一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及其用途的制作方法

专利名称：一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和干细胞学领域技术。尤其是涉及一种带修饰的腺病毒载
体和目的基因表达盒的重组腺病毒，该重组腺病毒能诱导哺乳类动物细胞为多能性干细胞
(induced pluripotent stemcell)。
背景技术：
胚胎干细胞 胚胎干细胞(embryonic stem cell)来自发育到囊胚阶段的胚胎的内细胞团，是 一组具有自我复制能力(self-renewing)的全能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种 功能细胞。胚胎干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。人胚胎干细胞最为深远 的潜在用途可能是生产细胞和组织，胚胎干细胞经剌激后可发展为特化的细胞，通过细胞 替代疗法治疗许多疾病，例如帕金森氏病、Alzheimer' s病(痴呆症)、脊髓损伤、中风、烧 伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎等。 尽管人胚胎干细胞有着巨大的医学应用潜力，由于人胚胎干细胞来自人胚胎，所 以其研究不可避免地引发伦理道德问题以及各种争议。这些问题主要包括人胚胎干细胞的 来源是否合乎法律及道德，应用潜力是否会引起伦理及法律问题。 1996年7月5日出生的"多莉"羊是首例克隆成功的哺乳动物，证明高度分化的体 细胞具有遗传的全能性，可以逆转到没有分化的状态，并成功发育成个体。重新编程的可行 性为人类研究多能干细胞而不涉及伦理道德问题提供了一种思路。
诱导多能干细胞 日本京都大学的Yamanaka等研究发现利用逆转录病毒将c-Myc、 Klf4、 0ct4、 Sox2这4个转录因子基因整合入小鼠成纤维细胞可以获得成体细胞诱导的多能干细胞 (induced pluripotent stem cell)，即多能性干细胞。这类细胞类似胚胎干细胞，具有胚 胎干细胞的很多生理生化特性，例如，可以在体外快速增殖并稳定传代；并可持续表达胚胎 干细胞的标志蛋白0ct4， Sox2， SSEA-1和Nanog ;持续具有碱性磷酸酶活性；裸鼠皮下注射 有成瘤性；体内体外分化实验证明可分化为三胚层；小鼠和大鼠的多能性干细胞还可获得 嵌合鼠等。继小鼠之后，用逆转录病毒将c-Myc、Klf4、0ct4、Sox2这4个转录因子基因整合 入人成纤维细胞可以获得人的iPS细胞。与此同时，用慢病毒将0ct4、Sox2、Nanog、Lin28 基因整合入人成纤维细胞也获得了多能性干细胞。 从高度分化的体细胞诱导产生多能性干细胞，有广泛的应用前景，例如，多能性干 细胞可以用于建立体外疾病模型，进行药物筛选和细胞替代疗法等，而且，将体细胞转化为 有胚胎干细胞特性的细胞系后，那么一种高度分化的体细胞就可可能转变为另一种高度分 化的体细胞。以往可以通过体细胞核移植对体细胞进行去分化，或者通过与胚胎细胞融合 的方式对体细胞进行重编程。但这两种方法都面临着伦理道德，技术瓶颈，效率低下等诸多 难题。
因为多能性干细胞的研究有可能避免诸多的伦理问题，因此，全世界许多实验室 也投入了 iPS细胞的研究工作，并且成功将多种细胞诱导为多能性干细胞，如成纤维细 胞、终末期分化的淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞和属于成体干细胞的神经干 细胞。诱导多能性干细胞所使用的基因也从最初的四个减为三个(0ct4+Sox2+Klf4或 0ct4+Sox2+Nanog或0ct4+Sox2+Esrrb)或两个(0ct4+Sox2或0ct4+Klf4)。
虽然这项研究有着极为诱人的前景，要使其成为现实，尚有许多工作和技术挑战 等着我们去解决。首先在诱导方法上，诱导多能性干细胞多用的是逆转录病毒和慢病毒载 体，然而逆转录病毒和慢病毒载体避免不了外源基因的整合。这种整合使转录因子在细胞 内长期表达，会引起细胞突变和癌变的风险，阻碍了多能性干细胞在临床上的应用。
诱导多能性干细胞还可以用腺病毒作为载体。腺病毒是一种双链DNA病毒，基因 组长约36kb，衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六 联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，除此之外还有其他一些小蛋 白，如VI、VI11、 IX、 11Ia和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白， 12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛(Fiber)以五联 体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区(knob)。五联体和纤毛的头节区可 与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用(Gall JG等，J Virol. 1998Dec ;72 :10260-4 ;Sakurai F等，Curr Gene Ther. 2007Aug ;7 :229-38)。
腺病毒与其它载体相比，具有如下优势(l)腺病毒的36kb双链DNA易于以基因 重组技术操作；(2)腺病毒可有效转导分裂期和非分裂期细胞，并指导高水平的蛋白质表 达；(3)在细胞中以游离状态存在，不整合到靶细胞基因组，不会引起插入突变，无致癌性； (4)感染范围广，可感染不同类型细胞，包括上皮、成纤维、内皮、基质细胞，这些细胞来源可 以是人、灵长类、其他哺乳类及啮齿类动物；(5)滴度高(可以达到1012VP/ml)，稳定性好，储 藏和运送方便，易于进行规模化生产和运输。
诱导多能干细胞转录因子 在诱导多能性干细胞所选用的基因中，0ct4(0ctamer-4)是POU家族的转录因子， 是植入前胚胎发育的重要调节因子，是哺乳动物多能性细胞维持多能状态的关键调控因 子，是细胞多能性的标志，该基因的序列可以获自GenBANK NM_002701。
Sox2(sex determining region Y-box 2)基因属于SoxBl家族，在未分化的胚 胎干细胞、胚胎癌细胞中表达，而随着其分化表达下调。Sox2的表达虽然不局限于多能 性细胞，但它对早期胚胎发育和抑制分化也十分重要，缺乏Sox2的胚胎无法形成上胚层 (印iblast)，在胚胎干细胞中阻断Sox2的功能造成胚胎干细胞的分化。该基因的序列可以 获自GenBANK NM_003106。 Klf4(Kril卯el-like factors 4)是一种新发现的真核锌指蛋白转录因子，它是 Kru卯el样转录因子家族的成员之一。Klf4具有癌基因和肿瘤抑制基因的双重特性。Klf4 过表达可以维持0ct4的表达而抑制胚胎干细胞的分化。它也可协同0ct4和Sox2调节某 些基因的转录。 c-Myc是一种原癌基因，其主要作用是促进细胞增殖，在某些成体干细胞维持自我 更新中起一定作用。过表达持续活化形式的c-Myc的小鼠ES细胞，在撤去生长因子后仍维 持了自我更新和细胞全能性；而c-Myc功能缺失后，小鼠ES细胞失去全能性并开始分化为
5中胚层和原始内胚层细胞。 Nanog的转录受0ct4/Sox2复合物的调节，Nanog缺乏将导致细胞自发地向原始 内胚层细胞分化。全基因组分析发现，在小鼠和人类的ES细胞中，0ct4、 Sox2和Nanog共 同调控着许多靶基因，其中很多基因的产物是对发育至关重要的转录因子，0ct4、 Sox2和 Nanog三个转录因子共同形成了ES细胞的多能性核心调控系统，其中涉及了自调节和前馈 等多种机制。 Lin28是一个高度保守的RNA结合蛋白，受miRNA调节，通过结合mRNA和多核糖体 促进翻译效率。在许多物种中是一种控制多种细胞发育的负调控基因。在人类和小鼠ES 细胞中，Lin28的表达随着ES细胞的分化而下降。 UTF1 (undifferentiated embryonic cell transcription factorl)是多會g相关 转录因子，在胚胎和新生睾丸，生殖母细胞强表达。 Esrrb (Estrogen-related rec印tor beta)编码与雌激素受体氨基酸序列相似的 核受体，属于细胞核激素受体家族的类固醇激素受体。其一相似蛋白是小鼠胎盘发育所必 需的。Esrrb对维持胚胎干细胞自我更新起重要作用。
小分子药物 DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-cytidine， 5-azaC)被用于处理诱导 多能性干细胞过程中产生的部分重编程的细胞，发现其能将其转化到完全重编程状态。随 后一些可促进基因转录或有利于维持干细胞多能性的小分子药物被用于诱导多能性干细 胞，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)和丙戊酸(valproic acid， VPA) ， G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX01294，钙激动剂BayK8644，丝裂原活化蛋白 激酶(MEK)抑制剂PD0325901和糖原合成酶_3 (GSK-3)抑制剂CHIR99021等。

发明内容
本发明提供一种能高效诱导哺乳类细胞为多能干细胞的重组腺病毒，及其诱导方 法和用途。 本发明提供的诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体主要由腺病毒载体、B亚群腺 病毒纤毛蛋白基因和含诱导多能性干细胞的基因0ct4和Sox2表达盒构成。其特征在于 该腺病毒载体为C型腺病毒，其腺病毒纤毛头氨基酸序列为腺病毒B亚型腺病毒纤毛头氨 基酸序列所替代；目的基因表达盒序列为至少包含0CT4和S0X2基因的表达盒核苷酸序列， 该重组腺病毒能诱导哺乳类动物的细胞成为多能性干细胞。 人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属(A至F)。目前常用的腺病毒 载体来源于人的2型及5型腺病毒，在血清学分类上均属C亚群。C亚群腺病毒主要与柯萨 奇B病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体即CAR。但是，在人体多 数细胞并不表达CAR受体，因此用这类腺病毒转染体细胞，效率很低。 为达提高腺病毒载体对多数人体细胞的高效感染，本发明的技术方案为在现在 的C型腺病毒载体的基础上，其纤毛头受体结合位置改造成了 B亚群腺病毒的纤毛头。所 述腺病毒B亚型腺病纤毛头的氨基酸序列可以是但不限于下述之一11型腺病纤毛头的氨 基酸序列，35型腺病毒纤毛头的氨基酸序列。 构建含B亚群腺病毒纤毛蛋白基因的重组腺病毒载体载体的方法为首先，人工合成B亚群腺病毒纤毛头的核苷酸序列。合成序列经酶切后，与pCL0N9载体连接，构建成 pCL0N9-FB。 pCL0N9-FB经酶切，回收片段与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3载体在感受态 大肠杆菌BJ5183内进行同源重组得到含B亚群腺病毒纤毛头的含有5型腺病毒右臂的质 粒pPE3-FB。该质粒与含5型腺病毒左臂和目的基因的穿梭质粒共转染HEK293A细胞重组 出含B亚群腺病毒纤毛蛋白基因的重组腺病毒载体。 B亚群腺病毒包括3型、7型、11型、16型、35型、50型腺病毒。B亚群腺病毒 感染细胞主要以CD46分子为吸附受体(Fleischli C等，J Gen Virol. 2007 Nov ;88 : 2925-34 ;Pache L等，Virology. 2008 Jun5 ;375 :573-9 ;Pache L等，J Virol. 2008 Aug ; 82 :7923-31)。 CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，这种蛋白几乎表达在除了红细胞以 外所有人外周血细胞和人体细胞表面。 在本发明的一个实施方案中，C亚群腺病毒为5型腺病毒，其纤毛头受体结合位置 改造成了 B亚群腺病毒的11型腺病毒的纤毛头。 在本发明的又一个实施方案中，C亚群腺病毒为5型腺病毒，其纤毛头受体结合位 置改造成了 B亚群腺病毒的35型腺病毒的纤毛头。"前述的纤毛头结合位置"是指(请用碱基位置或者氨基酸位置表示)
腺病毒的组织嗜向性主要由其纤毛决定。因此，本发明所述重组腺病毒载体载体 仍具有B亚群腺病毒的感染特性，细胞受体从CAR变成了 CD46，能有效感染低表达CAR受 体的细胞。原有的感染吸附受体的改变，使该类重组病毒可以感染哺乳动物尤其是人的大 多数细胞，例如皮肤成纤维细胞，成纤维细胞和淋巴细胞等，对造血细胞、白血病细胞、间充 质干细胞和树突状细胞有很高的感染效率，而且基因表达水平也大为提高，将该重组腺病 毒载体连接上报告基因EGFP后发现，该重组载体对人体成纤维细胞的感染能力可以达到 70%以上，极显著高于常规的C型腺病毒载体。 在本发明的一个实施方案中，该类重组腺病毒载体基因组还携带了可诱导多能性 干细胞的转录因子基因0ct4和Sox2。 在胚胎发育过程中，从受精卵开始到桑葚胚阶段的细胞都表达0ct4。随着胚胎发 育的成熟，0ct4在各种成熟组织中都失去表达，只在具有多能性或全能性的生殖细胞中还 维持一定量的表达。0ct4基因敲除的小鼠只能发育到类似囊胚的阶段，然而该囊胚ICM中 的细胞不具有发育全能性，只能形成滋养外胚层。 0ct4具有一个保守的DNA结合结构域-P0U结合域。0ct4含有家族的保守区—— N端和C端各有一个脯氨酸富集区，它们是0ct4因子的转录活性区。0ct4因子能特异地识 别八聚体序列，通过结合到八聚体上调节基因的转录。 Sox2最早被发现就是在胚胎细胞中被鉴定出来。在胚胎发生中，Sox2蛋白的表达 一直持续了整个着床前的发育阶段。在体外，Sox2在未分化的胚胎干细胞和胚胎癌细胞中 表达，而随着其分化表达下调。 多种方法均可获得哺乳动物的0ct4和Sox2基因。以人为例，首先从Genbank中 获得人0ct4和Sox2的cDNA全序列，用2A序列将0ct4和Sox2连接，并在上下游设计合适 酶切位点，人工合成0CT4-2A-S0X2全序列DNA。将合成的DNA经酶切连入上述含5型腺病 毒左臂的穿梭质粒。将含有0ct4和Sox2基因和B亚群腺病毒纤毛蛋白基因的重组腺病毒 载体转染人成纤维细胞，对重组载体进行0ct4和Sox2蛋白表达的Westernblot检测，鉴定
7结果为重组腺病毒载体载体可高效转染人成纤维细胞，并高量表达0ct4和Sox2蛋白。
在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是其他可以诱导体细胞为多 能性干细胞的基因，包括但不限于Klf4， Nanog， Lin28。 锌指蛋白Klf4在干细胞中与STAT3途径相关，并与0ct4和Sox2相互作用，活化 ES细胞中的主要启动子Leftyl 。 Klf4过表达可以维持0ct4的表达而抑制ES细胞的分化。 它也可协同0ct4和Sox2调节某些基因的转录。 Nanog蛋白是一种具有阻碍分化作用的同源异型框转录因子，对于维持小鼠胚胎 干细胞的自我更新能力很重要，并且在早期将要分化成胚胎干细胞的胚胎中Nanog也有表 达。 Lin28在许多物种中是一种控制多种细胞发育的负调控基因。Lin28的许多功能
还不被完全揭示，只是在干细胞中，它能提高间叶细胞恢复过程中的重编程频率。 在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是能促进细胞增殖的基因，
包括但不限于c-Myc。 c-Myc是继p53之后最为受人瞩目的原癌基因，其主要作用是促进细胞增殖。它与 人类基因组有25， 000个结合位点。它的N端可以与TRRAP、TIP48相作用，影响组蛋白乙酰 化酶、ATP酶的作用，而C端含有螺旋一环一螺旋(HLH)及亮氨酸拉链结构域，在与Max蛋 白形成稳定的复合物后与DNA序列(CACA/GTG)相结合，调节基因的表达。此外c-Myc在某 些成体干细胞维持自我更新中起一定作用。c-Myc是LIF/STAT3和WNT信号通路的一个主 要的下游基因，而两条信号通路在多能性的维持具有起重要作用。 在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是降低p53表达的p53 siRNA和0CT4下游基因UTF1。 据报道，重编程因子KIF4可能通过p53抑制起作用。虽然下调p53的表达不能完 全替代KLF4的作用，但联合使用p53 siRNA可提高诱导多能性干细胞的效率。p53表达沉 默可以促进成纤维细胞的永生化，而p53 siRNA对抗细胞凋亡，影响细胞的衰老过程。c-MYC 可激活p53通路诱导细胞的凋亡。UTF1是0CT4/S0X2复合体的下游因子，在胚胎干细胞高 表达，分化启动后表达下调。虽然UTF1在重编程中不能替代0CT4的作用，但联合使用可 以提高碱性磷酸酶阳性的诱导多能干细胞克隆的出现。UTF1具有组蛋白样特性，作为稳定 的染色质相关转录抑制子起作用，可能利于细胞从分化状态向多能状态转换(Denget al.， 2008)。 在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是细胞核激素受体基因 Esrrb。 Esrrb是Klf2、Klf4和Klf5的耙基因之一，Esrrb同时又调控Klf4和Klf5。 Esrrb 可激活0ct4的转录，维持胚胎干细胞的自我更新和多能性。在诱导多能细胞重编程中， Esrrb可替代Klf4。 本发明提供的一类重组腺病毒载体载体，其携带的诱导多能性干细胞所必需的基 因可以是一个干细胞相关，也可以是多个干细胞相关基因的不同组合，因为一些细胞本身 就可表达上述的一个或多个转录因子，例如，成纤维细胞可表达c-Myc和Klf4，已经证实诱 导鼠和人的成纤维细胞为多能性干细胞时，外源的c-Myc不是必需的，但是缺乏c-Myc时细 胞的重编程过程可能会变缓(Nakagawa et al. ，2008 ;Wernig et al. ，2008)。
神经祖细胞也表达Sox2和c-Myc，其表达量可稍高于胚胎干细胞，因此仅用0ct4/ Klf4组合诱导人神经祖细胞也可获得多能性干细胞。 在本发明的又一个实施方案中，重组腺病毒载体所携带的干细胞相关基因还可以 来源于小鼠，大鼠，牛，羊或其他哺乳动物。因此，该重组腺病毒载体还可应用于诱导其它哺 乳动物的多能性干细胞。 在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体的转录因子基因表达盒中编码 序列的启动子可以选自以下之一，但不限于(a)延伸因子EF-la启动子、增强子及其突变 体序列；(b)泛素基因Ubi启动子、增强子及其突变体序列；(c)转录因子E2F启动子、增强 子及其突变体序列；(d)人巨细胞病毒(hCMV)启动子、增强子及其突变体序列；(e)鼠巨细 胞病毒(mCMV)启动子、增强子及其突变体序列。 启动子活性随细胞类型不同而不同，诱导多能性细胞的基因应选用在大多数细胞
中具有活性的启动子，特别是在胚胎干细胞中有较强活性的启动子。在现有慢病毒载体和 逆转录病毒载体介导的诱导多能性细胞的报道中几乎都采用了EFla启动子。以腺病毒载
体感染人胚胎干细胞转导绿色荧光蛋白基因的实验表明，EFla启动子在胚胎干细胞有较 强活性，而CMV启动子在胚胎干细胞中感染后3天即被关闭。 在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体的携带多个可诱导多能性干细 胞的基因之间可以但不限于下列方式之一连接(a)多核糖体进入位点(IRES)序列连接； (b) 口蹄疫病毒2A序列连接；(c)连接肽(linker)连接。 诱导多能干细胞的一个重要问题是多个干细胞相关基因在靶细胞内的同时表达， 采取多个载体共转染的方法则对于一个具体的细胞来讲同时被转染的效率不高。将诱导 所需基因同时插入到一个具有高容量、广感染谱和高感染效率的载体上将大大提高诱导效 率。本发明将多个多能性相关的基因连接后连入一个重组腺病毒载体，下列方式可以是下 列方法之一，但不限于这些连接方法IRES序列连接；2A序列连接；linker连接。连接后的 干细胞相关基因可以受共同受启动子调控，同时在一个细胞内表达，细胞诱导效率大为提 高。 在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干 细胞的方法是将该重组腺病毒载体一次或多次感染细胞。 腺病毒在宿主细胞是非整合表达， 一次感染后表达持续时间短，而成体细胞重编 程为多能性干细胞需要外源多能性相关转录因子持续存在10-12天，转染一次不足以启动 内源干细胞相关的转录因子表达。采取每2-3天感染一次，多次感染有助于提高效率。
在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能 性干细胞时，感染复数(Multiplicity Of Infection, MOI)为30-100，此处MOI为病毒 PFU(plaque forming unit)与细胞的倍数。M0I过低，感染效率低，M0I过高，细胞死亡增 加。 在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干 细胞时，哺乳动物体细胞接种密度约为5 X 104个/mL，细胞接种密度过低，细胞可能过快凋 亡而不利于下一步的去分化，细胞接种密度过大，细胞会很快长满培养瓶，会阻碍细胞克隆 的生长，而且过密的细胞铺叠在一起有可能造成假克隆。最优化的细胞密度一般要参照细 胞的倍增时间而定。饲养层细胞密度为5X 104个/mL。
在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能 性干细胞，可以在之前、同时和/或之后使用小分子药物，小分子药物包括但不限于丙戊 酸(valproic acid， VPA) 、 BIX 01294、5_氮杂胞苷(5-azaC) 、5-氮杂-2 '-脱氧胞苷 (5-aza-dC)和Bayk8644。 在诱导多能性干细胞过程中使用促进基因活化、利于基因转录和的小分子药物可 以縮短诱导时间，提高诱导效率。如DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷组蛋白去乙酰化酶 抑制剂曲古抑菌素和丙戊酸，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX01294，钙激动剂BayK8644， 丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂PD0325901和糖原合成酶-3(GSK-3)抑制剂CHIR99021 。 多种小分子药物的联合使用，效果可更明显。 在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性
干细胞，可以在之前、同时和/或之后使用维持胚胎干细胞多能性和增殖的细胞因子，包括
但不限于LIF、 bFGF、 EGF、 SU5402、 PD184352、 PD0325901和CHIR99021 。 用干细胞相关基因诱导产生多能性干细胞时联合应用小分子药物组合可以减少
转录因子的数目，并促进细胞重编程过程。而且小分子的应用使重编程的过程更为简单。在
小分子药物的协同作用下只需转入0ct4和Sox2就可将成纤维细胞诱导为多能性干细胞。
转入基因的减少简化了操作，同时也减少了插入突变。 在本发明的又一个实施方案中，提供了该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为 多能性干细胞后的传代培养方法。 在诱导小鼠细胞为多能性干细胞时，新分离的克隆可以立即应用酶消化法传代， 然而，对于其他哺乳动物来说，这一点比较困难。以人为例，人多能性干细胞在单细胞时很 难增殖，多能性干细胞样的克隆出现后，要进行扩增多能性干细胞，分离传代多能性干细胞 的方法主要为机械分离法。机械分离多能性干细胞，并将其传至铺有新饲养层或可替代饲 养层的基质胶上进行传代和增殖。在细胞多次使用机械法传代扩增后，才可以应用消化法 传代。人多能性干细胞也更易于分化，因此在初始几次的传代过程中，需不断除去分化细 胞，避免其扩增从而代替了多能性干细胞。 —般的，胚胎干细胞培养液可以应用于培养iPS细胞，促进胚胎干细胞增殖的培 养液也可以促进iPS细胞的增殖。本发明在培养人iPS过程中使用人胚胎干细胞培养液。 培养液既要满足被转染细胞的营养需求，也应能维持多能性干细胞的去分化状态。因此，培 养液应由体细胞培养液转换为干细胞培养液的时间根据多能性干细胞出现的时间而定。
在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干 细胞，这些多能性干细胞具有了多潜能细胞的生长特性和生化特性，具体表现为细胞出 现胚胎干细胞样的形态特征，形成三维的细胞克隆；持续表达干细胞相关转录因子0ct4， Sox2和Nanog等；生长速度加快；在多次传代后仍可保持自我更新的能力；表达碱性磷酸 酶活性；可分化为来源于三胚层的各种细胞；裸鼠皮下注射形成畸胎瘤。
在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干 细胞，人多能性干细胞可用于临床治疗的细胞替代疗法和化妆品应用；哺乳动物多能性干 细胞可用于制作转基因动物和动物疾病模型。 本发明的优点是本发明的重组腺病毒载体即传承了腺病毒载体不整合，可感染静 止期和非静止期细胞等优点。同时具有感染谱广，感染效率高，避免了一般腺病毒载体感染效率低，感染细胞范围窄，感染细胞后出现多能性干细胞的时间长等缺点。 另一方面，本发明的重组腺病毒载体将多个诱导多能性干细胞的基因连接在一
起，整合入一个重组腺病毒载体载体构建为整合载体，避免了多个载体同时转染，转染效率
高，对细胞损伤小，转染方法更为简单。 此外，本发明的重组腺病毒载体还可以通过小分子药物的协助，将感染细胞的转 录因子可减少为2个，降低了转染外源基因的负面影响。 不仅如此，本发明的重组腺病毒载体还可以从患者或不同个体的血液或皮肤取 材，体外培养细胞后，进行诱导iPS细胞，从而建立来自不同个体的干细胞库，并将这些细 胞用于自体的细胞替代疗法。应用自体的皮肤、血液或其他组织产生干细胞，再进行细胞替 代疗法，避免了不同个体的免疫排斥反应。
附图简沭

图1 :含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒载体pCL0N9-F11的构建流 程。 图2 :腺病毒包装质粒pPE3的构建流程。 图3 :含11型腺病毒纤毛头核苷酸序列的5型腺病毒右臂质粒pPE3-F11构建流程。 图4 :携带人0CT4-2A-S0X2-2A-NAN0G的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒 pDC328-0SN和携带人0CT4-2A-KLF4-2A-S0X2的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC328-0KS 构建流程。 图5 :启动子EF1 a调控EGFP的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC328_EGFP和启
动子CMV调控EGFP的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC315-EGFP构建流程。 图6 :重组腺病毒载体1-6号亚克隆Ad5/Fll-0SN感染293细胞0CT4和S0X2蛋
白表达的Western blot检测，证明1_6号重组腺病毒载体Ad5/F11_0SN能在感染细胞表达
目的蛋白。 图7 :重组腺病毒载体Ad5/Fll-EF-EGFP和Ad5/Fll-CMV-EGFP感染人胚胎干细胞 后4天，Ad5/Fll-CMV-EGFP感染的人胚胎干细胞已无荧光，Ad5/Fll-EF-EGFP感染的人胚胎 干细胞仍有荧光，证明启动子EF1 a在胚胎干细胞比启动子CMV活性更强。
图8 :转染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN前的人成纤维细胞。 图9 :转染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN后5天的人成纤维细胞，添加不
同小分子药物的克隆出现情况，添加5-azaC (2 y M) +VPA (2mM) +BIX (1 y M)的组比
5-azaC(2iiM)+BIX(liiM)组和5-azaC(2yM)组出现克隆早，克隆数目多。 图10 :转染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN后10天的人成纤维细胞，出现典型胚胎
干细胞样克隆。 图11 :转染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样 克隆碱性磷酸酶检测呈阳性。 图12 :转染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样 克隆转录因子0ct4表达的免疫荧光检测呈阳性。 图13 :转染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样 克隆转录因子Sox2表达的免疫荧光检测呈阳性。
图14 :转染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样 克隆转录因子Nanog表达的免疫荧光检测呈阳性。 图15 :从人发根毛囊分离培养角质细胞，3天后细胞从发根毛囊长出。 图16 :人发根毛囊分离培养的角质细胞感染Ad5/Fll-0SN后3天出现胚胎干细胞
样克隆。
具体实施例方式
本发明以腺病毒Ad5/Fll携带人0CT4-2A-S0X2-2A-NAN0G基因作为例证，对本发 明加以进一步具体说明。贯穿本申请，引用了各种专利和专利出版物，目的是为了描述本发 明领域的发展状态。下面的实施例不是为了限制本发明专利要求的范围，只是为了示例某 些实施方案。在示例性方法中本领域技术人员所想到的任何变更将落入本发明的范围。
实施例1 :现以5型腺病毒载体为例，说明含Adll腺病毒纤毛的头编码序列的腺 病毒右臂质粒pPE3-F11的构建 第一步合成(TAKARA)含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列(序列来源 NC_011212， GenBANK)如SEQ ID NO :3所示，命名Ad5Fll，其中(1)第232-365位碱基 5型腺病毒纤毛蛋白tail序列；(2)第364-1212位碱基11型腺病毒纤毛蛋白shaft、 knob序列；(3)其余碱基5型腺病毒基因组序列，见Microbix Biosystems公司的 pBHGloxdeltaEl，3Cre序列。第二步合成VT176序列(SEQ ID NO :4)禾PVT177序列(SEQ IDNO :5)，构建pCL0N9 载体。Ad5F11序列经Pacl+Hindl11酶切，回收2656bp片段，与pCL0N9/PacI+Hind111酶切 的载体连接，经酶切和测序鉴定确认，正确者命名为pCL0N9-F11。构建流程如图1所示。
第三步pCL0N9-F11经HindlII+Aat11酶切，回收5916bp片段。
第四步人工合成ADP序列(TAKARA)，序列见SEQ ID NO :6，如图2所示，构建腺病 毒包装质粒pPE3。 pPE3载体经Pacl酶切，回收线性化载体。 第五步pCL0N9-Fll/HindlII+Aat114微升，pPE3/PacI 2微升，共同转化感受 态大肠杆菌BJ5183 (Qbiogene公司)。铺板培养，挑取克隆进行酶切鉴定，正确者命名为 pPE3-F11。经大样质粒提取纯化，保存于深低温冰箱中。pPE3-F11构建流程如图3所示。
实施例2 :pDC328-0SN和pDC328-0KS构建 第一步合成EF1 a启动子序歹lj (TAKARA)，序列见SEQ ID NO :7。 第二步合成的EF1 a用Xbal+Sall双酶切，回收600bp片段。第三步pDC315载体(购自Microbix Biosystem Inc. (Toronto)，含有5型腺病
毒左臂El区1417至2344bp序列片段，及反向末端重复序列)经Xbal+Sa11双酶切，回收
3345bp片段。 第四步将第三步和第四步回收的片段连接，经酶切和测序(Invitrogen)鉴定确 认，正确者命名该载体为pDC328。 第五步人工合成0CT4-2A-S0X2-2A-NAN0G序列(TAKARA)，序列来源0CT4 NM_002701 ;S0X2 NM_033106 ;NANOG NM_024865，GenBank。序列如SEQ ID N0:8所示，其中 (1)第14-1093位碱基为0CT4编码序列；(2)第1162-2113位碱基为S0X2编码序列；(3) 第2169-3087位碱基为NANOG编码序列;(4)第1100-1157和2120-2183位碱基为2A序列。人工合成0CT4-2A-KLF4-2A-S0X2序列(TAKARA)，序列来源KLF4 NM_004235， GenBank。序 列如SEQ ID NO :9所示，其中(1)第14-1093位碱基为0CT4编码序列；(2)第1162-2674 位碱基为KLF4编码序列；(3)第2750-3703位碱基为S0X2编码序列；(4)第1100-1157和 2680-2744位碱基为2A序列。第六步合成的0CT4-2A-S0X2-2A-應0G和0CT4-2A-KLF4-2A-S0X2经
BamHI+Sall双酶切，分别回收3106bp片段和3706bp片段。 第七步pDC328质粒经BamHI+Sall双酶切，回收392lbp片段。 第八步将第六步回收的片段分别与第七步回收的片段连接，经酶切和测序
(Invitrogen)鉴定确认，正确者分别命名载体为pDC328_0SN和pDC328_0KS。pDC328-0SN和pDC328-0KS构建流程如图4所示。 实施例3 :pDC328-EGFP和pDC315-EGFP的构建第一步合成EGFP序歹lj (TAKARA)，序列见SEQ ID NO :10。 第二步合成的EGFP经EcoRI+Sall双酶切，回收726bp片段。第三步pDC328和pDC315经EcoRI+Sall双酶切，分别回收3897bp和3883bp片段。第四步第二步回收的片段分别与pDC328和pDC315酶切回收片段连接，酶切鉴定
正确者分别命名为pDC328-EGFP和pDC315-EGFP。pDC328-EGFP和pDC315-EGFP构建流程如图5所示。 实施例4 :Ad5/Fll-0SN、Ad5/Fll-0KS、Ad5/Fll-EF-EGFP和Ad5/Fll-CMV-EGFP重 组腺病毒的细胞内重组及扩增纯化 本发明提供一类含11型腺病毒纤毛基因的至少携带0CT4和S0X2基因的重组腺 病毒载体，是在HEK293人胚胎肾细胞内重组完成的。HEK293细胞株购于加拿大Microbix Biosystems公司，该细胞由剪切的5型腺病毒DNA转化，含5型腺病毒El区，腺病毒DNA对 其具有高转染率，通过细胞内重组产生具有感染力的腺病毒。 第一步将上述构建好的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC328-0SN、pDC328-0KS、 pDC328-EGFP和pDC315-EGFP，分别与含有11型腺病毒Fiber的杂合腺病毒载体右臂质 粒pPE3-Fll，通过LipoFectamine 2000共同转染HEK293细胞。转染具体方法步骤参见 Invitrogen公司的LipoFectamine2000试剂盒操作说明书。pPE3-F11含有5型腺病毒 右臂，缺失E1区，其重组酶系统Cre/LoxP可以保证病毒的高效重组。在载体共转染后的 9-14天，陆续出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化(具体方法参见GeneTransfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主编，Humana Press, Clifton， New Jersey)，重组出腺病 毒载体。 第二步重组腺病毒载体的鉴定，以腺病毒Ela基因引物排除野生型腺病毒，以 NANOG基因引物鉴定重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN，以KLF4基因引物鉴定重组腺病毒Ad5/ F11-0KS，以EGFP基因引物鉴定Ad5/Fll-EF-EGFP和Ad5/F11_CMV-EGFP。腺病毒Ela基因 弓l物上游弓l物5， _cggaattcaccatgagacatattatc_3， (SEQ ID NO :11)，下游弓l物5，-gcgt cgacttatggcctggggcg-3' (SEQ ID NO : 12)，扩增片段1005bp。 NANOG基因引物上游引物 5'_cagaaggcctcagcacctac_3' (SEQ ID NO : 13)，下游弓l物5'-attgttccaggtctggttgc-3' (S EQID NO :14)，扩增片段lllbp。 KLF4基因引物上游引物5'-aagatcaagcaggaggcggtctcttcg-3， (SEQ ID NO :15)，下游引物5，-ttcatgtgtaaggcgaggtggtccgaG-3， (SEQ ID NO :16)， 扩增片段704bp。 EGFP基因引物上游引物5，-gctctagagaattcaccatggtgagcaagggc-3' (S EQ ID NO :17)，下游弓l物5'_cgggatccgtcgacttattacctagatccggtgg_3' (SEQ ID NO :18)， 扩增片段793bp。鉴定正确的重组腺病毒载体分别命名为Ad5/Fll-0SN(CCTCC-V200902， 2009年1月9日，中国典型培养物保藏中心)、Ad5/Fll-0KS、 Ad5/Fll-EF-EGFP和Ad5/ F11-CMV-EGFP。第三步重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN、 Ad5/Fll-0KS、 Ad5/Fll-EF-EGFP和Ad5/ F11-CMV-EGFP在HEK293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具 体方法参见GeneTransfer and Expression Protocols, Murray EJ主编，HumanaPress， Clifton, New Jersey)。用TCID50法测得重组腺病毒载体滴度。
实施例5 :重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN在293细胞表达蛋白的检测和鉴定
将HEK293细胞按5 X 105细胞/孔铺在6_孔板中，在37°C孵箱5 % C02培养，第二 天换为无血清DMEM培养液lml，然后，感染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN， MOI为5，37。C孵 育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，加入含10% FBS的DMEM培养液培 养48小时，裂解细胞作Western blot检测0CT4和S0X2。(图6)
实施例6 :Ad5/Fl 1-EF-EGFP和Ad5/Fl 1-CMV-EGFP感染人胚胎干细胞
以Ad5/Fll-EF-EGFP和Ad5/Fll-CMV-EGFP感染人胚胎干细胞，比较不同启动 子在胚胎干细胞中的活性。将鼠胚成纤维细胞铺到用O. 1%明胶包被的6-孔培养板中， 4X10Scells/孔。第二天将人胚胎干细胞(美国南加州大学应其龙博士惠赠)铺到饲养细 胞上，培养液为含20%血清替代物(KSR)的Knockout DMEM，添加4 y g/mL的bFGF， 1 %非必 需氨基酸，0. lmM巯基乙醇，lmM谷氨酰胺。第三天换为无血清DMEM/F12，按MOI为50分别 加入Ad5/Fll-EF-EGFP和Ad5/Fll-CMV-EGFP，37。C孵育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两 次，将腺病毒洗去，加入胚胎干细胞培养液培养。感染后24小时荧光显微镜观察，胚胎干细 胞和饲养细胞都发绿色荧光，72小时后感染Ad5/Fll-EF-EGFP的孔中胚胎干细胞仍发绿色 荧光，饲养细胞荧光消失，而感染Ad5/Fll-CMV-EGFP的孔中胚胎干细胞绿色荧光消失，饲 养细胞仍有荧光(图7)。实验证明EFla启动子在胚胎干细胞中比CMV启动子活性更强。
实施例7 :用重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN感染人成纤维细胞诱导iPS细胞
第一天准备待感染细胞 1、接种原代培养人成纤维细胞，以4X 105个细胞接种于T-25培养瓶，培养液为 DMEM(低糖)，添加10%胎牛血清，1%非必需氨基酸。
2、37°C、5% 0)2孵箱培养过夜(见图8)。
第二天感染目标细胞 换无血清培养液4ml，然后，感染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN， MOI为30-100，
37°C、5% C02孵育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，加入含10% PBS
添加5-azaC (2 ii M) 、 VPA (2mM)和BIX (1 ii M)的培养液培养。 第四天第二次感染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN 方法同前。 第五天铺饲养细胞饲养细胞的准备参见Wicell的NSCB Technical Support (http: 〃www. wicell.org/index. phpoption = com content&task = section&id = 9&Itemid = 256)，六孑L板用 0. 1%明胶包被后以4X 105个鼠胎成纤维细胞/孔铺板。
第六天将感染后的人成纤维细胞转到饲养细胞上 换为干细胞培养液(含20%血清替代物(KSR)的Knockout DMEM，添加4 y g/mL 的bFGF， 1 %非必需氨基酸，0. ImM巯基乙醇，ImM谷氨酰胺)，以后每日换液。
经培养4-5天后，有些细胞开始变圆，并聚集成较小的细胞克隆，形成类似于ES 细胞的集落形态，随着培养天数的增加，细胞克隆逐渐增多，细胞集落也长的更大。BIX 01294、VPA和5' -azaC三种小分子联用时比BIX 01294与5' -azaC联用或是单用5' -azaC 克隆出现早，克隆数目多(图9)。用吸管小心挑取细胞集落，并接种于新的饲养层上，取一 小部分进行碱性磷酸酶和其他干细胞标志物(0CT4、 S0X2、NAN0G)的检测，剩余细胞继续传 代扩增并分批冻存。 转染10天左右的人成纤维细胞，细胞开始出现胚胎干细胞样的形态特征，出现较
多的细胞克隆，克隆呈鸟巢状，细胞开始叠加生长，细胞之间的接触抑制性降低。转染后的
细胞克隆形成率较高，说明本发明提供的重组腺病毒载体可以高效转导可诱导多能性干细
胞，见附图10。 3周后挑出克隆进行培养，作干细胞特征检测，包括碱性磷酸酶检测、干细胞
多能性标志物检测(0CT4、 S0X2、 NAN0G)、体外分化实验和畸胎瘤形成实验等。 碱性磷酸酶活性主要在胚胎干细胞和一些成体干细胞内表达，在正常的人体细胞
内不表达。碱性磷酸酶检测后发现，转染后，可形成克隆的人成纤维细胞具有碱性磷酸酶活
性，而未形成克隆的人成纤维细胞染色后，碱性磷酸酶活性为阴性。见附图11。 转录因子0ct4表达的免疫荧光检测。 一抗为兔抗人0ct4(稀释度l : 200) ，二抗
为鼠抗兔FITC(稀释度1 : 100)。结果表明，转染10天后，可形成克隆的人成纤维细胞表
达干细胞标志的转录因子0ct4。见图12。 转录因子Sox2表达的荧光检测。 一抗为兔抗人Sox2 (稀释度1 : 200) ， 二抗为鼠 抗兔FITC(稀释度1 : 100)。结果表明，可形成克隆的人成纤维细胞表达干细胞标志的转 录因子Sox2。见图13。 转录因子Nanog表达的荧光检测。 一抗为山羊抗人Nanog(稀释度l : 200) ， 二抗 为鼠抗兔FITC(稀释度1 : 30)。结果表明，可形成克隆的人成纤维细胞表达干细胞标志的 转录因子Nanog。见图14。 实施例8 :用重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN感染人毛根角质细胞诱导iPS细胞
从人毛根获取原代角质细胞培养物取材方便，角质细胞诱导iPS细胞的效率高。 用75%酒精擦拭拔发处头皮，拔取5-10根头发，选取发根粗，带有白色毛囊的头发，剪下发 根用1.2IU/mL Dispase37t:消化3小时，再用0. 05%胰蛋白酶(加0. 02% EDTA) 37。C消化 5分钟。终止消化离心收集细胞用人胚胎干细胞培养液培养(含20%血清替代物(KSR)的 Knockout DMEM，添加4 y g/mL的bFGF， 1 %非必需氨基酸，0. ImM巯基乙醇，lmM谷氨酰胺)。 3天后细胞从毛根长出(图15)。
第一天铺饲养细胞 六孔板用0. 1%明胶包被后以4X105个鼠胎成纤维细胞/孔铺板。
第二天准备待感染细胞 1、接种原代培养人角质细胞到饲养细胞上，以1. 5X 105个细胞/孔接种于6-孔
15培养板中，培养液为胚胎干细胞培养液(含20%血清替代物(KSR)的Knockout DMEM，添加 4 ii g/mL的bFGF， 1 %非必需氨基酸，0. ImM巯基乙醇，ImM谷氨酰胺)。 2、37°C、5% C02孵箱培养过夜。 第三天感染目标细胞 换无血清DMEM/F12培养液4ml，然后，感染重组腺病毒载体Ad5/F11_0SN， MOI为 30-100， 37°C 、5% C02孵育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，加入添加 5-azaC (2 y M) 、 VPA (2mM)和BIX (1 y M)的胚胎干细胞培养液培养。 第五天第二次感染重组腺病毒载体Ad5/Fll-0SN 方法同前。 第六到十天以后每日换液。 第十天以后停止添加5-azaC、 VPA和BIX。 感染腺病毒载体Ad5/Fll-0SN后3天即出现干细胞样克隆(图16)。 序列表 〈110〉上海东方肝胆外科医院 〈120〉一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及 其用途 〈130>IDC090007 〈160>17 〈170>PatentIn version 3.2 〈210>1 〈211>282 〈212>PRT 〈213〉Adllfiber的shaft和knob氨基酸序列 〈400〉 1 Gly Val 1 Ser Leu
Gly Phe
Gly His
50 Asn Lys 65 Asn lie
Pro Thr
Cys Lys
16
Leu
Gin
Leu
35
Ser
Leu
Cys
Glu
Leu
Thr
Leu
20
Lys
lie
Cys
lie
Ala 100 lie
Leu 5
Lys
Glu
Gly
lie
Asp
85
Asn
Leu
Lys
Val
Asn
Leu
Lys
70
Asp
Cys
Thr
Cys
Gly
lie
Pro
55
Leu
Asn
Gin
Leu
Leu
Gly
Ser
40
Leu
Gly
lie
lie
Val
Thr
Gly
25
Ala
Gly
Gin
Asn
Met 105 Lys
Pro
10
Leu
Thr
Ala
Gly
Thr
90
Asn
Thr
Leu
Thr
Thr
Gly
Leu
75
Leu
Ser
Gly
Thr
Val
Pro
Leu
60
Thr
Trp
Ser
Ala
Thr
Asp
Leu
45
Gly
Phe
Thr
Glu
Leu
Thr
Asp
30
Val
Thr
Asn
Gly
Ser 110 Val
Gly
15
Thr
Lys
Asn
Ser
Val
95
Asn
Thr
Gly
Asn
Thr
Glu
Asn
80
Asn
Asp
Ala
115120125PheValTyrVallieGlyValSerAsnAsnPheAsn Met LeuThrThr130135140HisArgAsnlieAsnPheThrAlaGluLeuPhePhe Asp SerThrGly145150155160AsnLeuLeuThrArgLeuSerSerLeuLysThrPro Leu AsnHisLys165170175SerGlyGinAsnMetAlaThrGlyAlalieThrAsn Ala LysGlyPhe180185190MetProSerThrThrAlaTyrProPheAsnAspAsn Ser ArgGluLys195200205GluAsnTyrlieTyrGlyThrCysTyrTyrThrAla Ser AspArgThr210215220AlaPheProlieAsplieSerValMetLeuAsnArg Arg AlalieAsn225230235240AspGluThrSerTyrCyslieArglieThrTrpSer Trp AsnThrGly245250255AspAlaProGluValGinThrSerAlaThrThrLeu Val ThrSerPro260265270PheThrPheTyrTyrlieArgGluAspAsp275280〈210>2〈211>280〈212>PRT〈213>Ad35 fiber的shaft和knob氨基酸序列〈400>2GlyValLeuThrLeuLysCysLeuThrProLeuThr Thr ThrGlyGly151015SerLeuGinLeuLysValGlyGlyGlyLeuThrVal Asp AspThrAsp202530GlyThrLeuGinGluAsnlieArgAlaThrAlaPro lie ThrLysAsn354045AsnHisSerValGluLeuSerlieGlyAsnGlyLeu Glu ThrGinAsn505560AsnLysLeuCysAlaLysLeuGlyAsnGlyLeuLys Phe AsnAsnGly65707580AsplieCyslieLysAspSerlieAsnThrLeuTrp Thr GlylieAsn859095ProProProAsnCysGinlieValGluAsnThrAsn Thr AsnAspGly
100LysLeuThr LeuValLeuVal Lys115120ValSerLeu ValGlyValSer Asp130135LysThrAla AsnlieGinLeu Arg145150LeuLeuThr GluGluSerAsp Leu165SerThrAla ThrSerGluThr Val180SerThrThr AlaTyrProPhe Asn195200TyrlieHis GlylieCysTyr Tyr210215PheProLeu AsnlieSerlie Met225230AsnValAla TyrAlalieGin Phe245SerProGlu SerAsnlieAla Thr260SerTyrlie ThrGluAspAsp Asn275280〈210>3〈211>2666〈212>DNA〈213〉含5型腺病毒tail序列和11
〈400>3tteatteagatcttettccc ttteacteat
3朋tcagttegcaaatttct gtccagttte
ctctggtettgcagcttcct cctggctgca
gtttcctcctgttcctgtcc atccgcaccc
gc朋gaccgtctgaagatec cttcaacccc
ccaactgtgccttttcttec tcctcccttt
cctggagttcttecttteaa atgttteacc
ctea朋gtggg郷ggg3Ct t織gtgg3t
agtgccaccacaccactcgt teagactggt
ttggg雄g3atg朋朋tea actttgtetc
gcattgatga c朋tetteac105 110
Asn Gly Gly Leu Val Asn Gly Tyr 125
Thr Val Asn Gin Met Phe Thr Gin 140
Leu Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Asn 155 160 Lys lie Pro Leu Lys Asn Lys Ser
170 175 Ala Ser Ser Lys Ala Phe Met Pro 185 190 Thr Thr Thr Arg Asp Ser Glu Asn 205
Met Thr Ser Tyr Asp Arg Ser Leu 220
Leu Asn Ser Arg Met lie Ser Ser 235 240 Glu Trp Asn Leu Asn Ala Ser Glu
250 255 Leu Thr Thr Ser Pro Phe Phe Phe 265 270
型腺病毒shaft、 knob序列的嵌合序列
cacttectte60
ttcagcagcacctccttgccctcctcccag120
aactttctcctgg皿tgtca180
actetcttcatgttgttgcagatg皿gcgc240
gtgtetccataaccggtcct300
gtetcccccaatgggtttcaagagagtccc360
CC3C3ggCggatctctecag420
gacacc^cggttttttgaa■
cactcteteggttteccact郷3gCCgg3540
a^tteggac皿ggacttecattcaattca600
accttetggaC3gg3gtC皿CCCC3CCg皿660
gccaactgtc3皿tratg皿ctccagtg皿tcteatgatttcteacacte720gttea皿ctggagcactegtcactgcatttgtttetgtte teggagtetc780皿tetgcteactecac3C3g a皿tete皿ttttectgcag agctgtttttcgattctect840ggteatttecteactegactctcatccctctteatratea 3tc3ggac皿■皿catggctectggtgccattecteatgctaaaggtttca tgcccagcacgactgcctet960cctttcaatgateattcteg 3g皿皿3g皿皿ctecatttacggaacttg ttectecaca1020gctegtgatcgcactgcttttcccattgacatetctgtc3 tgctteaccg皿gagc皿te1080catcatettg tettcgtete acttggtcctgg皿C3C3gg 3g3tgCCCC31140g3ggtgC皿3cctctgctecaaccctegtcacctccccatttecctttte ctecatcaga1200g皿gacgactgagccc皿ga ate皿g皿tcgtttgtgtte tgtttcaacg tgtttetttt1260tcaattgcagaaaatttcaa gtcatttttcattcagtegtategccccaccaccacateg1320cttetecagatcaccgtecctcacagaaccctegtettcaacctgccacc1380tccctcccaaacacagtcctttctccccggctggccttea1440atcatgggtetctteggtgttetettccacacggtttcctgtcgagcc朋1500acgctcatcagtgatetteataaactccccgggC3gCtC3ctteagttcatgtcgctgtc1560cagctgctgagccacaggctgctgtccaacttgcggttgctt皿cgggcggcg朋gg卿1620agtccacgcct織tgggggtegagtcateatcgtgcatc郷ategggcggtggtgctg1680C3gC3gCgCggctgccgccgccgctccgtcctgcagg皿t3C皿C3tggC1740agtggtctccttcgcaccgcccgcagcateaggcgccttgtcctccgggc18003C3gC3gCgCaccctgatctcactteaatc3gc3C3gteactgcagcacagcaccacaat1860attgttcaaaatcccacagtgc皿ggcgctgtetcca皿gctcatggcgggg3CC3C3g31920acccacgtggccatcatecc3C皿gCgC3ggtegatteagtggcgacccc1980gctggacateaacattacctcttttggcatgttgtaattc3CC3CCtCCCggteccatet2040aaacctctgatte皿catggcgccatccaccaccatccte皿ccagctggccaaaacctg2100cccgccggctatecactgcaggg雄cgggtg織gtggag3gCCC3gg32160ctcgteaccatggatcatcatgctcgtcatgatetc皿tgttggcacaac3C3ggC3C3C2220gtgcatecacttcctcaggattecaagctcctcccgcgtt3g皿ccatetCCC3ggg皿C2280aacccattcctg皿tcagcgtaaatcccac3CtgC3ggg3agacctcgcacgteactcac2340gttgtgcattgtca皿gtgttacattcgggC3gC3gCgg3tgatcctccagtetggtegc2400gcgggtttctg郷t卿cgatccctectgtecggagtgcgccgagac皿2460ccgagatcgtgttggtcgtegtgtcatgccccggacgtegtcatatttcc2520ccaggtgcgggCgtg3C皿3cagatctgcgtctccggtctcgccgctteg2580atcgctctgtgtegtegttgtagtetatccactctctcaa3gC3tCC3ggcgccccctgg2640cttcgggttc:aagctt2666 〈210>4 〈211>51 〈212>DNA 〈213>引物序列 〈400>4朋ttgaccgg tctcgagact agtggatccg cggccgcatc tegatteatt a
〈210>5
〈211>51
〈212>DNA
〈213>引物序列
〈400>5
agcttaatta atctagatgc ggccgcggat ccactagtct cgagaccggt c
〈210>6
〈211>1679
〈212>DNA
〈213>5型腺病毒ADP基因序列 〈220〉
〈221>misc_feature 〈222〉 (1070) . (1070) 〈223>n is a， c， g，或t 〈220〉
〈221>misc_feature 〈222〉 (1072) . (1072)
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〈212>DNA 〈213>引物序列 〈400>17 cgggatccgt cgacttatta cctagatccg gtgg 3权利要求
一种用于诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体，其特征在于该重组腺病毒的纤毛头基因为B亚群腺病毒纤毛头基因；并且该病毒基因组可操作地连接有编码诱导多能干细胞基因OCT4和SOX2的核苷酸序列的表达盒。
2. 根据权利要求l的重组腺病毒载体，其特征在于该重组腺病毒纤毛头的氨基酸序列 为人类B亚群11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列。
3. 根据权利要求l的重组腺病毒载体，其特征在于该重组腺病毒纤毛头的氨基酸序列 为人类B亚群35型腺病毒纤毛头的氨基酸序列。
4. 构建权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于通过基因工程方法用人类B亚 群11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列。
5. 根据权利要求4所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述病毒载体为选自C亚群的 2型或者5型腺病毒中的至少一种。
6. 根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述编码诱导多能干细胞基因 表达盒核苷核序列位于腺病毒载体E1区，或者位于E3区。
7. 根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于编码诱导多能干细胞基因中还 可连接有下列一个或多个基因KLF4， C-MYC， NAN0G， LIN28， Esrrb， UTF1和p53 shRNA。
8. 根据权利要求l-7任一项所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述编码诱导多能干 细胞基因来源于人。
9. 根据权利要求l-7任一项所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述编码诱导多能干 细胞基因来源于非人哺乳动物。
10. 根据权利要求9所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述编码诱导多能干细胞基 因来源于鼠。
11. 根据权利要求1-10所述的重组腺病毒载体，其特征在于控制目的基因表达盒中 编码序列的启动子选自下述启动子中的一种(a)延伸因子EF-la启动子、增强子及其突 变体序列；(b)泛素基因Ubi启动子、增强子及其突变体序列；(c)转录因子E2F启动子、增 强子及其突变体序列；(d)人巨细胞病毒启动子、增强子及其突变体序列；(f)鼠巨细胞病 毒启动子、增强子及其突变体序列。
12. 根据权利要求1-11所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述目的基因表达盒中 可操作连接的基因之间可以下列方式之一连接，使之共同受启动子调控(a)内部核糖体 进入位点(IRES)序列连接；(b) 口蹄疫病毒2A序列连接；(c)连接月太(linker)连接。
13. 根据权利要求l所述的重组腺病毒，其特征在于所述哺乳动物体细胞为人的体细胞。
14. 根据权利要求l所述的重组腺病毒，其特征在于所述哺乳动物体细胞为非人的哺乳动物体细胞。
15. 使用根据权利要求l-14所述的重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞的方法，其特征在于将所述重组腺病毒载体一次或多次感染细胞。
16. 根据权利要求1-15所述的重组腺病毒诱导多能性干细胞的方法，其特征在于可以在诱导多能性干细胞之前、同时和/或之后使用一种或多种小分子药物，小分子药物是i)组蛋白去乙酰化酶抑制剂如丙戊酸和TSA;或ii)组蛋白甲基化酶抑制剂如BIX 01294 ;或iii)DNA甲基化转移酶抑制剂如5-氮杂胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷；或iiii)Bayk8644。
17. 根据权利要求16所述的方法，其特征在于该重组腺病毒载体用于转染哺乳动物 体细胞，在转染之前、同时或之后使用维持胚胎干细胞多能性与增殖的细胞因子和小分子 药物，所述维持胚胎干细胞多能性与增殖的细胞因子和小分子药物选自LIF、 bFGF、 EGF、 SU5402、PD184352、PD0325901和CHIR99021中的至少一种。
18. 根据权利要求l所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述多能性干细胞具有多潜 能细胞的生长特性和生化特性，具体表现为细胞生长速度加快，细胞传代次数增加，细胞 表达碱性磷酸酶活性和胚胎干细胞分子标志物，细胞体外可分化为三胚层，细胞裸鼠皮下 注射可成畸胎瘤。
19. 根据权利要求l-14所述的重组腺病毒在制备用于细胞替换治疗药物中的用途和 美容美体用途。
20. 根据权利要求l-14所述的重组腺病毒在制备转基因动物或动物疾病模型中的用途。
全文摘要
本发明提供一类用于诱导多能性干细胞(iPS cell)的重组腺病毒载体及其诱导多能性干细胞的方法。该类重组腺病毒载体的特征在于该重组腺病毒载体中的纤毛头基因是B亚群腺病毒纤毛头基因，且其中同时可操作地连接有Sox2和Oct4基因表达盒。在体外感染哺乳动物特别是人的终末分化细胞或成体干细胞，异位表达OCT4和SOX2，同时在调节表观遗传的小分子药物的协同作用下高效快速的将其诱导为多能性干细胞，人多能性干细胞可用于细胞替代疗法治疗疾病，其他哺乳动物多能性干细胞可用于制备转基因动物和动物疾病模型。
文档编号C12R1/93GK101792776SQ20091004571
公开日2010年8月4日 申请日期2009年2月1日 优先权日2009年2月1日
发明者吴孟超, 周向军, 张琪, 彭新荣, 李琳芳, 钱其军 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院;深圳市北科生物科技有限公司