专利名称：编程性细胞死亡诱导剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有药学作用的含生理活性物质作为有效组分的编程性细胞死亡诱导剂和抗癌剂，有效组分源自动物、微生物或植物以有利于增进健康；涉及含有上述生理活性物质的功能性食物或饮料；并涉及生产它们的方法。
现有技术近年来，编程性细胞死亡的模式一直是有关细胞组织死亡的注意点。
与病理性细胞死亡的坏死不同，认为编程性细胞死亡是一种从开始就被整合进细胞本身基因的死亡。这样，认为决定编程性细胞死亡程序的基因在一些外源或内源性原因作为触发器发挥作用的地方被激活，在该基因的基础上生物合成一种程序性死亡基因蛋白质，并且细胞本身被所产生的程序性死亡蛋白质降解，由此引起细胞的死亡。
如果能在所需组织或细胞中表达这样的编程性细胞死亡，将有可能从活的机体中以其天然形式排除不必要的或病原性细胞，这将具有显著的意义。
近年来，编程性细胞死亡与鞘脂例如神经酰胺之间的关系引起关注并且有人报道通过软脂酸和硬脂酸发生神经酰胺的从头合成，籍此引起编程性细胞死亡[生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry),272卷，3324-3329页(1997)]。
本发明所要解决的问题尽管期望神经酰胺和游离脂肪酸被发展为编程性细胞死亡诱导剂，但是源自活的机体的其它脂溶性物质的编程性细胞死亡诱导作用却完全不明确。
本发明的目的是开发一种有编程性细胞死亡诱导作用的高度安全的源自植物、微生物或动物的提取组分，以及提供一种含有该组分的编程性细胞死亡诱导剂和抗癌剂，一种含有该组分作为组成组分的功能性食物或饮料，和生产它们的方法。
解决问题的方法本发明的发明者为达到以下的目的和结论进行了深入的调查，结果他们发现得自植物、微生物或动物的甘油脂和甘油糖脂显示了强编程性细胞死亡诱导作用和抗癌作用，并因此完成本发明。
这样，本发明的第一个方面涉及一种编程性细胞死亡诱导剂，并且其特征在于含有甘油脂和/或甘油糖脂作为有效组分。
本发明的第二个方面涉及一种抗癌剂，并且其特征在于含有甘油脂和/或甘油糖脂作为有效组分。
本发明的第三个方面涉及生产本发明第一个和第二个方面的制剂的方法，并且其特征在于在生产本发明第一个和第二个方面的制剂的方法中，包括用一种有机溶剂提取源自植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
本发明的第四个方面涉及用于诱导编程性细胞死亡的食物或饮料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀释有甘油脂和/或甘油糖脂。
本发明的第五个方面涉及抗癌食物或饮料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀释有甘油脂和/或甘油糖脂。
本发明的第六个方面涉及生产本发明第四个或第五个方面的食物或饮料的方法，其特征在于在生产本发明第四个或第五个方面的食物或饮料的方法中，包括用一种有机溶剂提取源自植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
附图的简短说明
图1显示了透析后的DEAE-Sepharose Fast Flow柱的内部溶液洗脱模式。
图2显示了级分B和纯物质的编程性细胞死亡诱导作用。
图3显示了纯物质NMR图谱。
图4显示了样品A完全离子色谱图。
图5显示了样品B完全离子色谱图。
图6显示了Sepharose LH-60柱色谱图。
图7显示了级分No.20脂质组分的完全离子色谱图。
图8显示了级分No.21脂质组分的完全离子色谱图。
图9显示了级分No.23脂质组分的完全离子色谱图。
图10显示了级分No.20糖组分的完全离子色谱图。
图11显示了级分No.21糖组分的完全离子色谱图。
图12显示了级分No.23糖组分的完全离子色谱图。
图13显示了用氯仿洗脱的级分之脂质组分的完全离子色谱图。
图14显示了用比例为80∶20的氯仿和丙酮洗脱的级分之脂质组分的完全离子色谱图。
图15显示了用氯仿洗脱的级分之糖组分的完全离子色谱图。
图16显示了用比例为80∶20的氯仿和丙酮洗脱的级分之糖组分的完全离子色谱图。
图17显示了Rf值为约0.25的斑点之脂质组分的完全离子色谱图。
图18显示了Rf值为约0.25的斑点之糖组分的完全离子色谱图。
图19显示了Rf值为约0.33的斑点之脂质组分的完全离子色谱图。
图20显示了Rf值为约0.33的斑点之糖组分的完全离子色谱图。
图21显示了Lyophyllum ulmarium乙醇提取物的脂质组分的完全离子色谱图。
图22是显示了Lyophyllum ulmarium乙醇提取物之糖组分的完全离子色谱图。
图23是显示了粉末状绿茶(matcha)乙醇提取物之脂质组分的完全离子色谱图。
图24是显示了粉末状绿茶乙醇提取物之糖组分的完全离子色谱图。
图25是显示了米糠75％乙醇提取物之脂质组分的完全离子色谱图。
图26是显示了米糠75％乙醇提取物之糖组分的完全离子色谱图。
进行本发明的模式本发明将如下文特别说明。
对于本发明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂无特殊限制，并且它们/它可从植物、微生物或动物中生产或化学合成。
可在本发明中使用的植物、微生物或动物无特殊限制，只要它们其中含有甘油脂和/或甘油糖脂。植物的实例有蔬菜例如菠菜、胡萝卜和洋葱；双子叶植物例如茶；单子叶植物例如大麦和水稻；调味品例如胡椒、肉桂蔻、大蒜、月桂叶、芹菜、芥末、姜、红胡椒、百里香、藏红花、桂皮、香草、allspice、日本芥末、西洋菜、日本胡椒、牛排植物、草药、八角茴香、罗勒、日本韭菜、蛇麻草和日本辣根；从例如谷物的那些植物的残留物中加工出来的产物；藻类例如棕色海藻(褐藻类)、红色海藻(红藻类)、绿色海藻(绿藻类)和单细胞绿色海藻；微生物例如蘑菇、酵母、丝状真菌(例如曲霉属)和细菌(例如纳豆芽孢杆菌和乳酸菌)；以及动物例如脊椎动物和无脊椎动物。
本发明说明书中使用的术语“茶”可以是通常称为茶的任何物质并且它的实例有未发酵的茶例如绿茶、煎茶(中级绿茶)、粗茶(低级茶)、焙粗茶(烘焙茶)、粉末状绿茶；半发酵茶例如paipao茶、乌龙茶和泡冲茶(paochong tea)；以及后发酵茶例如普洱茶。除它们以外，术语“茶”包括冬青茶、kuko(中国婚姻藤)茶、adley茶和大麦茶。
对于本发明使用的蘑菇无特殊限制尽管优先选择通常食用的蘑菇并且实例有担子菌(Basidiomysetes)例如Lyophyllum ulmarium，荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)，香茹(Lentinus edodes),Tricholowa matsutake,Lyophyllum shimeji,Flammulina velutipes，光帽磷伞(Pholiota nameko),Gyrophora esculenta，木耳(Auricularia auricula)，纯黄竹荪(Dictyophoraindusiata)，亚砖红沿丝伞(Naematoloma sublateritium),Boletopsisleucomelas,Sarcodon aspratus，红根须腹菌(Rhizopogon rubescens),Amanita hemibapha，多汁乳茹(Lactarius volemus)，假蜜环菌(Armillariamellea)，红汁乳茹(Lactarius hatsudake)，糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus),Grifola frondosa，洁丽香茹(Lentinus lepideus)和普通蘑菇(Agaricusbisporus或诸如此类)；以及子囊菌(Ascomycetes)例如tochukaso(无性黄蜂或植物蠕虫)。
对于本说明书中使用的藻类无特殊限制，其实例有棕色海藻例如囊藻(Colpomenia sinuosa)，海蕴(Nemacystus decipiens以及索藻科(Chordariaceae)中的其它种类)，海带(Laminaria japonica),Kjellmaniellacrassifolia，裙带菜(Undaria pinnatifida),Eisenia pinnatifida和Hizikiafusiforme；红色海藻例如石花菜(Gelidium)和三叉仙菜(Ceramiumkondoi)；绿色海藻例如孔石莼(Ulva pertusa),Prasiola japonica和刺松藻(Codium fragile)；以及单细胞绿色海藻例如Chlorella。
对于本发明中使用的谷物残留物无特殊限制，并且其实例有米糠、麦糠、大麦根和豆腐的渣滓(okara)。
在本发明中优选从那些茶、蘑菇、藻类或谷物残留物中制备的甘油脂和或甘油糖脂，并用作编程性细胞死亡诱导剂、抗癌剂或功能性食物或饮料有效组分。
对于本发明中使用的有编程性细胞死亡诱导作用的甘油脂和甘油糖脂无特殊限制，并且可应用的甘油脂实例有单、双和三脂酰甘油，而可应用的甘油糖脂的实例有在疏水性基序带有甘油的糖脂，例如以单脂酰基团、双脂酰基团、烷脂酰基团、双烷脂酰基团、链烯脂酰基团或二联植烷酯等的基团作为疏水基团的甘油糖脂。这样，单半乳糖二脂酰基甘油、单葡萄糖二脂酰基甘油、双半乳糖二脂酰基甘油、双葡萄糖二脂酰基甘油、双甘露糖二脂酰基甘油、三葡萄糖二脂酰基甘油、四葡萄糖二脂酰基甘油、多聚葡萄糖二脂酰基甘油或诸如此类的物质可用作中性甘油糖脂，而cenolipid、磺基异鼠李糖二脂酰基甘油酯、gluculonosyl二脂酰基甘油、葡糖基二磷脂酰甘油、磷脂酰葡糖基二脂酰基甘油、甘油磷酰二葡糖基三脂酰基甘油、脂磷壁酸或诸如此类物质可用作酸性甘油糖脂。
组成本发明中使用的甘油脂和甘油糖脂的脂肪酸的实例有饱和和/或不饱和脂肪酸例如十四烷酸(肉豆蔻酸，C14:0)、十六烷酸(棕榈酸，C16:0)、十四碳烯酸(肉豆蔻脑酸，C14:1)、十六碳烯酸(棕榈油酸，C16:1)、十八碳烯酸(油酸，C18:1)、顺-9，顺-12-十八碳二烯酸(亚油酸，C18:2)和9,12,15-十八碳三烯酸(亚麻酸，C18:3)，而组成性的糖的实例有岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露醇和肌醇。另外，甘油糖脂包括甘油脂与糖和/或蛋白质等等的复合物。
通过其中包括一个用有机溶剂例如含水的亲水性有机溶剂(例如，乙醇水溶液)提取步骤的方法，可以很容易地生产出本发明中使用的有编程性细胞死亡诱导作用的源自植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂。但对于该甘油脂和/或甘油糖脂的生产方法并无特殊限制。这样，不但可以使用仅仅用水的提取法，还可以使用可用于纯化该甘油脂和/或甘油糖脂的已知的方法。对含有源自植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的物质进行化学、物理或酶处理，然后纯化目标甘油脂和/或甘油糖脂也是可能的。对于纯化，甘油脂和/或甘油糖脂的物理化学特性或生理学活性(编程性细胞死亡诱导作用和抗癌作用等等)可用作纯化的指标。
在本发明中，源自植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂经有机溶剂例如己烷、氯仿、乙酸乙酯、亲水性有机溶剂(例如，丙酮、丙醇、乙醇和甲醇)提取，产物与水的混合物或混合溶剂和含有甘油脂和/或甘油糖脂的可食性物质可通过包括一个，例如，用乙醇水溶液提取步骤的生产方法很容易地生产。当被用作食物或饮料时，提取优选在以下条件下进行，其中一种有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂例如10-95％或优选20-80％乙醇水溶液通常在10～70℃或优选在20～60℃使用几分钟到几天，或优选几十分钟到几十小时，这样可有效地提取是编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂。在用有机溶剂或尤其用亲水性有机溶剂提取前用酸或碱处理源自植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂，可能更有效地提取是编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂。
关于本发明中使用的收集纯净甘油脂和/或甘油糖脂的方法，可使用有些已知的方法例如Bligh-Dyer法和Folch分配法(参看“新生化实验教科书”(New textbook on Experiments of Biochemistry)，卷4，脂质Ⅲ,104-109页，1990，日本生物化学协会(Japan Biochemical Society)编辑，Tokyo Kagaku Dojin出版)以及与目的相适合的它们中的任何方法以提取本发明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂。
在本发明使用的甘油脂和/或甘油糖脂的纯化中，使用疏水性载体、反相载体、正相(normal phase)载体等等对上面提到的提取物进行层析，由此能进行更有效地分离。
对于疏水性载体无特殊限制，任意一种已知载体均有可能被用到。这样的载体的实例有其中引入丁基、辛基或苯基的Sephacryl型、Sepharose型、Toyopearl型树脂等等以及Amberlite吸附树脂XAD-1、-2、-4、-200、-7或-8。对于反相载体无特殊限制，可使用已知载体的任意一种，并且这样的载体的一个实例为其中有共价连接烷基链的硅胶。对于正相载体无特殊限制，可使用已知载体的任意一种并且该载体的一个实例为硅胶。在进行纯化中，可使用甘油脂和/或甘油糖脂的物理和化学特性或生理学活性例如编程性细胞死亡诱导作用和抗癌作用作为指标。
本发明中使用的源自植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂，可以例如，通过传统离子交换处理、疏水性层析处理、凝胶过滤处理等的方法从可食性植物、可食性微生物、可食性动物等等的乙醇水溶液提取物中纯化出来。
通常，在很多情形中植物、微生物或动物中的甘油脂和/或甘油糖脂以与膜附近的糖或蛋白质结合的高分子物质的形式存在，并且例如一经用热水提取，能够得到其中甘油脂和/或甘油糖脂与糖和/或蛋白质结合的含甘油脂和/或甘油糖脂的物质。另外，术语糖意为一种存在于植物、微生物或动物中的糖，它包括单糖、寡聚糖、多聚糖和糖偶联物。
在本发明中，可使用所制备的这样的含甘油脂和/或甘油糖脂的高分子物质，因为尽管这是根据使用目的，经酶、化学和或物理处理糖和/或蛋白质以纯化和收集甘油脂和/或甘油糖脂，由此得到更加纯化状态的甘油脂和/或甘油糖脂还是可能的。
通过上述方法得到的并在本发明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂是来自天然的高度安全的物质，并且作为食物和/或饮料特别有用。
当所得到的甘油脂和/或甘油糖脂与识别靶细胞的配体例如单克隆抗体结合时，可在任何靶细胞中特异地引起编程性细胞死亡。另外，当靶细胞是癌细胞时，可得到作为在目的癌细胞中引起编程性细胞死亡结果的抗癌作用。再者，当本发明的化合物与载体例如白蛋白质结合时，能提供有更高吸收特性的物质。
本发明的编程性细胞死亡诱导剂可通过将例如源自植物、微生物或动物的是有效组分的那些甘油脂和/或甘油糖脂与已知的药学载体结合而被制成药学制剂。一般地，本发明的编程性细胞死亡诱导化合物例如甘油脂和/或甘油糖脂与药学上可接受的液体或固体载体形成化合物，如果需要，之后加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等等，由此能制备固体制剂例如片剂、粒剂、稀释粉剂、粉末制剂和胶囊以及液体制剂例如标准液体制剂、悬浮液和乳浊液。或者，化合物可被制成干燥制剂，在实际使用前加入合适的载体将其转变为液体。
本发明的编程性细胞死亡诱导剂可通过任何口服试剂和非肠道试剂例如注射和滴注试剂的方式来给予。
可以根据上述剂量形式和制剂形式选择药学载体。在口服试剂的情况下，可以使用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等等。在制备口服试剂中，结合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、促流动剂、矫味剂、着色剂、香料等等可以与其形成化合物。
另一方面在非肠道试剂的情况下，将源自例如植物、微生物或动物是本发明中有效组分有编程性细胞死亡诱导作用的甘油脂和/或甘油糖脂溶于或悬浮在稀释剂中，例如用于注射的蒸馏水、生理盐水溶液、葡萄糖水溶液、用于注射的植物油、蓖麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇和如果需要，再向其中加入杀菌剂、稳定剂、等渗剂、麻醉剂等等。
可以根据制剂形式通过合适给药途径给予本发明的编程性细胞死亡诱导剂。对于给药方法也无特殊限制，并且可以应用任何内部和外部给药和注射。注射制剂例如可以通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射等等给予。外部制剂包括栓剂以及诸如此类的制剂。
虽然根据制剂形式、给药方法和给药目的以及给予诱导剂的病人之年龄、体重和症状，可以合适地确定本发明编程性细胞死亡诱导剂的剂量，但此剂量并未确定，尽管通常情况下制剂中含有的有效组分的量对于成人来说为每天0.1-200mg/kg。不言而喻，根据不同条件剂量也不同，并且因此在一些情况下，少于上面范围的剂量可能就足够了，而在另一些情况下，可能需要多于上面范围的剂量。本发明的药学试剂不仅通过口服给予，还可通过将其加入到任何食物或饮料中每天摄食。
本发明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂有抑制癌细胞生长的活性。本发明中使用的用于抑制癌细胞生长的甘油脂和/或甘油糖脂的作用机制丝毫也没有限制本发明，并且例如，本发明也包括对癌细胞的编程性细胞死亡诱导剂。
有抗癌作用的甘油脂和/或甘油糖脂，例如，源自例如植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂被用作有效组分，并且通过与已知药学载体形成化合物被制成药学制剂，由此能够制备抗癌剂。依据上述方法可以进行抗癌剂的生产。一般来说，甘油脂和/或甘油糖脂与药学上可接受的液体或固体载体形成化合物之后，如果需要，在其中加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等等，由此可制备固体制剂例如片剂、粒剂、稀释粉剂、粉末制剂和胶囊，以及液体制剂例如标准液体制剂、悬浮液和乳浊液。或者，也可将化合物制成干燥制剂，通过在实际使用前加入合适载体可被转化成液体。
可以通过任何口服和非肠道试剂例如注射和滴注试剂给予抗癌剂。
可以根据上面提到的剂量形式和制剂形式选择药学载体，并且此药学载体可以依据编程性细胞死亡诱导剂在上面提到的情况下使用。
依据制剂形式通过合适的给药途径可以给予本发明的抗癌剂。对给药方法也无特殊限制，可以应用任何内部和外部给药方法以及注射。注射制剂可以，例如，通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射等等给予。外部制剂包括栓剂以及诸如此类的制剂。
虽然根据制剂形式、给药方法和给药目的以及给予诱导剂的病人之年龄、体重和症状，可以合适地确定本发明抗癌剂的剂量，但此剂量并未确定，尽管通常情况下制剂中含有的有效组分的量对于成人来说为每天0.1-200mg/kg。不言而喻，根据不同条件剂量也不同，并且因此在一些情况下，少于上面范围的剂量可能就足够了，而在另一些情况下，可能需要多于上面范围的剂量。本发明的药学试剂不仅通过口服给予还可通过将其加入到任何食物或饮料中每天摄食。
本发明的药学试剂能用作癌症疾病等的治疗剂。另外，在研究生物防御的机制、免疫功能或与疾病例如癌症的关系以及在开发编程性细胞死亡诱导的抑制剂中，由本发明编程性细胞死亡诱导剂提供的编程性细胞死亡诱导方法是有用的。特别是，从作为食物有很长历史的植物、微生物或动物中制备的是编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂在口服给药时高度安全。另外，其中含有、向其中加入和/或在其中稀释有例如源自植物、微生物或动物的本发明的甘油脂和/或甘油糖脂的那种或那些食物或饮料，具有天然的高度安全性，并且因为其编程性细胞死亡诱导作用和因编程性细胞死亡诱导作用产生的抗癌作用，其对于改善症状和阻止胃肠道癌症等等是相当有用的。
对于本发明的食物或饮料无特殊限制，其实例有加工过的农业/林业产品、加工过的家畜产品、加工过的渔业产品等等，包括加工过的谷物产品例如加工过的麦产品、加工过的淀粉产品、加工过的预混合产品、面条、通心面、面包、豆腐、日本荞麦面条(soba)、日本麦麸面包(fu)、中国豆胶冻棒(bifun)、日本豆胶冻棒(harusame)、和压缩米糕；加工过的脂肪/油产品例如成形脂肪/油、用于深炸食物的油、色拉油、蛋黄酱和调味品；加工过的大豆产品例如豆腐、发酵的豆腐(miso)和发酵的大豆(natto)；加工过的肉产品例如火腿、腌肉、压缩火腿(press ham)和香肠；渔业产品例如冷冻底栖鱼类鱼肉(surimi)、熟鱼酱(kamaboko)、烧成竹样形状的熟鱼酱(chikuwa)、轻鱼饼(hampen)、炸鱼丸(satsumaage)、有一些组分的熟鱼酱(tsumire)、鱼产品(suji)、鱼肉火腿、香肠、炸狐鲣(katsuobushi)、加工过的鱼卵产品、罐头鱼产品和在大豆沙司中煮浓的贮藏鱼产品(tsukudani)；奶产品例如牛奶、奶油、酸奶、黄油、奶酪、浓缩牛奶、干奶粉和冰淇淋；加工过的蔬菜/水果产品例如糊状物、果酱、泡菜、水果饮料、蔬菜饮料和混合饮料；甜食例如巧克力、饼干、小面包、蛋糕、米球蛋糕和米饼；酒精饮料例如日本米酒(sake)、中国葡萄酒、葡萄酒、威士忌、日本蒸馏酒(shochu)、伏特加酒、白兰地、杜松子酒、ram、啤酒、软酒精饮料、果酒和烈性酒；餐桌奢侈品例如绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、软饮料和乳酸饮料；调味品例如大豆酱、Worcester酱、醋和mirin；香料例如大蒜的提取物、胡椒、红胡椒、肉豆蔻、姜、八角茴香、草药和罗勒；罐装、瓶装或袋装食物例如配有调味牛肉的熟米、装在小壶样容器内的熟米(kamameshi)、和红豆一起煮的米(sekihan)、咖喱和米饭以及其它已加工的食物；半炸或浓缩食物例如肝酱和其它涂抹食品的酱、soba和udon的汤(两者都是日本面条)和浓缩汤；脱水食物例如速食面、速食咖喱、速溶咖啡、粉状果汁、粉状汤、速食miso汤、干馏食物、干馏饮料和干馏汤；冷冻食物例如sukiyaki、chawan-mushi(在锅中煮的杂烩)、烤鳗鱼(unagikabayaki)、汉堡牛排、烧卖(中国蒸饺)、饺子(塞满碎猪肉等的煎饺)、各种烈酒和水果鸡尾酒；固体食物；液体食品例如汤以及香料。
对于生产本发明的食物或饮料的方法无特殊限制，并且其实例有烹调、加工和通常使用的生产食物或饮料的方法，可以使用任何方法以生产含有是编程性细胞死亡诱导化合物的源自例如植物、微生物和动物的那些甘油脂和/或甘油糖脂的食物或饮料。
关于烹调和加工，在上述的烹调或加工后的产品会含有具备编程性细胞死亡诱导特性的甘油脂和/或甘油糖脂。
这样，可在烹调或加工前、加工期间或加工后加入有编程性细胞死亡诱导特性的甘油脂和/或甘油糖脂。或者，因此可将烹调或加工的产品或原材料加入含有甘油脂和/或甘油糖脂的物质中使该甘油脂和/或甘油糖脂被稀释。
在食物或饮料的生产中，可在任何步骤加入有编程性细胞死亡诱导作用的甘油脂和/或甘油糖脂。关于加入方法，可加入甘油脂和/或甘油糖脂或因此可将食物、饮料或材料加入该甘油脂和/或甘油糖脂中使甘油脂和/或甘油糖脂被稀释。可以进行或者一次或者几次加入。相应地，能很容易地生产有编程性细胞死亡诱导作用的食物或饮料。当应用任意一个那些步骤时，含有具备编程性细胞死亡诱导特性的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或饮料，或者往其中加入或在其中稀释有本发明的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或饮料被定义为本发明的食物或饮料。
对于在食物中有编程性细胞死亡诱导作用的本发明的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或动物的是本发明的编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂)的量无特殊限制，但此量可依器官感觉和生理学活性合适地选择。例如，上述甘油脂和/或甘油糖脂的量不少于10-9份每100份食物，并且就作为食物产生的器官感觉和生理学作用而言，优选从10-8份到5份，更优选从10-7份到2份。
对于在饮料中本发明的有编程性细胞死亡诱导作用的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或动物的是本发明的编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂)的量无特殊限制，但此量可依器官感觉和生理学活性合适地选择。例如，上述甘油脂和/或甘油糖脂的量不少于10-9份每100份饮料，并且就作为食物产生的器官感觉和生理学作用而言，优选从10-8份到5份，更优选从10-7份到2份。另外，在本说明书中，术语“份”代表按照重量的份。
对于其中含有、往其中加入和/或在其中稀释有具备编程性细胞死亡诱导特性的本发明的甘油脂和/或甘油糖脂之本发明的食物或饮料的形状无特殊限制，但可包括能被口服，例如片剂、粒剂、胶囊、凝胶和溶胶的任何形状。
本发明的食物或饮料含有大量的有生理学活性的、是本发明的编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂，并且因为该甘油脂和/或甘油糖脂编程性细胞死亡诱导作用，其是有阻止癌发生作用和抑癌效应的健康食物或饮料，并且尤其是对维持胃和肠道良好健康有用的食物或饮料。
其中含有、往其中加入和/或在其中稀释有本发明的甘油脂和/或甘油糖脂的例如源自植物、微生物或动物的那个/那些抗癌食物或抗癌饮料，可根据上述生产编程性细胞死亡诱导食物或编程性细胞死亡诱导饮料的方法使用抗癌活性作为指标进行生产。
是本发明编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂源自植物、微生物或动物，特别是源自可食性植物、微生物或动物到食物或饮料的此甘油脂和/或甘油糖脂的使用是相当安全的，此种情况该编程性细胞死亡诱导化合物在实现生理学功能的浓度下对动物无毒。
可食性植物、微生物或动物中本发明的甘油脂和/或甘油糖脂作为食物有很长的历史，并且由此根据本发明制备的含有甘油脂和/或甘油糖脂的物质在口服给予时有相当高的安全性。相应地，很自然地，其中含有、往其中加入和/或在其中稀释有本发明的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或饮料具有高度安全性，并且由于其编程性细胞死亡诱导作用，对于肠胃道癌症等的预防和治疗是非常有用的。
如上所述，现在已澄清根据本发明的甘油脂和/或甘油糖脂是在活体内可获得的脂类，具有编程性细胞死亡诱导活性和抗癌活性。
在本发明中应用的是编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂在植物、微生物或动物的膜部分大量存在，并且特别地，它们/它能以低成本和简便的方法从可食的植物或微生物中生产。另外，作为编程性细胞死亡诱导目的之化合物的甘油脂和/或甘油糖脂，可以根据其疏水程度选择一种合适的溶剂而选择性地纯化。
本发明中应用的是编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或动物的)能够容易地将其编程性细胞死亡诱导作用和抗癌作用传递给食物或饮料，并且具有编程性细胞死亡诱导特性和抗癌特性的本发明的甘油脂和/或甘油糖脂作为食物或饮料的填加剂也是相当有用的。
实施例在此将更为特别地以下面的实施例对本发明加以说明，然而本发明并不受这些实施例的限制。另外，这些实施例中的符号％意为重量百分比。实施例1源于海草(Seaweed)的具有编程性细胞死亡诱导作用的组合物的制备。
(1)将Kjellmaniella crassifolia充分干燥并将20kg干燥产物在自由式磨碎机(free grinder)(由Nara Kikai Seisakusho制造)中磨碎；二水氯化钙(由Nippon Soda生产)(7.3kg)溶于900ml自来水，然后与20kg磨碎的Kjellmaniella crassifolia混合，向该液体中吹入蒸汽40分钟使温度从12℃升高到90℃，并保持在90-95℃搅拌1小时，降温得到1,100升冷却产物。
之后对冷却的溶液使用固-液分离器(型号CNA；由WestfalierSeparator生产)进行固-液分离，在固-液分离后约有900升上清液制备出来。
固-液分离后的上清液(360升)用FE10-FC-FUS0382(分离分子量30,000)(由Daicel生产)浓缩至20升。之后将20升自来水加于其中，再使混合物浓缩至20升，重复此步骤5次以除盐，籍此从Kiellmaniellacrassifolia中得到25升提取物。
冷冻干燥一升上述溶液得到13g干燥产物。
(2)在实施例1-(1)中提到的提取物(1.4升)用含0.2M CaCl2的20mM醋酸缓冲液(pH6)透析，获得经过透析的内部液体。DEAE-Sepharose Fast Flow柱(14cm直径×45.5cm高)用同样的缓冲液平衡，将透析后的内部液体上柱，用同一缓冲液冲洗并用上述的包含2M NaCl的缓冲液以浓度梯度的方式洗脱。总糖量和糖醛酸量用苯酚硫酸方法和咔唑-硫酸方法检测，并依洗脱顺序得出级分A、B和C。这些级分用蒸馏水透析并冷冻干燥，得到760mg级分B。
级分B显示出编程性细胞死亡诱导活性。
图1显示了提取物从DEAE-Sepharose Fast Flow柱中洗脱的模式。这样，图1是显示了源自海藻的提取物从DEAE-Sepharose Fast Flow柱(直径14cm×高45.5cm)中洗脱的模式图，其中纵坐标显示了咔唑硫酸法在530nm的和苯酚硫酸法在480 nm的吸收以及电导率(mS/cm)，而横坐标显示了级分序号。在图中，空圈是苯酚硫酸法在480nm的吸收，黑点是咔唑硫酸法在530nm的吸收，实线是电导率。另外，对于一个级分来说液体的量是1,000ml。
(3)将通过上面的方法得到的级分B(8.6g)上样到用1M NaCl平衡(其中NaCl的终浓度调节到1M)的苯基-Sepharose 6 Fast Flow柱。用1M NaCl冲洗该柱，并通过对水的浓度梯度法洗脱得到级分。通过旋转蒸发仪法将其浓缩，并且用蒸馏水透析得到约6.5ml纯净级分。冻干此纯净级分得到60mg纯净产物。此纯净产物显示出编程性细胞死亡诱导活性。
(4)纯净产物编程性细胞死亡诱导作用的测定以如下方法测定上述级分B和实施例1-(3)中提及的纯净产物的编程性细胞死亡诱导活性。这样，将级分B或上述纯净产物的0.5ml水溶液加到在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养的2.5×105细胞/4.5mlHL-60(ATCC CL-240)中，并在37℃孵育48小时。同时，加入蒸馏水和已知有编程性细胞死亡诱导活性的放线菌素D溶液制备对照样品。在显微镜下肉眼观察编程性细胞死亡体的形成、细胞的皱缩和核的聚集，由此对活细胞计数。观察到这样的现象并确认活细胞数减少时，可确定编程性细胞死亡诱导活性为阳性。
在加入级分B、纯化产物或放线菌素D的情况下证实编程性细胞死亡诱导活性。图2中给出了结果。这样，图2显示了当以终浓度分别为2mg/ml或0.9mg/ml的限度将级分B或纯净产物加入到上述HL-60细胞培养基中时，孵育时间和培养基中活细胞数之间关系图。横坐标是孵育时间(小时)，而纵坐标是培养基中活细胞数(×105/5ml)。图中空方形是加水的对照，空菱形是加级分B的情况，空圈是加纯净产物的情况。
(5)有编程性细胞死亡诱导作用的纯净产物的物理和化学特性测定上面实施例1-(3)中提及的纯净产物的物理和化学特性。
(ⅰ)NMR分析使用JNM-A500核磁共振设备(Nippon Denshi生产)测定1H-NMR。
图3表示的1H-NMR图谱显示了结果。图3中，纵坐标显示了信号强度，横坐标显示了化学位移值(ppm)。另外，1H-NMR中的化学位移值以定义HOD的化学位移值为4.65ppm来表达。
1H-NMR(D2O)δ0.7(脂肪酸末端甲基的H),1.1(脂肪酸的亚甲基和岩藻糖C-5位甲基的H),3.1-5.6(源自糖的H)(ⅱ)GC-MS分析将HCl的5％甲醇溶液(1ml)加到实施例1-(3)提及的纯净产物2mg中，并且将得到的混合物封在试管中，在85℃加热3小时。冷却后，用1ml正己烷将其提取三次，并在氮蒸气下将正己烷提取得到的提取物浓缩到约500μl，得到样品A。
通过向残余的甲醇层中加入碳酸银将其中和并过滤，向滤液吹氮蒸气以将其蒸发至干燥，再用真空泵干燥残渣4小时。干燥后，将5滴TMS试剂(按如下制备即，将2.6ml六甲基二硅氮烷加到2.0ml干燥吡啶中，然后在其中加入1.6ml三甲基氯硅烷，通过离心除去得到的浑浊物质，将由此得到的上清液用作试剂)加到残渣中，并在室温将得到的混合物静置30分钟。之后在50℃加热该混合物10分钟，冷却并加1ml氯仿后搅拌，再用1ml水冲洗氯仿层三次。得到的氯仿溶液用作样品B。
使用DX-302质谱仪(Nippon Denshi生产)在以下面的条件对上述制备的样品A和B进行GC-MS分析。柱TC-1(G.L.Science),30m×0.25mm内直径温度以每分钟4℃的速度从130℃升到250℃，并在250℃保持5分钟流动速率每分钟1.2ml氦气质谱测定的质量范围m/z 50-500质谱测定的重复时间3秒柱TC-1(G.L.Science),30m×0.25mm内直径温度以每分钟4℃的速度从130℃升到300℃，并在300℃保持5分钟流动速率每分钟1.2ml氦气质谱测定的质量范围m/z50-800质谱测定的重复时间3秒结果是样品A和B分别呈现出如图4和图5中显示的完全离子色谱图。每个图中纵坐标是相对强度(％)，而横坐标的上半部和下半部分别是保留时间(分钟)和扫描序号。
通过对质谱图每个峰的分析来证实色谱图中得自样品A和B的峰。
十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲基酯(峰2)、十六烷酸(棕榈酸)的甲基酯(峰3)和十四碳烯酸的甲基酯(峰1)被证实为得自样品A的主要组分。
从样品B中证实了源自甘油的峰(峰1)、源自岩藻糖的峰(峰2、3和4)、源自木糖的峰(峰5和6)、源自甘露糖的峰(峰7)、源自半乳糖的峰(峰8、9和10)以及源自葡糖醛酸的峰(峰11)。
相应地，发现上述纯净产物含有甘油脂和/或甘油糖脂。实施例2(1)将干燥过的Kjellmaniella crassifolia的磨碎产物悬浮在20升80％乙醇中，在25℃搅拌3小时，过滤以除去可溶性物质。将得到的残渣悬浮在20升含有1.5单位含内硫酸化岩藻糖的多糖(参考WO97/26896)、10％乙醇、100mM氯化钠和50mM氯化钙的缓冲液(pH8.2)中，在25℃搅拌24小时。然后将此搅拌过的溶液过滤，用含50mM氯化钠的10％乙醇冲洗。将冲洗过的残渣悬浮在40升含4g藻酸裂合酶(Nagase Seikagaku Kogyo生产)、100mM磷酸二氢钠、100mM氯化钠和10％乙醇的缓冲液(pH6.6)中，并在25℃搅拌96小时。溶液离心，所得上清液用装备有排阻分子量为100,000的中空纤维的超滤器浓缩，并将其用含100mM氯化钠的10％乙醇取代。在此溶液中加相同体积的0.4M乙酸钙溶液，将混合物搅拌30分钟并离心，在相同的上述条件下将得到的上清液超滤，用100mM氯化钠取代。在此溶液中加氯化钠使其浓度为1M并将pH调节到8，于是得到源自Kjellmaniella crassifolia的1.4升提取物。
用2.9升苯基纤维素精细柱(Phenylcellulofine柱)(Seikagaku Kogyo生产)处理提取物并用6升1M氯化钠、6升水和8升乙醇依次洗脱。
通过实施例1-(4)中提到的方法测定每个洗脱级分的编程性细胞死亡诱导作用，在乙醇洗脱下来的级分中注意到编程性细胞死亡诱导作用和对癌细胞的抑制作用。
浓缩乙醇洗脱的级分并将其蒸发至干燥，将残渣溶解在乙醇中以得到175ml溶液，其中的58ml用预先经乙醇平衡的1,130ml SepharoseLH-60柱(Pharmacia生产)处理，用乙醇洗脱该柱并以每60ml为一份收集洗脱液。
图6给出了洗脱模式。这样，图6显示了Sepharose LH-60柱层析结果图，其中纵坐标是在230nm的吸光度，横坐标是级分序号。
通过实施例1-(4)中提及的方法测定洗脱级分的编程性细胞死亡诱导活性，于是发现级分序号为8-15和27-49的级分无活性，而级分号为16-21和22-26的级分显示了编程性细胞死亡诱导作用和抑制癌细胞生长的作用。
在显示有活性的那些级分中，通过实施例1中提及的方法对三个级分(级分号20、21和23)进行成分分析。
图7、8、9、10、11和12显示了级分号20、21和23中的每一个的脂质组分或糖组分的完全离子色谱图。这样，图7、8和9显示了级分号20、21和23中的每一个的脂质组分的完全离子色谱，而图10、11和12是显示了级分号20、21和23中的每一个的糖组分的完全离子色谱。在每个图中，纵坐标是相对强度(％)，而横坐标的上半部和下半部分别是保留时间(分钟)和扫描序号。
图7和10中显示了十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(图7中峰1)、十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图7中峰3)、十六碳烯酸的甲酯峰(图7中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图7中峰4)，从级分号为20的级分中检测出源自甘油的峰(图10中峰1)和源自半乳糖的峰(图10中峰2、3和4)。图8和11中显示了十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(图8中峰1)、十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图8中峰3)、十六碳烯酸的甲酯峰(图8中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图8中峰4)，从级分号为21的级分中检测出源自甘油的峰(图11中峰1)和源自半乳糖的峰(图11中峰2、3和4)。
图9和12中显示了十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图9中峰1)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图9中峰2)，从级分号为23的级分中检测出源自甘油的峰(图12中峰1)和源自半乳糖的峰(图12中峰2、3和4)。
这样，证实了上述级分含有甘油脂和/或甘油糖脂，并且阐明了甘油脂和/或甘油糖脂有编程性细胞死亡诱导活性和抑制癌细胞生长的活性。
(2)收集从如实施例2-(1)中提到的Sepharose LH-60柱洗脱下来的级分号为16-26的级分，浓缩并蒸发至干燥，干燥残渣在氯仿中溶解，溶液上样至用200ml latrobeads 6RS-8060(Iatron生产)填充的预先经氯仿平衡的柱，用氯仿洗脱，然后相继用以80∶20、60∶40、40∶60和20∶80的比例混合的氯仿丙酮混合液连续洗脱。结果确定，用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脱的级分表现出强编程性细胞死亡诱导活性。
确定了编程性细胞死亡诱导活性的级分以实施例1中提到的方法进行组分分析。
图13、14、15和16显示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脱的每一级分的脂质和糖组分的完全离子色谱。这样，图13和14显示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脱的每一级分的脂质组分的完全离子色谱，图15和16显示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脱的每一级分的糖组分的完全离子色谱。在每个图中，纵坐标是相对强度(％)，横坐标的上半部和下半部分别是保留时间(分钟)和扫描序号。
图13和15中显示从用氯仿洗脱的级分中检测出了一个十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图13中峰1)和一个源自甘油的峰(图15中峰1)，而在图14和16中显示，从用80∶20的氯仿丙酮的混合液洗脱的级分中检测出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(图14中峰1)和十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图14中峰2)和一个源自甘油的峰(图16中峰1)。
如此，确证了上述这些级分包含甘油脂，并且证实了甘油脂具有编程性细胞死亡诱导活性和抑制癌细胞生长的活性。实施例3(1)在230ml源自如实施例1-(1)中提到的Kjellmaniellacrassifolia的40倍浓缩提取物中加入水达到910ml，之后向其中加入490ml乙醇并将混合物搅拌两小时，离心以制备溶解于35％乙醇的物质。这一35％乙醇溶解物质经浓缩并蒸发至干燥，加入100ml水，之后加入400ml氯仿和甲醇的2∶1混合物，得到的混合物充分搅拌，并将由此分离出的上清液回收。蒸发下层有机溶剂相，并向其中加入水至100ml，将此操作重复三次。得到的上层溶液经浓缩并蒸发至干燥，向其中加入10ml氯仿得到可溶于氯仿的物质。这一氯仿溶解物质经浓缩，上样至一个填有200mlIatrobeads 6RS-8060(由Iatron生产)的预先用氯仿平衡的柱，该柱用氯仿洗脱，之后相继用以90∶10、70∶30、40∶60和20∶80的比例混合的氯仿和丙酮混合液洗脱。
结果，强编程性细胞死亡诱导活性在用氯仿洗脱的级分和用40∶60氯仿和丙酮混合液洗脱的级分中得到确证。
(2)用氯仿洗脱的级分点样于硅胶板60F254(Merck生产)上并用9∶1的己烷和乙醚作展开剂进行薄层层析，由此在Rf值为约0.25处检测出一个具有编程性细胞死亡诱导活性和抑制癌细胞生长的活性的单一点。
对该点以实施例1中提到的方法进行不同组分的分析。
图17和18显示Rf值为约0.25的该点的脂质组分或糖组分的完全离子色谱。这样，图17显示Rf值为约0.25的点的脂质组分的完全离子色谱，而图18显示Rf值为约0.25的点的糖组分的完全离子色谱。每个图中，纵坐标是相对强度，而横坐标的上半部和下半部分别表示保留时间(分钟)和扫描序号。
从图17和18中显示，从Rf值为约0.25的点检测出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(图17中峰1)、十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图17中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图17中峰3)和一个源自甘油的峰(图18中峰1)。
(3)用40∶60氯仿和丙酮混合液洗脱的级分用95∶12的氯仿和甲醇作展开剂进行薄层层析，由此在Rf值为约0.33处检测出一个具有编程性细胞死亡诱导活性和抑制癌细胞生长的活性的点。
对该点以实施例1中提到的方法进行不同组分的分析。
图19和20显示Rf值为约0.33的该点的脂质组分或糖组分的完全离子色谱。这样，图19显示Rf值为约0.33的点的脂质组分的完全离子色谱，而图20显示Rf值为约0.33的点的糖组分的完全离子色谱。每个图中，纵坐标是相对强度，而横坐标的上半部和下半部分别表示保留时间(分钟)和扫描序号。
从图19和20中显示，从Rf值为约0.33的点检测出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(图19中峰1)、十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图19中峰2)和源自半乳糖的峰(图20中峰2、峰3和峰4)以及一个源自甘油的峰(图20中峰1)。
由此，确证上面给出的实施例3-(2)和实施例3-(3)中提到的点包含甘油脂和甘油糖脂，并且证实此甘油脂和甘油糖脂具有编程性细胞死亡诱导活性和抑制癌细胞生长的活性。实施例4将10倍体积的水加入到2.5kg干燥的压碎到1mm试管中的Kjellmaniella crassifolia中，在上述海带片膨胀后，用离心去除上清液。将乙醇和水加入到膨胀的海带中，最终有10倍体积的60％乙醇存在，之后将此混合物在37℃搅拌三小时，离心以制备上清液。上清液经浓缩，之后在750ml它的水溶液中加入氯仿和甲醇，得到氯仿∶甲醇∶水的比例为2∶4∶0.8，混合物经充分搅拌，分离下层有机相溶液。
将下层溶液浓缩并蒸发至干燥，从中制备出来一种氯仿溶解物质，将其上样至预先经氯仿平衡的200ml Iatrobeads 6RS-8060柱(Iatron生产)，并用氯仿、之后用氯仿和丙酮(40∶60)混合液、丙酮和甲醇混合液相继洗脱该柱。
每个洗脱级分经浓缩后，点样于硅胶板60F254，并对每个确证有甘油脂的级分用樱草灵试剂和苔黑酚试剂进行甘油脂的检测。结果是用低极性的溶剂洗脱的级分含更高量脂质，并就编程性细胞死亡诱导作用和抑制癌细胞生长作用而言表现出更强的活性。实施例5干燥的Kjellmaniella crassifolia经由一个混合器磨碎。在0.5g得到的海带粉中加入25ml的①60mM HCl、②1M醋酸、③1％NaHCO3、④1％Na2CO3、⑤1％Na2CO3、⑥2∶1的氯仿和甲醇的混合液、⑦75％乙醇水溶液、⑧0.1％SDS或⑨0.01％SDS，在60℃以①、②、③、④和⑦提取，或在37℃以所有其它几项提取，提取进行三小时。在此，溶液①-⑨将被称为初级提取剂。①和②用Na2CO3中和，④和⑤用HCl中和，所有其它试剂经离心，之后用于以下操作。
A．沉淀物中加入25ml75％乙醇水溶液，在60℃进行提取两小时，离心后的上清液经浓缩并蒸发至干燥，残渣溶于1ml的75％乙醇水溶液。
B.10ml上清液中加入30ml乙醇，接着搅拌，离心后的上清液在真空中经浓缩并蒸发至干燥，残渣溶于0.4ml的75％乙醇水溶液中。
C．上清液在真空中蒸发至干燥，残渣溶于1ml的75％乙醇水溶液中。
由此制备的提取产物用75％乙醇水溶液稀释，在96孔微量滴定板的每个孔中加入5μl并风干，向其中加入100μl的包含10％胎牛血清和5,000个HL-60细胞的RPMI 1640培养基，用将在下面实施例7中描述的MTT法检测抑制癌细胞生长的活性。
得到如表1所示结果。这样，表1显示提取方法和抑制癌细胞生长的活性之间的关系，表中的数据显示具有抑制癌细胞生长的活性的稀释溶液的稀释率。在用75％乙醇水溶液提取前，粉末化的海带用酸(①A)或碱(③A、④A、⑤A)溶液为初级提取剂进行处理，由此提取出与未处理的情况(⑦C)相比较具有两倍强度的抑制癌细胞生长的活性的物质。另外，那些级分的编程性细胞死亡诱导活性用将在下面实施例8中描述的一种方法进行检测，以确定具有抑制癌细胞生长活性的级分的编程性细胞死亡诱导活性。
表1初级提取剂 AB C① 8＜2② 44③ 8-④ 84⑤ 82⑥ 8⑦ 4⑧ 2⑨ ＜2实施例6(1)依据日本审查专利出版物(公告)平-06/34,660中提到的方法培养Lyophyllum ulmarium M-8171(FERM BP-1415)用于制备其子实体。另外，这样得到的子实体与日本市场上可以买到的名为“YamabikoHonshimeji”的子实体相同。再者，可依据日本公开专利出版物(公开)平-03/65,261中提到的方法，培养荷叶离褶伞K-3304(FERM BP-4348)用于制备它的子实体(日本名，hatakeshimeji)。冷冻干燥每种子实体，以及可买到的Grifola frondosa、Flammulina velutipes、香茹和光帽磷伞，并将最终的冻干产物磨碎以得到其磨碎产物。
在每0.5g上面制备的磨碎产物中加入75％的乙醇水溶液(25ml)，室温下提取两小时。离心获得提取物后，将其浓缩并在真空中蒸发至干燥获得干燥产物。再将干燥产物溶于1ml水制备乙醇提取物。
(2)上述实施例6-(1)中提到的乙醇提取物的抑制癌细胞生长活性的测定。
用GD/XPES过滤器(Whatman生产)过滤灭菌每种乙醇提取物，并用灭菌过的水制备稀释系列。在96-孔的微量滴定板的每孔中各放置10μl稀释液，向其中加入含有10％胎牛血清和5000 HL-60细胞的RPMI1640培养基100μl，于37℃在5％二氧化碳气的条件下孵育48小时。在光学显微镜下观察细胞形状，加入10μl含有5mg/ml3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯酚-溴化四唑(MTT；Sigma生产)的磷酸缓冲盐水溶液，再孵育四小时后在显微镜下观察细胞的生长状态。同时，加入含0.04NHCL的2-丙醇100μl充分搅拌，于590nm测定吸光度以衡量细胞生长程度。
对于那些蘑菇乙醇提取物的抑制癌细胞生长的活性，在30倍的Lyophyllum ulmarium稀释液和10倍的荷叶离褶伞稀释液中发现癌细胞被杀死，由此注意到其强大的抑制癌细胞生长的活性，并且发现编程性细胞死亡体(apoptic body)。在3倍的Grifola frondosa、Flammulinavelutipes、香茹和光帽磷伞稀释液中细胞被杀死，在10倍稀释液中发现编程性细胞死亡体。由此可见那些蘑菇的每种乙醇提取物均显示强的抑制癌细胞生长的活性和编程性细胞死亡诱导活性。
(3)对于Lyophyllum ulmarium的乙醇提取物，可通过实施例1中提到的方法对其组分进行分析。
图21和22显示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中脂质组分或糖组分的完全离子色谱。这样，图21显示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中脂质组分的完全离子色谱，图22显示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中糖组分的完全离子色谱。每个图中，纵坐标为相对强度(％)，而横坐标的上半部和下半部分别表示保留时间(分钟)和扫描序号。
图2l和22显示在Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图21的峰1)和顺-9，顺-12-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图21的峰2)。来自葡萄糖的峰(图22的峰2,3和4)，来自甘露醇的峰(图22的峰5)和来自甘油的峰(图22的峰1)均可被检测出来。
已证明其它蘑菇乙醇提取物中亦存在甘油脂和/或甘油糖脂。实施例7将实施例6中提到的冷冻磨碎Lyophyllum ulmarium(5g)悬浮于250ml的75％乙醇水溶液中，在室温下振摇悬浮物两小时以分离入上清液，离心沉淀制得提取物。将提取物浓缩，并用旋转蒸发仪蒸发干燥(30℃)，残留物重新溶解于20ml75％乙醇水溶液中，得到浓缩的Lyophyllumulmarium提取物。在Lyophyllum ulmarium的一部分浓缩提取物中加入1.5倍体积的水和同体积的氯仿，所得悬浮物经分馏后分为上层和下层。将每个分馏上层和下层浓缩，蒸发干燥，残留物重新溶解于1.5倍体积(所用浓缩Lyophyllum ulmarium提取物)的75％的乙醇水溶液中，每种分馏物抑癌细胞生长的活性测定如下。
用75％的乙醇水溶液制备每种级分在75％乙醇水溶液中的重溶溶液稀释系列。在96-孔微量滴定板的每一孔中各加入5μl稀释液并干燥，加入含有10％胎牛血清和5000HL-60细胞(ATCCCCL-240)的RPMI1640培养基100μl，于37℃孵育48小时。在光学显微镜下观察细胞形状后加入10μl含有5mg/ml MTT的缓冲盐水溶液，再孵育四小时后在显微镜下观察细胞的生长状态。同时，加入含0.04N HCL的2-丙醇100μl，充分搅拌，于590nm测定吸光度以衡量细胞生长程度(一种MTT方法)。
结果由20-倍下层中的上述级分杀死细胞，由此注意到其强大的抑制癌细胞生长的活性并证实编程性细胞死亡体存在。这样，这种Lyophyllumulmarium的浓缩提取物由氯仿以同样的方式分馏，取得的级分重新溶解到流动相用于硅胶柱层析，从而取代了溶解于75％乙醇水溶液再用于硅胶柱层析的方法。硅胶柱层析在两种流动相条件下独立进行，分别为氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4(条件1)和氯仿∶甲醇=65∶25(条件2)。每种硅胶柱层析的级分均浓缩并蒸发干燥，残留物重新溶解在相当于初始液体体积1/20的75％乙醇水溶液中，通过同上的MTT方法测定它的抑制癌细胞生长的活性，被证实具有活性的级分通过薄层层析的方法分析(氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4)。结果在条件1下，级分A中有活性，表现为与樱草灵试剂的斑点反应(脂质)，与茚三酮试剂的斑点反应(氨基)，与苔黑酚磺酸盐试剂的斑点反应(糖)和与Dittmer试剂的斑点反应(磷脂)，级分B的活性表现为与樱草灵试剂的斑点反应和与苔黑酚磺酸盐试剂的斑点反应。在条件2下，在级分C中有活性，表现为与苔黑酚磺酸盐试剂的斑点反应，级分D中的活性表现为与樱草灵试剂的斑点反应和苔黑酚磺酸盐试剂的斑点反应，级分E中的活性，表现为与樱草灵试剂的斑点反应，与茚三酮试剂的斑点反应和与苔黑酚磺酸盐试剂的斑点反应。进一步，在条件1下收集级分A，浓缩并蒸发干燥，溶解入流动相用于硅胶柱层析。将氯仿和甲醇95∶5比率的混合物用作流动相(条件3)。用与前面所述相同的MTT方法分析每种级分，被证实具有活性的级分通过薄层层析的方法分析(氯仿∶甲醇=95∶5)。结果在条件3下，级分F中的活性表现为与樱草灵试剂的斑点反应，级分G中的活性表现为与樱草灵试剂的斑点反应和与苔黑酚磺酸盐试剂的斑点反应，级分H中的活性表现为与苔黑酚磺酸盐试剂的斑点反应。编程性细胞死亡体的形成证实了那些抑制癌细胞生长的活性级分的编程性细胞死亡诱导活性。实施例8悬浮实施例6中提到的Lyophyllum ulmarium的磨碎冻干产物(1g)于50ml的75％乙醇水溶液或50％乙醇水溶液中，在37℃振摇两小时，离心分离入上清液和沉淀，制得各种提取物。将每种提取物浓缩，并用旋转蒸发仪蒸发干燥(30℃)，重新溶解于8ml的75％乙醇水溶液或50％乙醇水溶液中得到浓缩的Lyophyllum ulmarium提取物。
用75％或50％的乙醇水溶液稀释每种浓缩的Lyophyllum ulmarium提取物。稀释液按实施例7中提到的MTT方法分析。在用75％或50％的乙醇水溶液稀释的10-倍提取物溶液中注意到细胞的死亡，证实了其抑制癌细胞生长的活性。这样又证实了在用75％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液的提取条件下，具有抑制癌细胞生长的活性物质可被提取出。进一步，可用那些浓缩的Lyophyllum ulmarium提取物测定编程性细胞死亡诱导活性。因此，用25μl每种上面提到的浓缩提取物为例，从中蒸发去乙醇，残留物中加入在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中37℃孵育48小时的2.5×105HL-60细胞/4.5ml。同时，通过添加蒸馏水和已知具有编程性细胞死亡诱导活性的放线菌素D溶液(10μg/ml)制备对照样品。在光学显微镜下目视观察可见编程性细胞死亡体的形成、细胞的收缩和核的凝聚，并可对活细胞计数。当观察到这些现象并注意到活细胞数目减少时，可判定样品具有编程性细胞死亡诱导活性。结果，75％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液的提取物含有编程性细胞死亡诱导的物质。实施例9(1)将25ml的75％乙醇水溶液加入0.5g每种可买到的糙皮侧耳和普通蘑菇(Agaricus bisporus或类似物)的冻干粉末，提取在37℃进行两小时。离心后的上清液浓缩并于真空中蒸发干燥，残留物溶解于1ml的75％乙醇水溶液并用75％的乙醇水溶液稀释。1μl稀释液中加入含有10％胎牛血清和5000HL-60细胞的RPMI 1640培养基100μl，此混合物用于按实施例7中提到的MTT方法测定抑制癌细胞生长的活性，亦用实施例8中提到的方法测定编程性细胞死亡诱导活性。结果2倍的糙皮侧耳稀释液和未稀释的普通蘑菇溶液均显示出两种活性。
(2)在40g实施例6中提到的Lyophyllum ulmarium中加入0(0％)、50(25％)、100(50％)或150ml(75％)乙醇和160、110、60或10ml水，混合物置混合器混匀30秒，室温下振摇两小时，过滤得到提取物。用75％乙醇水溶液稀释提取物，并分别通过实施例7中提到的MTT方法和实施例8中提到的方法测定其抑制癌细胞生长的活性和编程性细胞死亡诱导活性。结果用0、25和50％乙醇水溶液的2倍稀释提取物溶液和用75％乙醇水溶液5-倍稀释的提取物溶液均可见两种活性。
将上面提到的40g Lyophyllum ulmarium切成3-5mm的立方体，加入50(25％)、100(50％)或150ml(75％)乙醇和110、60或10ml水，混合物在室温下振摇两小时，过滤得到提取物。用75％醇水溶液稀释提取物，并通过实施例7中提到的MTT方法测定其抑制癌细胞生长的活性，通过实施例8中提到的方法测定其编程性细胞死亡诱导活性。结果原始(未稀释的)含25％乙醇的提取物溶液和用50％和75％醇2-倍稀释提取物溶液均可见两种活性。
(3)将买来的香茹(Cortinellius shiitake)冻干，磨碎，得到的粉末在表2所示的条件下提取两小时。
表2香茹粉末乙醇浓度用于提取的液体量 用于提取的温度①0.5g 25％20ml 60℃②0.5g 75％10ml 室温③0.5g 50％10ml 室温④0.5g 75％25ml 室温提取后，不溶物质经离心后移去，浓缩上清液并在真空中蒸发干燥，用1ml与提取时相同浓度的乙醇水溶液溶解。用75％乙醇水溶液溶液稀释该溶液，并通过实施例7提到的MTT方法测定其抑制癌细胞生长的活性，通过实施例8中提到的方法测定其编程性细胞死亡诱导活性。结果10-倍稀释的液(1)、2-倍稀释的液(2)、5-倍稀释的液(3)和5-倍稀释的液(4)中均可见两种活性。
(4)分开买到的香茹的菌帽和菌柄。将每种分别冻干，磨碎。在0.5g得到的粉末中加75％醇水溶液25ml，于37℃提取两小时。浓缩经离心后的上清液，并在真空中蒸发干燥，残留物溶解于1ml75％乙醇水溶液中，所得溶液用75％乙醇水溶液稀释。每种稀释液抑制癌细胞生长的活性和编程性细胞死亡诱导活性分别通过实施例7提到的MTT方法和实施例8中提到的方法测定。结果在菌帽提取物的2-倍稀释液和菌柄提取物的20-倍稀释液中均可见两种活性。高级的中国香茹干以及中等级别的中国香茹的菌帽和菌柄均用混合器磨碎，用同样提取物和同样用于编程性细胞死亡诱导活性的测定方法处理，所有高级提取物和中等级别的菌帽和菌柄的5-倍稀释提取物溶液均显示两种活性。实施例10(1)在买来的绿茶粉末(matcha)0.5g中加入25ml含75％乙醇水溶液，混合物在室温振摇两小时。离心提取物，浓缩上清液并在真空中蒸发干燥，残留物溶解于1ml水中。
将提取物稀释成从1-倍到100-倍的系列。在96-孔的微量滴定板的每孔中各放置10μl稀释液，加入含有10％胎牛血清和5000HL-60细胞的RPMI1640培养基100μl，孵育48小时，在光学显微镜下观察细胞的生长状态。结果在用水和75％乙醇水溶液稀释的提取物中，细胞均被杀死，即茶的水和乙醇溶液提取物均显示很强的抑制癌细胞生长的活性。另外，由于编程性细胞死亡体的形成，证实了它们的编程性细胞死亡诱导活性。
(2)应用实施例1中提到的方法处理实施例10-(1)中提到的绿茶粉末乙醇提取物以分析不同的组分。
图23和24显示绿茶粉末乙醇提取物中脂质组分或糖组分的完全离子色谱。即，图23显示绿茶粉末乙醇提取物中脂质组分的完全离子色谱，而图24显示绿茶粉末乙醇提取物中糖组分的完全离子色谱。每个图中，纵坐标为相对强度(％)，而横坐标的上半部和下半部分别是保留时间(分钟)和扫描序号。
图23和24显示绿茶粉末乙醇提取物中十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图23的峰1)和9,12,15-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图23的峰2)，来自葡萄糖的峰(图24的峰3,4)，和来自甘油的峰(图24的峰1)均可被检测出来，因此可证实甘油脂和/或甘油糖脂的存在。还可检测出来自肌醇的峰(图24的峰5)和来自奎宁酸的峰(图24的峰2)。实施例11(1)取0.5g米糠，加水、75％乙醇水溶液或90％乙醇水溶液，在室温振摇两小时。离心提取物，浓缩上清液并在真空中蒸发干燥，残留物溶解于1ml水中。在用90％乙醇水溶液获得的提取物中，不溶于水的物质溶解于乙醇。将样品稀释，它们抑制癌细胞生长的活性和编程性细胞死亡诱导活性分别通过实施例7提到的MTT方法和实施例8中提到的方法测定。结果在水提取物的5-倍稀释液、未稀释的75％乙醇提取物溶液和90％乙醇提取物醇溶片段的10-倍稀释液中均可见两种活性，可见米糠乙醇提取物显示很强的抑制癌细胞生长和编程性细胞死亡诱导活性。
(2)应用实施例1中提到的方法处理实施例11-(1)中提到的米糠75％乙醇提取物以分析不同的组分。
图25和26显示米糠75％乙醇提取物中脂质组分或糖组分的完全离子色谱。即，图25显示米糠75％乙醇提取物中脂质组分的完全离子色谱，而图26显示米糠75％乙醇提取物中糖组分的完全离子色谱。每个图中，纵坐标为相对强度(％)，而横坐标的上半部和下半部分别是保留时间(分钟)和扫描序号。
图25和26显示米糠75％乙醇提取物中十六烷酸(棕榈酸)的甲酯峰(图25的峰1)、十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图25的峰3)和顺-9，顺-12-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(图25的峰2)。来自葡萄糖的峰(图26的峰2,3)和来自甘油的峰(图26的峰1)均可被检测出来，因此可证实甘油脂和/或甘油糖脂的存在。实施例13将来源于菠菜的单半乳糖甘油二酯(Wako Pure Chemical制造)，来源于小麦的单半乳糖甘油二酯(Funakoshi制造)和来源于小麦的双半乳糖甘油二酯悬浮于少量正癸烷中，用超声方法进一步分散悬浮物，向其中加入乙醇使正癸烷与乙醇比率为2∶98。溶液用RPMI 1640培养基稀释至50倍，在0.5ml溶液中加入4.5ml含2.5×105HL-60细胞，该细胞在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中孵育。上述产物在37℃孵育48小时，用实施例1-(4)中提到的方法测定其编程性细胞死亡诱导活性，由此证实了它具有很强的编程性细胞死亡诱导活性和抑制癌细胞生长的活性。实施例14将买来的卷心菜、茄子皮、去皮的茄子和菠菜叶冻干，磨碎，按与实施例9-(4)相同的方法提取，它们抑制癌细胞生长的活性和编程性细胞死亡诱导活性分别通过实施例7提到的MTT方法和实施例8中提到的方法测定，由此在卷心菜、茄子皮和菠菜叶提取物的2倍稀释液以及去皮茄子的5倍稀释液中均有两种活性。
本发明的益处依据本发明，提供甘油脂和/或甘油糖脂(如来自植物微生物或动物的具有强编程性细胞死亡诱导活性的甘油脂和/或甘油糖脂)是有效组分的编程性细胞死亡诱导剂，另外，由于该编程性细胞死亡诱导活性，其亦可提供抗癌剂。该甘油脂和/或甘油糖脂大量存在于植物、微生物或动物的膜组分中，可通过乙醇水溶液或类似物有效提取，由此可容易获得本发明中的有效组分。在用溶剂提取前，可先用酸或碱处理以提高提取效率。进而，根据其疏水性选择提取溶剂的极性、用于分离的色谱载体等，可选择性的制得目的甘油脂和/或甘油糖脂。其中含有、向其中加入或在其中稀释有本发明中作为编程性细胞死亡诱导化合物的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或饮料，因其每日摄取可改善健康，可用于健康食品。其中的甘油脂和/或甘油糖脂是从可食用的植物、微生物或动物中提取和/或纯化的。
权利要求
1．一种编程性细胞死亡诱导剂，其特征在于包含甘油脂和/或甘油糖脂作为有效组分。
2．一种抗癌剂，其特征在于包含甘油脂和/或甘油糖脂作为有效组分。
3．权利要求1或2中所述的制剂，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂来源于植物、微生物或动物。
4．权利要求3中所述的制剂，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂来源于茶、蘑菇、藻类或谷物残留物。
5．一种用于制备权利要求3中所述的制剂的方法，其中该方法包括用有机溶剂提取来源于植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
6．一种用于制备权利要求5中所述的制剂的方法，其中该方法包括用酸或碱处理来源于植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
7．一种用于制备权利要求5中所述的制剂的方法，其中该方法包括选择应用疏水、反相或正相色谱方法分离来源于植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
8．一种用于制备权利要求5到7中任意一项所述制剂的方法，其中所述甘油脂和成甘油糖脂来源于茶、蘑菇、藻类或谷物残留物。
9．用于诱导编程性细胞死亡的食物或饮料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀释有甘油脂和/或甘油糖脂。
10．一种抗癌的食物或饮料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀释有甘油脂和/或甘油糖脂。
11．权利要求9或10中所述的食物或饮料，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂来源于植物、微生物或动物。
12．权利要求11中所述的食物或饮料，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂来源于茶、蘑菇、藻类或谷物残留物。
13．一种用于制备权利要求11中所述的食物或饮料的方法，其中所述方法包括用有机溶剂提取来源于植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
14．一种用于制备权利要求13中所述的食物或饮料的方法，其中所述方法包括用酸或碱处理来源于植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
15．一种用于制备权利要求13中所述的食物或饮料的方法，其中所述方法包括选择应用疏水、反相或正相色谱方法分离来源于植物、微生物或动物的甘油脂和/或甘油糖脂的步骤。
16．一种用于制备权利要求13到15中任意一项所述的食物或饮料的方法，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂来源于茶、蘑菇、藻类或谷物残留物。
全文摘要
一种编程性细胞死亡诱导剂或一种抗癌剂,其特征在于包含甘油脂和/或甘油糖脂作为有效组分。
文档编号A61K35/12GK1233961SQ9719892
公开日1999年11月3日 申请日期1997年10月31日 优先权日1996年11月8日
发明者酒井武, 于福功, 小山信人, 巽容子, 佐川裕章, 猪饲胜重, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社