整合入染色体中从而其经过染色体复制而由子代细胞遗传。此稳定性通过该真核细胞建立由含有此转化DNA子代细胞种群所组成的细胞系或克隆的能力而被证实。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或常规祖细胞衍生的细胞种群。“细胞系”为能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。
两种DNA序列在规定的DNA序列长度内至少有约75％(优选至少约80％，并更为优选至少约90或95％)核苷酸匹配时，则它们“基本上同源”。可通过用可在序列数据库中得到的标准软件比较序列，或者，例如，用于该特定系统而制定的严格条件下的Southern杂交实验鉴定基本上同源的序列。制定合适的杂交条件在本领域的技术范围内。参见，例如，Maniatis等，出处同上；DNA克隆(DNA Cloning)，第I、II卷，出处同上；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)，出处同上。在此引用供参考。
应该明白同时在本发明范围内的还有编码具有与天然包膜糖蛋白具有相同氨基酸序列的包膜糖蛋白，但为天然或野生型DNA序列简并序列的DNA序列。“简并”意为用不同的三字母密码子代表特定的氨基酸。在本领域中众所周知下面的密码子可互换使用以编码每种特定的氨基酸苯丙氨酸(Phe或F) UUU或UUC亮氨酸(Leu或L)UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG异亮氨酸(Ile或I) AUU或AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M) AUG缬氨酸(Val或V)GUU或GUC或GUA或GUG丝氨酸(Ser或S)UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC脯氨酸(Pro或P)CCU或CCC或CCA或CCG苏氨酸(Thr或T)ACU或ACC或ACA或ACG丙氨酸(Ala或A)GCU或GCG或GCA或GCG酪氨酸(Tyr或r)UAU或UAC组氨酸(His或H)CAU或CAC谷氨酰胺(Gln或Q) CAA或CAG天冬酰胺(Asn或N) AAU或AAC赖氨酸(Lys或K)AAA或AAG天冬氨酸(Asp或D) GAU或GAC谷氨酸(Glu或E)GAA或GAG半胱氨酸(Cys或C) UGU或UGC精氨酸(Arg或R)CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG甘氨酸(Gly或G)GGU或GGC或GGA或GGG色氨酸(Trp或W)UGG终止密码子UAA(赭石)或UAG(琥珀)或UGA(乳白)应该明白上面定义的密码子为RNA序列。DNA相应密码子以T代替U。
可在野生型序列中造成突变从而该特定的密码子变成编码不同氨基酸的密码子。一般通过造成尽可能少的核苷酸改变而制备这样的突变。可以用非保守方式(即，通过将属于具有特定大小或特征氨基酸组的氨基酸密码子变为属于另一组氨基酸的密码子)或保守的方式(即，通过将属于具有特定大小或特征氨基酸组氨基酸密码子变为属于相同组的氨基酸)制备这种替代突变从而改变得到蛋白中的氨基酸。这种保守改变一般导致得到蛋白结构与功能的较少改变。非保守改变更有可能改变所得蛋白的结构、活性或功能。认为本发明应该包括含有没有显著改变所得蛋白活性或结合特征的保守改变的序列。
下面为不同氨基酸分组的一个实例非极性R基团氨基酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸脯氨酸苯丙氨酸色氨酸甲硫氨酸不带电极性R基团氨基酸甘氨酸丝氨酸苏氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰胺谷氨酰胺带电极性R基因氨基酸(带负电，Ph6.0)天冬氨酸谷氨酸碱性氨基酸(带正电Ph6.0)赖氨酸精氨酸组氨酸(pH6.0)另一种分组可以为具有苯基的那些氨基酸苯丙氨酸色氨酸酪氨酸另一种分组可以根据分子量(即，R基因大小)甘氨酸 75丙氨酸 89丝氨酸 105脯氨酸 115缬氨酸 117苏氨酸 119半胱氨酸 121亮氨酸 131异亮氨酸 131天冬酰胺 132天冬氨酸 133谷氨酰胺 146赖氨酸 146谷氨酸 147甲硫氨酸 149组氨酸(pH6.0时) 155苯丙氨酸 165精氨酸 174酪氨酸 181色氨酸 204特别优选的保守替代有-Lys代替Arg和Arg代替Lys从而可保留正电；-Glu代替Asp和Asp代替Glu从而可保留负电；-Ser代替Thr从而可保留自由-OH；以及-Gln代替Asn从而可保留自由NH2。
也可导入氨基酸替代从而替换成具有特定优选特性的氨基酸。例如，可将Cys导入用于与其它Cys形成二硫桥的潜在位点。His可作为特别的“催化”位点而被导入(即，His可作为酸或碱而起作用并且为生化催化中最为常见的氨基酸)。Pro由于其特定的平面结构而被导入从而诱导该蛋白结构中的β-转角。
当至少约70％氨基酸残基(优选至少约80％，且最为优选至少约90或95％)相同或代表保守性替代时则这两种氨基酸序列为“基本上同源的”。
DNA构建体的“异源”区域为位于较大DNA分子内部且在自然界中没有发现与此较大分子有关系的可鉴定的DNA片段。因此，当该异源区域编码哺乳动物基因时，此基因两侧部分一般将不是其来源生物基因组中位于该哺乳动物基因组DNA两侧的DNA。异源编码序列的另一个实例是其中的编码序列本身未在自然界中发现的构建体(如，其中的基因组编码序列含有内含子、具有不同于天然基因密码子的合成序列的cDNA)。等位变异或天然发生的突变事件不产生这里定义的DNA异源区域。
“抗体”为任何形式的免疫球蛋白，包括结合特异性表位的抗体及其片段。该术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体，最后一种提及的抗体进一步详细描述于美国专利Nos.4,816,397和4,816,567中。
“抗体结合位点”为由特异性结合抗原的重轻链可变区与高变区所组成的抗体分子的结构部分。
以各种语法形式在这里使用的词语“抗体分子”既涉及完整的免疫球蛋白分子又涉及免疫球蛋白分子的免疫学活性部分。
抗体分子实例有完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和那些含有互补位的免疫球蛋白分子的部分，包括本领域中称为Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)的那些，这些部分优选用于这里所述的治疗方法中。
通过众所周知的方法分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对基本上完整抗体分子的蛋白酶解反应而制备抗体分子的Fab与F(ab’)2部分。参见，例如Theofiloplous等的美国专利No.4,342,566。Fab’抗体分子部分也是众所周知的并且从F(ab’)2部分中制备，然后用巯基乙醇还原连接2个重链部分的二硫键，且然后用试剂如碘乙酰胺烷基化得到的蛋白硫醇。含有完整抗体分子的抗体在此是优选的。
词语“单克隆抗体”在其不同语法形式中指仅具有一种能够与特定抗原起免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此，单克隆抗体一般对与其起免疫反应的任何抗原显示出单一的结合亲和性。因而，单克隆抗体可以含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，每个位点对不同的抗原是免疫特异性的；如，双特异性(嵌合)单克隆抗体，词语“药物上可接受”指当施用至人类时在生理上可耐受并且一般不产生变态反应或类似不必要的反应如胃性呕吐、头晕等的分子本身和组合物。
词语“治疗有效量”在这里使用意为足以阻止，并且优选减少，其存在或活性相关的体征或病征如升高的血压、发烧或白细胞升高的量。
当表达控制序列控制和调节DNA序列的转录与翻译时，将此DNA序列“可操作地连接到”表达控制序列上。术语“可接地连接”包括在待表达DNA序列前面具有适当的起始信号(如，ATG)并且维持正确的阅读框从而允许该DNA序列在该表达控制序列下表达并且产生由该DNA序列所编码的所需产物。如果一个人们希望将其插入到重组DNA分子中的基因不含有适当的起始信号，可在该基因前面插入起始信号。
术语“标准杂交条件”指盐和温度条件基本上相当于同时用于杂交与清洗的5xSSC和65℃。然而，本领域中的技术人员将会明白这样的“标准的杂交条件”依赖于特定的条件，包括缓冲液中钠与镁的浓度、核苷酸长度与浓度、不匹配的百分数、甲酰胺的百分比等。在决定“标准杂交条件”中同样重要的是杂交的2种序列为RNA-RNA、DNA-DNA还是RNA-DNA。根据众所周知的方式，本领域的技术人员可容易地制定此标准的杂交条件，如果必要，其中的杂交一般低于预期或测定的Tm 10-20℃，清洗条件更严格。
如这里所使用的，“细胞免疫”意为指抗原或含有抗原细胞的T-淋巴细胞的活化与激活。待活化的特别优选的T-细胞为细胞毒T细胞(即，CD8+)，而待保护免受凋亡的特别优选T细胞为辅助T-细胞(即，CD4+)。
“抗原呈递细胞”(APC)意为在其表面表达抗原、或吞噬抗原、加工该抗原且然后将该加工过的抗原的至少一部分插入到其膜中从而将其暴露于细胞外的任何细胞。APC的实例有单核细胞/巨噬细胞系和树枝状细胞的那些。
“优势免疫表位”意指可能为蛋白中氨基酸线性排列、或氨基酸非线性三维排列的蛋白的一部分，其充分暴露从而诱导出针对它的抗体。这样的表位可以为抗体与之结合并阻止细胞感染和/或阻细胞融合的“中和”或“融合表位”。
“有需要的患者”意为处于感染风险或已经暴露于病毒或受其感染的人或动物。
含有包膜糖蛋白的病毒优选为经历抗原性变异如抗原性漂变(如，慢病毒)或抗原性转变(如流感)的病毒。优选的病毒有逆转录病毒，且特别是慢病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)、Caprine关节炎脑炎病毒(CAEV)、类人猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)及绵羊病毒性脑膜炎病毒。
如上所述，优选的优势免疫表位包括包膜糖蛋白的第三个可变环(V3)，中和表位和融合表位。然而，已注意到融合表位可以是高度疏水性的，并且因此没有很好地暴露于糖蛋白上。在有些情况，前体糖蛋白的切割，如HIV的gp160糖蛋白切割成gp120与gp41需要暴露这样的表位。
可以使用改变优势免疫表位的任何方法，包括缺失表位、插入打断该表位二级与三级结构的序列和通过定点诱变对序列的修饰。将会明白通过保守氨基酸替代的改变将最少打断表位，而不同大小、结构或电荷氨基酸的替代将对结构具有更为明显的影响。
可根据本发明，将编码含有修饰优势免疫表位的病毒包膜糖蛋白的核酸导入APC可获得用于治疗或预防病毒感染的有效疫苗。优选将此核酸导入能够表达修饰糖蛋白的载体中。然而，本发明也涉及直接提供修饰的糖蛋白，或经过脂质体、基因枪等仅提供“裸露”的核酸(位于适当介质或佐剂中)。同样涉及用逆转录病毒、腺病毒或其它真核(如哺乳动物)表达载体，包括但不限于牛乳头瘤病毒、痘苗病毒或腺伴随病毒(AAV)提供核酸。
含有核酸、多肽、类似物或活性片段或含有前述成分的细胞作为活性成分的治疗性组合物的制备在本领域中是众所周知的。一般地，将这种组合物制备成可注射的液体溶液或悬液，然而，也可制备成在注射之前适于溶解或悬浮于液体中的固体形式。也可将此制品乳化。活性的治疗成分经常与药物上可接受的并且与该活性成分相容的赋形剂混合。适当的赋形剂有，例如，水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果必要，此组合物可含有次要量的增加该活性成分有效性的辅助物质如增湿或乳化剂、pH缓冲剂。
核酸、多肽、类似物或活性片段或含有前面成分的细胞可制成中和的药物上可接受盐形式的治疗组合物。药物上可接受的盐包括(与多肽或抗体分子自由氨基形式的)酸加成盐和与无机酸如，盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与自由羧基形成的盐也可衍生自无机碱。如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁及有机碱如，异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
该治疗性核酸、多肽、类似物或活性片段或细胞组合物一般通过例如单位剂量注射而静脉内施用。当用于指本发明治疗性组合物时，术语“单位剂量”指适用于人类单位剂量的物理上分离的单位，每单位含有经计算产生所需治疗效应的预定量的活性物质与所需的稀释剂；即，载体或赋形剂。
以可与该制剂相容的方式和以治疗上有效量的量施用该组合物。待施用的量依赖于待治疗的对象，治疗对象利用该活性成分的能力和对所需的特定病毒功能的抑制或中和程度。需要施用的准确的活性成分量依赖于医生的判断并且对每个患者是持异性的。然而，适当的剂量可以从每日每千克患者体重约0.1到20，优选约0.5到约10，且更为优选一到数毫克的活性成分并且依赖于施用的途径。用于初始施用及加强注射的适宜治疗方案也是可变的，但典型的是初始施用后以一或更多小时的间隔随后注射或其它施用而给以重复剂量。作为选择，可考虑足以维持血液中十纳摩尔到十微摩尔浓度的持续静脉内灌注。
大体上描述本发明后，通过参照在此提供的一些具体实施例可获得进一步的理解，如果没有特别说明，则这些实施例仅是为了说明的目的而不意在限制。实施例实施例1细胞的分离从Thomas Jefferson大学医院(费城，PA)传染病区临床办公室中6位感染HIV成年人施以肝素的血液中获取PBMC。从血沉棕黄色层中获取HIV-血清反应阴性供体的PBMC(NABI，miami，FL)。感染HIV患者处于发病早期，CD4+T细胞计数为300到600个细胞/mm3。所有病人正以蛋白酶抑制剂(crixivan)再加上二核苷进行抗病毒治疗；2位病人仅接受过齐多夫定或同时接受过拉米夫定(lamivudine)，并且三位患者仅仅用斯塔夫定(stavudime)治疗过或同时还用ddI和拉米夫定治疗过。一位患者涉及仅斯塔夫定-crixivan-联合施用这两种药物的盲试研究。
所有的感染HIV的患者表达HLA-A2抗原，这由美国红十字会(费成，PA)用标准的血清学技术测得。
实施例2
重组疫苗病毒的制备HIV-1IIIB分离物为全长env基因的来源并将ΔV3环突变子在合成的早/晚期vv启动子(Ear1等，1990，从人类免疫缺陷病毒1型包被基因中去除隐蔽痘病毒转录终止信号增强重组痘苗病毒的表达与免疫原性，病毒学杂志642448-2451)控制下克隆入基于pSCII的载体中。通过连接用PCR从pSVIII-env质粒(Dana-Farber癌症研究所，波士赖，MA，J.Sodroski惠赠)扩增获得的片段构建具有Δ297-329缺失的vv-ΔV3突变体(15，在此整个引用供参考)。用在ATG密码子前含有SalI位点和CCACC Kozak序列的合成寡核苷酸(5’AGA-AGAGTCGACCCACCACCATGAGAGTGAAGGAGA-3’，有义)(SEQ ID NO1)和含有KpnI位点的寡核苷酸(5’-ACAGGTACCCCATAATAGACTGTGAC-3’，反义)(SEQ IDNO2)通过PCR产生一个片段并且用于与第二个env片段连接。通过KpnI和BamHI消化pSVIII-env质粒而获得第二个片段，并且用在其5’末端含有BamHI位点的合成寡核苷酸(5’-AACGGATCCTTAGCACTTATCTGGG-3’，有义)(SEQ ID NO3)和含有TAA终止密码子且其后有NcoI位点的反义引物(5’-TTGCGCGGCCGCTTATAGCAAAATCCTTTCC-3’)(SEQ ID NO4)通过PCR产生第三个片段。将此三个片段连接至基于pSCII的载体(Thomas Jefferson大学(费城，PA)L.Eisenlohr博士惠赠)的SalI和NotI位点处从而构建质粒pSC-ΔV3。用B.Cullen博士(Howard Hughes医学院，杜克大学医学中心，Durham，NC)惠赠的重组克隆pIIIB(Hwang等，科学25371-74)通过类似的方法构建具有WT env基因的质粒(pSC-WTP)。按已述方法(Ear1等，1990，病毒学杂志，642448-2451)通过同源重组，用质粒pSC-ΔV3和pSC-WTP构建vv-ΔV3和vv-WTP。
实施例3合成肽的制备以前已描述过env肽D1(KLTPLCVTL，aa.121-129)(SEQ ID NO5)；D2(LLNATAIAV aa.814-822)(SEQ ID NO6)，和I-10(RGPGRAFVTI，aa.318-327)(SEQ ID NO7)(Dupuis等，1995，免疫学杂志1552232-2239；Takahashi等，1996，实验医学杂志.183879-889)。在费城(PA)的Wistar研究所通过标准的方法(Otvos，Jr.，等.，生化生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)122468)合成这些肽，通过反相高效液相色谱加以纯化并且通过氨基酸分析和激光解吸质谱对其进行特征分析。
实施例4按已述方法(Kozbor等，1981，免疫学杂志，1271275-1280)通过PBMC与来自产生-EBV的绒猴细胞系B95.9(美国典型培养物保藏中心，RockvMle MD)上清液孵育建立自体B-LCL，用作靶细胞。从Linda Sherman博士(The ScrippsResearch Institute，LaJolla，CA)获得以HLA-A2基因稳定转染并命名为JA2的Jurkat细胞系(Tsomides等，1994，实验医学杂志1801283-1293)。
实施例5细胞毒性分析按已述方法(Luzuriage等，1993，传染病杂志(J.Infect.Dis.)1671008-1013)进行标准的51Cr-释放分析。简言之，仅用5MOI的CR19痘苗病毒(vac)或者表达WT或ΔV3环env基因产物的痘苗病毒感染靶细胞(HLA-A2+LCL或JA2细胞)并以Na251CrO4标记(Dupont NEN，波士顿，MA)。清洗4次后，将104个靶细胞与T细胞系混合，该T细胞系是在以0.5％多聚甲醛处理而失活后通过以抗-CD3 n-mAb或以vvΔV3或vv-WT感染的自体LCL体外刺激而从每位患者建立的(Klein等，1995，实验医学杂志1811365)。4小时后，收获上清液并用1470 Wizard γ-计数器(Wallac，Gaithersburg，MD)测定放射活性。自发51Cr-释放总是小于最大释放的15％。特异性裂解计为100×([实验释放-自发释放]/[最大释放-自发释放])。通过从vv-env-感染靶细胞的特异性裂解百分数中减去vac-感染靶细胞特异性裂解的百分数而计算HIV-特异性裂解的百分数。如果其超过仅以vac感染细胞的平均裂解3个SD，那么认为此env-特异性反应为阳性(Luzuriaga等，1993，传染病杂志1671008-1013；Klein等，1995，实验医学杂志.1811365)。
实施例6CTL前体的有限稀释分析用有限稀分析(Klein，1995，实验医学杂志1811365；Koup等，1991，实验医学杂志，1741593-1600)测定env-特异性CTLP的频率。简言之，将PBMC与多聚甲醛处理后用vv-ΔV3或vv-WTP感染的自体LCL一起以每孔18,000到667个细胞稀释于96-孔微滴定平板的24个双份的小孔中。向孔中加入104个固定的刺激细胞和104个自体照射(6000拉德)过的PBMC。在第1和第10天，向培养物中补充以含IL-2(50U/ml)的培养基，于第16天分离并测试细胞毒性。将51Cr-标记的靶细胞(5×103)个加入到每孔中，并在4小时后收获上清液。靶细胞为以HIV-1IIIB连续感染或以1μm浓度env肽D1包被的JA2细胞。未反应孔的部分定义为其中的51Cr-释放不超过平均值加上24个对照孔自发释放的3SD的孔的数目。按Strijbosch等的描述(Strijbosch等，1987，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)97133-140)进行统计分析。CTLp频率表示为CTLp数/106个PBMC。HIV-特异性CTLP频率计为对表达HIV抗原的靶子与对对照靶子测得的CTLp频率间的差异。
实施例7抗体单克隆抗体(mAb)包括F105，一种针对由4个部分覆盖CD4受体结合位点的gp120不连续区域所组成表位的人类mAb(HmAb)(Thali等，1991，病毒学杂志.656188-6193)；G3-523，针对V3区域内表位的小鼠mAb(MmAb)(Moore等，1993，病毒学杂志.674785-4796)；670-D，针对位于gp120 C-末端区内表位的HmAb(Forthal等，1995，AIDS研究和人类逆转录病毒(AIDS Res.Hum.Retrovir.)111095-1099)；694/98-D，针对位于V3环内的线性表位(GRAF)的HmAbs(Gorny等，1993，免疫学杂志，150635-643)；697-D，一种识别gp120 V2区域内表位的HmAb(Forthal等，1995，AIDS研究和人类逆转录病毒.111095-1099)；和50-69II，针对env糖蛋白gp41区域内表位的HmAb(Forthal等，1995)。HmAb F105由M.Posner博士(New England DeaconessHospital，Boston，MA)提供，MmAb G3-523由M.Fung博士(Tanox Biosystems公司.，Houston，TX)提供，HmAb 697-D，694/98-D、670-D和50-69II由S.Zolla-Pazner和M.Gorny博士(纽约兽医中心，纽约)惠赠。通过在Protein-G柱(Pharmacia Brotech，Piscataway，NJ)上纯化而获得感染HIV供体血清的多克隆Ig。
实施例8免疫沉淀在无半胱氨酸和甲硫氨酸的DMFM培养基中用60μCi/ml的[36S]半胱氨酸与[35S]甲硫氨酸(Dupont NEN公司，波士顿，MA)标记过夜后，用Nonidetp-40(NP-40)缓冲液(0.5％NP-40，0.5M NaCl、10mM Tris HCl[pH7.5]对vv-ΔV3和vv-WTP感染的细胞进行免疫沉淀从而裂解细胞。用来自感染HIV患者的血清(HIV+血清)、G3-523和F105mAb沉淀放射性标记的细胞裂解物。简言之，用抗-gp120抗体与细胞裂解物孵育然后与多克隆免抗-人Ig(CorganonTeknika公司.，West Chester，PA)孵育，并且用蛋白A-Sepharose CL4B(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)沉淀免疫复合物。用存贮磷光成像仪(Storage Phosphor imager)(Phospho Imager 400S；Molecular Dynamic)分析于8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳的样品。根据包膜带中象素(pixel)计数的值确定包膜糖蛋白的相对量。
实施例9间接流式细胞术将以vv-ΔV3或vv-WTP-2感染12小时的LCL与HIV+血清或抗-gp120mAb(1μg/ml)在含有2％FCS和0.1％叠氮化钠的PBS缓冲液(PBS/FCS)中孵育30分钟，在PBS/FCS中洗三次，用FITC-偶联的羊抗人或抗-小鼠Ig F(ab’)2片段(Organon Teknica公司.，West Chester，PA)1∶40的稀释液染色，并以1％多聚甲醛孵育过夜而加以固定。将细胞在PBS/FCS中洗并于CoulterCytofluorograf System，PROFILE II上加以分析。
实施例10ADCC靶细胞由以vac、vv-ΔV3或vv-WTP感染的JA2细胞组成，并以51Cr标记。将来自HIV-血清反应阴性供体的PBMC用作env-特异性抗体存在下的效应细胞(效应细胞对靶细胞比例为50∶1)。根据公式[(实验cpm-自发释放cpm)/(最大cpm-自发释放cpm))×100计算特异性裂解的百分数。通过从vv-ΔV3或vv-WTP感染靶细胞的百分细胞毒性中减去仅以vac-感染靶细胞的背景活性而计算ADCC-特异性裂解。所有的实验条件重复三次，标准差＜5％。
实施例11合胞体形成分析和凋亡的诱导为了合胞体形成分析，用vac、vv-WTP、vv-ΔV3感染SupT-1细胞。对照培养物包括单铺的或以1∶1比例混合的未感染的细胞和以HIV-1III分离物长期感染的细胞。
在以vac、vv-ΔV3和vv-WTP env糖蛋白感染SupT-1细胞过程中以及在表达env糖蛋白细胞存在下以抗-CD3mAb刺激的未感染T淋巴细胞中分析凋亡的诱导。对于活化诱导的凋亡，通过在照射的APC存在下以抗-CD3 mAb反复刺激来自HIV-血清反应阴性供体的富含CD4的PBL而建立IL-2依赖性CD4+7细胞系。用vac、vv-ΔV3、vv-WTP感染单核细胞系THP1(美国典型细胞培养物保藏中心，Rockville，MD)12小时，用0.5％多聚甲醛在冰上固定30分钟，并以PBS洗三次。在以100ng/ml抗-CD3mAb刺激72小时之前用表达vv-env的THP-1细胞(106个细胞/ml)预沉淀IL-2依赖性T母细胞(5×105个细胞/ml)(Tuosto，L等，1995，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)252907-2916)。
实施例12凋亡相关染色质降解的检测和DNA含量分析通过用于测定断裂核的流式细胞术方法，用碘化丙锭(PI)染色和DNA凝胶电泳而定量测定经历凋亡细胞的百分比。简言之，用70％的乙醇于4℃固定细胞3小时，于800g离心5分钟并将细胞沉淀重悬于含有0.1mM EDTA(Na)2、50μg/ml RNA酶(50U/mg)、和PI(50μg/ml)的PBS中。然后在CoulterCytofluorograf System，PROFILE II上通过流式细胞术分析之前，用PBS洗细胞2次。为了分析凋亡性细胞死亡特征性的DNA梯度，按前述(Corbeil.J.，等.，1996，实验医学杂志.18339-48)测定低分子量DNA断裂。简言之，在pH8.0的0.5ml低渗缓冲液(5mM Tris-HCL，20mM EDTA，0.5％Triton X-100)中裂解细胞沉淀，并于27,000g离心10分钟。用650μl异丙醇和100μl5M的氯化钠于-20℃沉淀断裂的DNA过夜。27,000g离心15分钟后，将沉淀物干燥并重悬于pH7.4的10mM Tris、1mMEDTA、0.5％SDS中，并用8μl无DNA酶的RNA酶A(5mg/ml)于37℃处理30分钟。电泳在0.75％琼脂糖凝胶中进行，并以5μg/ml溴化乙锭染色后在UV光下观察DNA。
实施例13反转录-PCR和序列分析用从感染HIV患者的PBMC中分离的细胞RNA和2套引物通过RT-PCR检测相应于env肽D1、I-10和D2区域内的天然病毒序列。一套引物扩增相应于env第1-365个氨基酸、跨越一个env区域的1到1095核苷酸的区域(根据HIV-1HXB2序列，登录号K03455)(5’ACA GAA TTC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT-3’，有义)(SEQ ID NO8)和(5’-GGT CTA GAC CTG AGG ATT GCT TAA AGA TT-3’。反义)(SEQ ID NO9)，并且第二套物扩增相应于第749-856个氨基酸的2248到2570核苷酸的区域(5’-AAC GGA TCC TTA GCA CTT ATC TGG-3’，有义)(SEQID NO10)和(5’-ACG TCG ACC TCG AGT TAT AGC AAA ATC CTT TC-3’，反义)(SEQID NO11)。将获得的PCR片段克隆入pBluescript II SK+/-载体并在ThomasJefferson大学Kimmel癌症研究所核酸中心用Reverse和M13-20引物进行测序。
实施例14ΔV3和WT env糖蛋白在vv-感染细胞中的表达为了检测HIV env糖蛋白与对其突变基因产物细胞反应之间的结构-功能关系，用完整的和缺失V3环的env基因构建一套重组痘苗病毒。用感染HIV患者的血清对来自代谢标记JA2细胞的env基因产物的免疫沉淀显示在代表性重组克隆中有少于20％的变异(图1)。为了功能研究，分别筛选出具有全长和突变env糖蛋白相当表达水平的命名为vv-7ΔV3和vv-WTP-2的2个克隆。
对vv-感染细胞env糖蛋白的免疫荧光染色和免疫沉淀(图2A和B)显示表达7ΔV3突变体的细胞不结合G3-523抗-V3环mAb。它们表现出对针对gp120CD4结合位点的F105mAb更低的结合，这与以前证明V3环与gp120糖蛋白C4区域之间结构关系的报告(Wyatt，R.，M.等.，病毒学杂志.666997-7004)相一致。尽管在结合F105 mAb方面的差异，vv-7ΔV3感染细胞与感染HIV患者血清之间的反应性表明寡聚gp120在感染细胞表面上的折叠在缺失V3环的突变体中仍然保留。
实施例15vv-7ΔV3 env突变体对env-特异性CTL反应的诱导通过以抗-CD3 mAb和表达野生型或缺失V3环env糖蛋白的自体LCL刺激而在感染HIV患者的PBMC中诱导env-特异性的CTL活性。因为这些患者为HLA-A2+，故将以vv-WTP-2或HIV-1IIIB分离物感染的JA2细胞用作61Cr-释放分析中的靶子。所有感染HIV的患者在抗-CD3mAb诱导的PBMC培养物中表现出env-特异性的CTL活性，特异性裂解为11％到26％(E∶T比例为10∶1，图3，左版)。在6位患者的4位中，以表达env糖蛋白的自体LCL刺激PBMC得到细胞毒反应的显著增加。然而，裂解活性的程度随每种培养物而异。例如，在患者417、521和428中，CTL活性在以表达7ΔV3突变体细胞诱导的培养物中更高，而其余患者中，对全长env基因产物的反应高于或等于由7ΔV3基因产物诱导的反应，并且类似于以抗-CD3mAb诱导的非特异性反应。用有限稀释分析对以HIV-1IIIB分离物感染的JA2细胞检测到CTT、活性的类似变化。在感染HIV的3位患者中，针对感染HIV-1IIIB的JA2细胞的CTLp频率为从49到216CTL/106个PBMC(图3，右版)。在批量培养诱导PBMC中同样显示出增高水平CTL活性的患者521与428中检测到CTLp的最高值。
在诱导的培养物中CTL反应的不均一性表明，完整和突变env基因产物免疫原性的差异可能影响感染HIV患者中扩增的CTL克隆的组成。为了进一步研究这一点，在以代表env糖蛋白至少三个不同表位的合成肽D1(氨基酸.120-128)，D2(氨基酸.814-823)和I-10(氨基酸.318-327)诱导的培养中，测定抗感染vv-7ΔV3和vv-WTP-2的JA2细胞的CTL活性。在能够诱发对所有三种肽的CTL反应的患者417中，在以肽D1诱导的培养中检测到抗env的最高活性，相反，对肽I-10和D2的反应下降(图4A)。对肽I-10和D2低反应的分子基础可能与在患者优势HIV分离物显示出的这些表位中自体病毒序列内增强的差异性有关(图4B)。这与以前的证明初级HIV分离物env糖蛋白V3环和C-末端区域内序列变化的报导(Hwang，等，1991，科学253.71-74，Dupuis，M，S.1995，免疫学杂志.1552232-2239)相一致。
也可观察到在裂解表达7ΔV3突变体的JA2方面，以优势肽D1诱导的培养物较以全长env基因产物诱导的培养物更为有效(即，大于总CD3+T细胞的70％)。与以表达WTP-2 env基因产物的细胞诱导的培养物相比，在以D1肽诱导的培养物中抗突变env基因产物的较高的反应与2位HIV患者的以感染vv-7ΔV3 LCL刺激的PBMC中D1-特异性CTLp频率的增加相吻合(分别为20和55CTL/106个PBMC对12和32CTLp/106个PBMC)。这些实验结果表明在有些感染HIV的患者中V3区的缺失重新指导对env糖蛋白保守表位的免疫反应。
实施例16抗感染7ΔV3突变体的靶细胞的ADCC在随后的研究中，用HIV-血清反应阴性供体的PBMC和从感染HIV患者的血清中纯化的多克隆Ig研究表达7ΔV3突变体和WTP-2 env糖蛋白的细胞对ADCC-介导裂解的易感性。3个HIV血清反应阴性个体的PBMC的实验结果显示E∶T比例为50∶1时对vv-WTP-2感染的自体LCL具有15％-20％的特异性裂解(图5)。在对V2和V3环(697-D和694/98-D)、CD4-结合位点(F105)、C-末端(670-D)和gp160的gp41区域(50-69II)内表位特异性的5种mAb中，对感染WTP-2靶细胞的最高ADCC活性由694/98-D和F105 mAb所介导。针对gp120其它区域的抗体对ADCC-介导的裂解具有较少的影响。相反，在多克隆抗-gp120抗体或F105mAb存在下检测到的对感染vv-7ΔV3靶细胞的特异性裂解少于4％(图5)。感染vv-7ΔV3的细胞对ADCC介导的裂解的抗性提高可能与由于V3区域缺失而诱导的CD4-结合区域中构象改变以及该分子与存在于大多数感染HIV患者中存在的抗-V3-特异性抗体之间反应性的缺乏有关。
实施例17合胞体形成和7ΔV3突变体对凋亡的诱导在以表达完整和突变env糖蛋白的痘苗病毒感染的CD4+SupT-1细胞中分析V3环在诱导凋亡机制中的作用。在光学显微镜下对感染vv-WTP-2的SupT-1细胞的检查显示出细胞聚集成团并在感染后12小时出现合胞体，并且通常在感染后24小时80％到90％的细胞形成巨大的细胞。在仅以痘苗病毒或vv-7ΔV3突变体感染的培养物中没有观察到合胞体。
在感染后16小时的单个培养物中分析与合胞体形成有关的凋亡过程。通过以PI对核染色的DNA含量分析表明以全长env糖蛋白对细胞的感染导致出现约20％具有代表凋亡细胞的sub-G1 DNA含量的细胞，同时伴随细胞周期中G1期细胞比例的下降(从39％到15％)。相反，在未感染培养物和以痘苗病毒或7ΔV3突变体感染培养物中凋亡细胞的数目低于5％。通过在琼脂糖凝胶上大小分离后观察到180-200bp核小体大小的DNA多聚体形成特征性“步梯”现象，这也征实表达野生型env糖蛋白Sup-T1细胞中的凋亡(图6B)。以vac感染或表达7ΔV3突变体的Sup-T1细胞在分离的低分子量DNA中未能诱导出超过背景水平的DNA断裂。
在以vv-WTP-2感染SupT-1细胞过程中对凋亡的诱导与以前的证实全长HIV env糖蛋白导致合胞体形成和凋亡的报导(Corbeil等，实验医学杂志.18339-48)；(aurent-Crawford等，1993，AIDS研究和人类反转录病毒9761-773)相吻合。然而，已显示仅仅HIV很少在体内诱导感染细胞的凋亡(Finkel等，1995，自然医学(Nature Medicine)1129-134)。为了分析V3区域的缺失对未感染细胞凋亡诱导的影响，将IL-2-依赖性CD4+T淋巴细胞在与APC表面上表达的全长和突变env糖蛋白孵育后用TCR/CD3复合物加以诱导。为了诱导凋亡，将感染vv-7ΔV3和vv-WTP-2的THP-1细胞用多聚甲醛固定并与IL2-依赖性T淋巴细胞孵育2小时从而在以抗-CD3mAb刺激之前让表达于T细胞上的CD4与细胞表面相关的gp120接触。通过以PI染色核72小时后和流式细胞分析而监测到的对凋亡的诱导显示，在以vac和vv-7ΔV3突变体感染的培养物中断裂的DNA不到7％。另一方面，在活化前与全长env糖蛋白预孵育的T细胞显示DNA断裂约为对照断裂水平的3倍(图6C)。
尽管表达同样水平全长和突变env糖蛋白的自体LCL，能够在感染HIV患者的PBMC中诱导CTL活性，但以突变env基因产物刺激的培养物表现出对env糖蛋白保守表位增加的活性。虽然并不意在受理论限制，但是导致ΔV3突变体中保守表位的免疫原性增加的机制可能与由于在该区域内天然序列变异多所致的感染HIV患者对V3较低的反应有关。或者，用表达全长env糖蛋白的APC对CTL反应的诱导比由突变的env基因产物刺激所产生的诱导可能效果较差，因为完整gp120向未感染CD4+T细胞上的结合可能抑制这样细胞的功能，因而减少对最佳诱导CTL活性所需要的帮助(Giovarelli等，1988，免疫学杂志.1412831；Landolfo等，1985，科学229176；Rornagnani，1991，今日免疫学(Immunol.Taday)12256)。此外，已证明相应于HIV-IIIB分离物V3环内表位的自由I-10肽可通过包括自发占据相同CTL上的MHC I类分子和TCR的自我否决(self-veto)机制灭活鼠CD8+CTL(Takahashi等，1996，实验医学杂志.183879-889)。此现象对于人类HIV病理的可能应用是当此病毒感染的细胞被裂解并且消化的细胞内蛋白释放至T细胞环境中时，V3环有关的自我否决效应可抑制对CTL反应的诱导。
V3区域的缺失导致ADCC约80％的下降的发现可能与V3环缺失有关，此环用作感染HIV患者血清中丰富的抗-V3环特异性抗体的靶子(Vogel等，1994，免疫等杂志.1531895-1904)。其次，在gp120其它表位中的一些构象改变也促进对有些抗-gp120抗体，包括那些针对env糖蛋白C4区域的抗体的低结合。V3环缺失导致既无合胞体形成又不诱导CD4+细胞中凋亡的事实与下面的观点相一致，即这些过程由表达成熟env糖蛋白的细胞膜与CD4受体间的相互作用所触发(Corbeil等，1996，实验医学杂志.18339-48；Tuosto等，1995，欧洲免疫学杂志.252907-2916)。最近发现的CD4-gp120复合物与细胞膜上CXCR-4和CCR-5共同受体之间的物理结合(Trkola等，1996，自然384184-187；Lapham等，1996，科学274602-604)，表明这些相互作用可以启动导致诱导特定CD4+细胞群中细胞死亡的事件(Feng等，1996，科学272872-877)，并且其结构可能含有或影响复合物对gp120上趋化因子受体结合位点的性质(Trkola等，1996，自然，384184-187)。例如，已显示从HXB2 gp120和JR-FL gp120中缺失V3环破坏了CD4-诱导的对于mAb 48d和17b的表位(Wyatt等，1992，病毒学杂志.666997-7004；Thali等，1991，病毒学杂志.656188-6193)，这可能与ΔV3JR-FL gp120不能与CCR-5相互作用有关(Trkola等，1996，自然384184-187)，并且HIV-1 LAI的V3和C4区域中单个氨基酸改变也对这些表位的结构具有重要作用(Moore等，1993，病毒学杂志.674785-4796)。
用ΔV3突变体的免疫接种诱导对env糖蛋白更多的潜在保守区域的免疫反应，这也将减少用HIV病毒株特异性env糖蛋白免疫的必要。为了诱导细胞反应，ΔV3突变体可作为质粒DNA注射(Okuda等，1995，AIDS研究和人类逆转录病毒11933943)或在注射至宿主中之前通过细胞内免疫而在自体细胞内表达(Wu等，1996，病毒学杂志703290-7)。在任一种情况中，表达突变env基因产物的细胞有可能在体内逃避ADCC-介导的裂解并且可能不干扰其它CD4+细胞的功能活性。ΔV3突变体与感染HIV患者的抗-gp120抗体相互作用的事实表明其能够在体内诱导抗体反应。
也应该注意到虽然这些资料显示ΔV3突变体在表达它的细胞中没有诱导凋亡，但目前仍不知道表达该突变env糖蛋白的细胞对由全长env糖蛋白诱导的凋亡易感到何种程度。
现已充分描述过本发明，故对于本领域中的普通技术人员来说，很显然可在其中造成许多变化与修饰而不偏离本文列出的本发明的实质或范围。
权利要求
1.编码病毒包膜糖蛋白的核酸在制备用于诱导抗该病毒的细胞免疫的药物中的应用，其中所述的包膜糖蛋白(a)含有修饰的优势免疫表位；和(b)诱导对所述包膜糖蛋白保守表位的细胞免疫。
2.权利要求1的应用，其中所述的核酸被导入抗原呈递细胞(APC)中。
3.权利要求1的应用，其中所述的病毒为慢病毒。
4.权利要求2的应用，其中所述的慢病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV)。
5.权利要求1的应用，其中所述的优势免疫表位为所述包膜糖蛋白的第三个可变环(V3)。
6.权利要求1的应用，其中所述的优势免疫表位为中和表位。
7.权利要求2的应用，其中所述的APC刺激外周血单核细胞(PBMC)。
8.权利要求7的应用，其中所述的PBMC与以编码全长包膜糖蛋白的APC刺激的PBMC相比表现出对该包膜糖蛋白保守表位增加的细胞毒T-淋巴细胞(CTL)活性。
9.权利要求2的应用，其中所述的编码修饰的包膜糖蛋白的APC对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)具有抗性。
10.权利要求2的应用，其中所述的编码修饰的包膜糖蛋白的APC不形成合胞体。
11.权利要求2的应用，其中所述的编码修饰的包膜糖蛋白的APC不经历凋亡。
12.权利要求2的应用，其中所述的编码修饰的包膜糖蛋白的APC诱导对所述病毒的细胞免疫而不诱导CD4+T细胞的凋亡。
13.权利要求1的应用，其中的优势免疫表位被缺失。
14.制备抗病毒疫苗的方法，包括(a)将编码所述病毒的包膜糖蛋白的核酸导入载体DNA或脂质体中，其中所述的包膜糖蛋白含有修饰的优势免疫表位；和(b)将所述的载体DNA或脂质体与适当的佐剂混合。
15.权利要求14的方法，其中所述的核酸被导入APC中并将所述的APC与佐剂混合。
16.权利要求14的方法，其中所述的病毒为慢病毒.
17.权利要求15的方法，其中所述的慢病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV)。
18.权利要求14的方法，其中所述的优势免疫表位为所述包膜糖蛋白的第三个可变环(V3)。
19.用于诱导抗病毒细胞免疫的疫苗，包括(a)在其表面表达所述病毒的包膜糖蛋白的细胞，其中所述的包膜糖蛋白含有修饰的优势免疫表位；和(b)佐剂。
20.权利要求19的疫苗，其中所述的病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV)。
全文摘要
本发明涉及用于诱导抗病毒细胞免疫的方法,其中的病毒通过导入具有改变或缺失的优势免疫表位的突变形式的病毒包膜(env)糖蛋白而进行了突变。还公开了疫苗和制备该疫苗的方法。
文档编号A61K39/12GK1243751SQ9911089
公开日2000年2月9日 申请日期1999年5月28日 优先权日1998年5月29日
发明者金子有太郎, D·科兹波 申请人:财团法人人类科学振兴财团, 味之素株式会社, 托马斯杰斐逊大学