使用合成信使rna无饲养层衍生人诱导多能干细胞的制作方法

使用合成信使rna无饲养层衍生人诱导多能干细胞的制作方法
【专利说明】使用合成信使RNA无饲养层衍生人诱导多能干细胞
[0001 ] 相关申请
[0002]本申请要求2013年5月13日提交的美国申请序列号13/893，166的权利并是它的部分连续案；该申请要求2012年5月13日提交的美国临时申请序列号61/646,292的优先权的权利。这些申请的每一个的内容在此以其整体引为参考。
技术领域
[0003]本公开主要涉及用于通过受控方法使用一种或多种工程化的重编程因子来生成诱导多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体地，本公开涉及建立重编程因子的组合，所述组合包括常规重编程因子与反式激活结构域间的融合，其经优化用于多种细胞类型的重编程。更具体地，本文所公开的示例性方法可用于从多种哺乳动物细胞类型，包括非人的灵长类动物细胞产生诱导多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA，无饲养层衍生人诱导多能干细胞的示例性方法。
【背景技术】
[0004]以下包括了可能有助于理解本公开各个方面和实施方式的信息。这并非承认任何此处所提供的信息是现有技术，或与本文描述或要求保护的发明相关，或者任何明确或隐含引用的出版物或文件是现有技术。
[0005]诱导多能干细胞(iPSC)的治疗潜能激发了开发重编程方法的努力，来回避对体细胞进行基因修饰以实现重编程进入多能状态的需求。第一批在这方面成功实现的“非整合”方式一一蛋白转导，质粒转染和利用腺病毒载体一一由于得到的iPSC的转化率低而在应用中受到限制。最近已证明，采用游离型DNA、仙台病毒、和合成的信使RNA(mRNA)的技术产生的“无足迹” iPSC，得到的效率相当于或超过使用整合病毒载体得到的效率。RNA转染原则上是这些方法中最有吸引力的，因为它提供对重编程因子(RF)表达时间过程的精确控制，而完全避免了对于“清理”被重编程的细胞以清除载体的残余痕迹的任何要求。然而，由于为诱导人细胞中的多能性而要求每日重新转染持续约2周的这一需求，目前基于mRNA的重编程流程相对劳动强度较大。这些过程还依赖于使用饲养层细胞，这增加了过程的复杂性和技术上的可变性，同时引入了非人源的(“异种”)的生物材料的潜在污染源。
[0006]生成诱导多能干细胞(iPSC)的主要困难是将分化细胞重编程为多能细胞的效率低。先前已经报道，当用由0ct4和MyoD的反式激活结构域(称为M30)组成的融合基因，连同Sox2，Klf4和c-Myc(SKM)转导的时候，5%的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)被重编程成iPSC。此夕卜，在大多数转导的MEF中，包括没有成为iPSC的细胞中，M30促进多能性基因的染色质重塑。这些观察表明了在给予更有利的培养条件下超过5%的细胞获得成为iPSC的能力的可能性。

【发明内容】

[0007]由于RNA分子一旦被转染到细胞，特别是哺乳动物细胞时由其引起的潜在的细胞免疫应答，用mRNA成功重编程非人源细胞一直难以实现。在重编程人成纤维细胞的过程中，通常的做法是使用一种病毒蛋白作为诱饵受体使转染的mRNA分子诱导的干扰素减效。然而，使用诱饵受体的这种策略或其它类似策略都没有成功地将源自非人类物种，包括狒狒、马和狗的成纤维细胞重编程。
[0008]因此，为了解决这些缺陷，本公开提供了用于生成能够产生身体的所有的不同组织的干细胞的方法和组合物。在某些方面，使用信使RNA分子且不需要病毒载体或饲养层细胞，本文公开的方法可用于将非人源成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)。与之前报道的细胞重编程方法学相比，使用的示例性方法和组合物产生了令人惊讶的和意想不到的改进效率，并且克服了先前未解决的在非人类哺乳动物细胞中抑制细胞免疫反应的问题。
[0009]因此，提供了方法、试剂和/或组合物，其可用于通过改进重编程因子(RF)混合物，特别是通过应用常规重编程因子，如0ct4(也被称为0ct3/4)，SoX2等的工程化变体，并结合已知的强转录因子如VP16和MyoD的反式激活结构域而加速mRNA介导的重编程。本文所公开的方法和组合物得到了一个无饲养层的方案，其极大地减少了涉及基于mRNA的重编程的时间，成本和精力。
[0010]一方面，本公开提供了一种用于对体细胞进行去分化或重编程的方法，其包含:a)用组合物转染分离的体细胞，所述组合物包含有效量的融合产物，该融合产物为选自0ct4、3(?2、1(1￡4、015^、他1108和1^1128的任意一种或多种合成1]11?嫩重编程因子与反式激活结构域之间形成的融合产物，从而所述体细胞被重编程或去分化。
[0011]在一个实施方式中，提供了权利要求1的方法，其中组合物包含融合于N末端的MyoD反式激活结构域的0ct4。在一个实施方式中，0ct4融合到三倍串联形式的N-末端的MyoD反式激活结构域。
[0012]在一个方面，提供了用于通过使用权利要求1的重编程因子的合成mRNA中的任意一种或多种对哺乳动物细胞进行重编程的方法，所述方法包含:a)将靶细胞以1.5万到50万个细胞每标准6孔板的孔的密度生长在无饲养层表面上;b)重编程期间用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞。
[0013]在一个实施方式中，靶细胞以3万、7.5万、10万、或15万细胞/标准6孔板的孔的密度生长在无饲养层表面上;b)重编程期间用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞，而更早的时间点比稍后的时间点使用较低剂量;c)无需传代而获得iPSC。
[0014]在一个实施方式中，靶细胞以1.5万、7.5万、10万、或15万细胞/标准6孔板的孔的密度生长在无饲养层表面上，而每孔的体积调整为0.5ml至5ml之间的适当培养基；重编程期间用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞，而更早的时间点比稍后的时间点使用较低剂量;无需传代而获得iPSC。
[0015]在特定实施方式中，在整个重编程过程中使用较低剂量减少了细胞免疫应答并产生了提高的iPSC成功率。在其他实施方式中，使用高纯度的mRNA分子，即没有来自体外转录的污染性异常转录本，使细胞得以以较低的密度植入，在重复转染下存活，并获得更高的iPSC的产量。
[0016]在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一个实施方式中，所述方法无异种。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是非人灵长类动物细胞。在一个实施方式中，所述非人灵长类动物细胞是食蟹猴细胞。
[0017]在一个实施方式中，所述一种或多种因子选自mRNA、调控RNA、siRNA、miRNA以及它们的组合。
[0018]在一个实施方式中，所述体细胞用至少两种不同的RNA转染。在一个实施方式中，所述体细胞选自单能、专能(multipotent)、多能(pluripotent)、以及分化的细胞。在一个实施方式中，所述一种或多种RNA诱导体细胞去分化成单能细胞、专能细胞、或多能细胞。
[0019]在一个实施方式中，所述至少一种因子选自0CT4，S0X2，NANOG，LIN28，KLF^PMYCmRNA。在一个实施方式中，0CT4，S0X2，NANOG，和LIN28的mRNA组合施用。在一个实施方式中，0CT4，S0X2，KLF4 和 MYC 的 mRNA 组合施用。
[0020]在一个实施方式中，将转染的细胞保持在培养物中作为诱导多能干(iPS)细胞。在一个实施方式中，所述转染的细胞形成诱导多能干细胞，其进一步包含诱导iPS细胞形成分化细胞。
[0021]在一个方面，提供了一种用于治疗或抑制患者中的疾病或病症的一种或多种症状的方法，其包括在体外去分化细胞和对所述患者施用所述细胞。在一个实施方式中，所述组合物还包含Rarg和LrH-1反式激活结构域。在一个实施方式中，所述组合物包含融合于VP16反式激活结构域的0CT4。
[0022]在一个实施方式中，本公开提供了源自非人灵长类动物细胞的iPSC，该细胞用于建立疾病模型系统，因为它们可以产生没有其他动物产品的无内整合(in-1ntegrat1n-free)、无饲养层测试环境。因此，本文所述非人iPSC可用于临床前测试。
[0023]本文描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方式，包括但不限于
【发明内容】
中阐述或描述或引用的属性和实施方式。不意味着全部包含在内，本文描述和要求保护的发明并不限于或通过在
【发明内容】
中限定的特征和实施方式，其只以说明而非限制为目的包括在内。另外的实施方式可在以下【具体实施方式】中公开。
【附图说明】
[0024]图1.用基于M30的mRNA重编程混合物衍生得到的iPSC集落。
[0025](A)从第一基于M30的BJ重编程试验衍生得出的增殖的iPSC克隆中的两个的10倍亮场图像。(B)增殖克隆针对多能性标志物的免疫染色。
[0026]图2.使用基于M30混合物的无饲养层重编程。
[0027](A)免疫荧光成像显示由5万XFF成纤维细胞上的无饲养层衍生产生的TRA-1-60+集落，其比较了基于c-Myc和L-Myc混合物和4小时和24小时转染方案。所有孔转染9天。4小时转染培养物在实验的第15天进行固定染色，24小时转染培养物在第11天。(B)来自同一实验的400ng/ml的Stemfect孔的10倍亮场成像，其示出了在衍生的第9天，培养物中主要为近融合的hESC样集落。(C)在再次用400ng/mL的Stemfect方案转染10万XFFs 9天的后续试验中，标记视场的1X亮场时序，其示出上皮化和随后出现了hESC样集落。
[0028]图3.使用4种不同的mRNA混合物的重编程效率的比较。流程图总结了4种混合物对比试验。
[0029]图4.在HDF-a无饲养层重编程培养物中的hESC样集落。在7.5万HDF-a成体成纤维细胞无饲养层衍生的第9天，出现的hESC样集落的10倍亮场图像，使用Stemfect转染试剂递送作为培养基增补剂的400ng/ml mRNA混合物(M30+c_Myc+Nanog+)来处理所述成纤维细胞9天。
[0030]图5.合成mRNA混合物的产生。(A)示意图总结了制备mRNA重编程混合物的过程。
(B)在SYBR E-凝胶上的编码数个RF和荧光报告分子的合成mRNA。每个泳道加入500ng的RNA0
[0031 ]图6.用2-硫尿嘧啶产生合成mRNA混合物用作重编程混合物。在SYBR E-凝胶上的编码数个RF的合成mRNA。所述mRNA的尿嘧啶碱基的1 %被2-硫尿嘧啶取代。每个泳道加入10ng的RNA。
[0032]图7.使用mRNA混合物产生的人iPSC，其中mRNA被2-硫尿嘧啶修饰。在(A)Pluriton或(B)Allele重编程培养基中的不同重编程过程期间，重编程(A)7天后或(B)Il天后的人iPSC 群。
[0033]图8.利用mRNA混合物在无饲养层重编程培养中产生的食蟹猴iPSC集落。图中所示的是在第10天及13天出现的hESC样集落的10倍亮场图像。在第10天的图中，邻近中心的细胞显示出从成纤维细胞向干细胞的形态变化。在第13天的图中，细胞形成完全转化的猴iPSC大集落。
【具体实施方式】
[0034]描述本发明时，所有未在本文中定义的术语具有本领域公认的其常用的含义。就下面的描述是本发明的【具体实施方式】或具体用途的程度而言，其意图仅是说明性的，并不限制所要求保护的发明。以下的描述意在涵盖包括在本发明的精神和范围中的所有替换、修改和等同物。
[0035]通过选定的一组转录因子的表达，分化的细胞可以恢复为多能状态，这打开了患者特异性细胞可能用于产生任何所需类型的细胞以用于遗传性疾病的体外研究和最终用于细胞替代疗