专利名称：抑制编程性细胞死亡的组合物、其纯化方法及其用途的制作方法
本申请是美国专利申请系列号No.08/320155的部分继续申请，后者是美国专利申请系列号No.08/158980的部分继续申请(1993年11月30日申请)并在此引为参考。
本发明的领域本发明涉及具有抑制编程性细胞死亡作用的物质的组合物。
本发明的背景技术编程性细胞死亡是导致个体细胞死亡的正常生理过程。此编程性细胞死亡过程参与了多种正常的及病理的生物过程并可由多种不相关的刺激物引起。在老龄化过程中，编程性细胞死亡的生物调节也发生变化，这种变化引起很多与老龄化相关的症状和疾病。最近对编程性细胞死亡的研究表明导致细胞死亡的普通代谢途径可由多种信号引起，包括激素、血清生长因子缺乏、化疗试剂、离子辐射及人免疫缺陷病毒(HIV)的感染。Wyllie(1980)Nature 284555-556；Kanter等人(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.118392-399；Duke and Cohen(1986)Lymphokine Res.5289-299；Tomei等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commum.155324-331；及Kruman等人(1991)J.Cell.Physiol.148267-273；Ameisen and Capron(1991)Immunol.Today 12102-105；及Sheppard and Ascher(1992)J.AIDS 5143-147。能作用于编程性细胞死亡的生物控制试剂便应用于多种临床症状的治疗中。
编程性细胞死亡的特征是细胞收缩、染色体凝聚、细胞浆产生气泡、膜的渗透性增加及核小体间DNA裂解。Gerschenson等人(1992)FSDEB J.62450-2455；及Cohen and Duke(1992)Ann.Rev.Immunol.10267-293。
本申请上下文中引用的所有文献在此引为参考。
部分含有经部分加工的植物提取物的多种补充食物已被用于改善化疗、辐射及AIDS经常伴发的胃肠道功能紊乱。这种补充食物通常含有碳水化合物、脂肪及植物蛋白水解产物。例如，见Tomei and Cops等人的in Apoptosis The Moleclar Basis of CellDeath(1991)Cold Spring Harbor Laboratory Press。
几种来自植物提取物的蛋白酶抑制剂具有抗致癌物活性。Troll等人(1987)Adv.Cancer Res.49265-283。在这些抑制剂中，Bowman-birk抑制剂被描述得最充分。Birk(1985)Int.J.Pep.Pro.Res.25113-131。Bowman-birk抑制剂被描述为一族二硫键蛋白，分子量约为8kD，它可抑制细胞变形。Chou等人(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 711748-1752；Yavelow等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825395-5399；及Yavelow等人(1983)Cancer Res.(Suppl.)432454s-2459s。已知大豆的粗提取物含有Bowman-Birk抑制剂。Knnedy等人美国专利4793996；PCT专利WO94/20121；及Kennedy，A.R.(1994)Cancer Res.(suppl.)541999s-2005s。Bowman-Birk抑制剂的免疫学性质也有描述。WO90/03574及美国专利4959310及5053327。还发现Bowman-Birk抑制剂在巨噬细胞的失粒作用中有活性。日本专利63051335。
溶血磷脂酸(LPA)以多种磷脂的形式发现于多种植物产品中。已发现LPA具有多种生理活性，包括促有丝分裂作用、生长因子及作为抗皱试剂。美国专利4263286、4746652、5326690及5340568。Moolenaar(1994)TICB 4213-219及Eichholtz等人(1990)Biochem.J.291677-680对LPA进行了详细的综述。
本发明概述本发明包括制备抑制编程性细胞死亡组合物的方法及由此制备的组合物。此组合物命名为植物源编程性细胞死亡抑制剂(PAIs)。本发明包括以足以调节编程性细胞死亡的量适于使用PAIs的生理上可接受的组合物。本发明还包括PAIs的使用方法。
附图的简要描述
图1表示对于融合的C3H 10T1/2细胞PAIs的抗编程性细胞死亡作用。
图2表示对在指数生长期的C3H 10T1/2细胞PAIs的抗编程性细胞死亡作用与浓度的关系。
图3表示由乙醇萃取纯化的PAIs与由筛析凝胶过滤色谱进一步纯化的PAIs对C3H 10T1/2细胞抗编程性细胞死亡活性的比较。此数据以对胰蛋白酶抑制活性作用表示。
图4表示不同浓度的大豆PAIs对以放线菌酮处理的非活动性的C3H 10T1/2的抗编程性细胞死亡活性。
图5表示PAI中单糖的色谱图。
图6描述了在鼠心肌细胞获得的结果。
图7是描述豆粉提取物对氨甲喋呤处理的小鼠的作用图示。
图8是描述豆粉提取物对氨甲喋呤处理的小鼠的作用图示。
图9是描述豆AcE对氨甲喋呤处理的小鼠的作用图示。
图10是描述豆粉提取物对氯甲喋呤处理的小鼠的作用图示。
图11是描述用氨甲喋呤和不同食物处理后小鼠腹泻发病率的方框图。
图12是总结用氨甲喋呤和不同食物处理后小鼠腹泻发病率及体重增加情况的方框图。
图13是DNA序列梯的照片，用以测量由感染HIV个体获得的淋巴细胞中的编程性细胞死亡。
图14是描述在用BSA或提取段B预处理提高溶血磷脂酸的情况下，抗编程性细胞死亡活性的方框图。所用缩略语为LPA，L-α-溶血磷脂酸、油酰基(C181，〔顺〕-9)；BSA，牛血清白蛋白；提取段V，乙醇提取物；及“B，”由豆粉所得的提取段B，主要是磷脂酰肌醇。
图15是描述对体外血清缺乏C3H 10T1/2细胞，溶血磷脂酸、油酰基(C181，〔顺〕-9)的抗编程性细胞死亡作用图示。
实施本发明的方式现已发现，多种植物成分含有一些组份，当将其至少作部分纯化和纯化时，它表现有抑制编程性细胞死亡的能力。很容易将这些组合物与Bowman-Birk抑制剂分离并明显不同于其它已知的治疗有效的植物产品。此组合物因来源和原来植物的生长条件会在化学组成上有细微的变化。因为本发明包括通过本文描述的方法制备的相关组合物，但这些组合物来自不同的植物，故这些组合物在本文指“PAIs”。此组份也可通过类脂合成领域中已知的方法合成制得。有几种相对纯化的组合物，将它们指定为L/G、AcE、MAcE及FAcE以表示下述不同的纯化程度。相对纯化提取段在下面的讨论中也被称为“D”及“L”，每个都是磷脂的混合物。相对纯化的两个组合物还都含有溶血磷脂酸(LPA)、LPA及蛋白载体和LPA及其它无活性提取段“B”。
PAIs可由多种不同的植物及植物器官分离。优选的植物属豆科(蚕豆及豌豆等)，但PAIs也可由其它植物分离，如茄属(如马铃薯)及葱属(如大蒜)。PAIs也可由部分纯化的植物提取物中分离，包括但不限于糖蜜、植物凝集素、部分纯化的蛋白浓缩物及部分纯化的蛋白水解物。使用本文描述的方法确定是否可由一种特定的植物、植物提取物或植物器官中分离出PAIs是本领域技术人员的一般知识。
能得到此组合物的任何植物提取物或其一部分都适用于本发明。所用植物器官包括但不限于茎、叶、根、花、根茎并优选的是储存器官和球茎，优选所用植物部分是储存器官包括但不限于马铃薯及大蒜。最优选豆的干种子包括但不限于黄豆及豌豆用于简化制备过程。虽然本文中使用了术语“种子”及“多种种子”，但应理解，这些术语包括能得到至少一种有治疗活性的PAI或在细胞培养中有活性的PAI的任何植物部分。
本发明包括初步纯化PAIs的方法。可达到不同程度的纯化。将多种种子研碎或粉碎，优选制成粉或面。在本文中，术语“粉”指研碎的干燥植物部分。粉的粒度应足够小以便使物质表面接触不同的提取液。任何研碎或粉碎方法均适用于本发明，一般地讲，通过商用磨完成多种种子的粉碎。PAIs对热异常稳定，此研碎过程可在使很多蛋白变性的温度下进行。也可使用购买的种子面。例如，已发现黄豆面及多种黄或绿豌豆面含有活性PAIs。
然后将种子粉用本领域已知方法脱脂。脱脂需要在惰性环境(例如无氧的氮气氛或氩气氛)中进行，或在此过程中加入抗氧剂如BHT或BHA，以改善活性或降低氧化。脱脂作用一般通过用含有机溶剂的溶液提取粉末来完成。适宜的有机溶剂包括但不限于丙酮、四氯化碳、乙醚、己烷及氯仿。溶液中有机溶剂的浓度一般为50-100％。优选有机溶剂是丙酮。所用有机溶剂的浓度可随特定的溶剂及种子类型变化。确定有效的浓度是本领域技术人员的一般知识。优选丙酮的浓度约为70％。也可进行多相有机提取。粉末与有机溶液的比率(重量/体积)也可变化。虽然不限于下列范围，但一般比率为约2∶1至约1∶20(粉末重量/有机溶剂体积)。对于丙酮，优选比率为1∶5。
由于PAIs的稳定性，进行脱脂作用的温度和气压至多只受到所用有机溶剂的冰点或沸点的限制。一般为了方便，在室温和常压下进行脱脂。而提取的时间并不严格，主要取决于粉末与有机溶剂的比率。对于用70％的丙酮以1∶5的比率提取时，脱脂一般进行30分钟，并不断搅拌。
然后以任何本领域已知的方法将有机溶剂从粉末中分离。优选通过离心将粉末从有机相中沉降并除去有机相。也可采用任何适宜的分离形式包括但不限于过滤或通过重力分离。PAIs留在提取后的粉末中。
然后用水溶液提取脱脂粉末得到含有PAIs的水保留液。该水溶液可以是缓冲液如磷酸盐水缓冲液(PBS)并也可含有高达约80％的与水混溶的有机溶剂。适宜的与水混溶的有机溶剂包括但不限于乙腈、低级链烷醇，特别是C1-C4链烷醇如乙醇、甲醇及丙醇，低级链烷二醇，特别是C2-C4的链烷二醇如乙二醇，及低级链烷二醇的聚合物，特别是聚乙二醇。优选使用乙醇，最优选以50％的浓度。
粉末与水溶液的比率也可变化。提取比率可以是约1∶1至至少约1∶20(粉末重量/水溶液体积)。一般使用1∶10的50％乙醇。提取时间也随水溶液的体积及所用与水混溶的有机溶剂的百分率而变化。对于1∶10(体积比)的50％乙醇，提取过程为1小时，并不断混合或搅拌(搅动)。
已发现水溶液的pH范围关系不大，已试验了2.5至11的范围；而似乎甚至更大的范围也可以是有效的。一般为了方便，pH范围为7-8。
水溶液提取的温度和气压可在大范围内变化，在主要决定于水溶液的冰点和沸点。一般，提取在室温和常压下进行。一旦用水溶液提取，水保留液就被除去以进一步加工。本领域已知的任何除去水溶液的方法都是适宜的，包括但不限于离心及过滤。
水保留液再进一步纯化得到PAI。通过任何本领域已知的方法均可将任何与水混溶的有机溶剂除去，包括但不限于超滤、干燥及透析。使用10kD分子量的界限值进行超滤可除去低分子量蛋白质如Bowman-Birk抑制剂单体及有机溶剂。透析管的分子量界限值同样可以是10kD。
超滤后通过渗滤或通过多次改变透析液(如纯水)可除去残留的有机溶剂。水保留液可以以溶液的形式保存最多几天而以冻干固体的形式可无限期保存。优选将水保留液冻干。如果起始物质是豆粉，则冻干固体是ACE。水保留液及冻干保留物都可进行进一步加工；冻干保留物在进一步加工前再悬于适当的水溶液中。得到的物质可通过任意分子量筛析色谱法进一步分离，包括但不限于用水缓冲液的Sepharose S100HR(PharmaciaBiotechnology Piscataway NJ.USA)或BioGel P-100(BioRadLaboratories Inc，Hercules CA，USA)。适当的缓冲液包括但不限于10至50mM磷酸盐(中性pH)的0.1至0.3M碳酸氢铵或0.1至0.3M氯化钠。
由筛析色谱得到的PAIs发现于空体积中并具有大于80kD的外观分子量。发现于此提取段的物质可通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在减压条件下分离出，其中含有几种蛋白质。用考马司蓝染色表明存在有分子量在18至68kD的6-8种蛋白质。通过薄层色谱分析显示存在几种类脂型化合物。
由色谱洗脱在280nm具有最大吸收的提取段与含有最大生物活性的提取段相符合。由低分子量物质中及空体积中某一位置的洗脱物中分离的生物活性与分子量大于80kD的或凝集物的相一致。此物质可以浓缩、透析、冻干并以冻干形式无限期保存。如果起始物质是豆粉，则冻干的固体是FAcE。
可溶性PAIs可用浓度为70％或更大的丙酮沉淀。但是，用不同试剂处理，包括强酸，可破坏其活性。例如，三氟乙酸、盐酸、三氯乙酸及苯酚破坏其活性。而pH若低到2.5则不破坏活性，因为1％乙酸不影响PAIs的活性。
通过将脱脂及乙醇提取的种子粉末中得到的冻干的高分子量提取段用氯仿∶甲醇∶水(4∶8∶3)单相混合物提取，可进一步分离PAIs。通过将干燥物质溶于水，然后加入甲醇、氯仿，混合并除去沉淀，可最方便地作到这一点。此提取过程得到保留PAI活性的糖脂/磷脂提取段。
例如，将0.1gEQ(得自0.1g起始物质的量)高分子量提取段(FAcE)溶于7.5ml水并不断搅拌，加入20ml甲醇后，加入10ml氯仿。通过离心(8,000×g×10分钟)除去不溶物质，通过旋转蒸发除去有机溶剂并冻干除去水再从溶液中得到PAI。得到的提取段被命名为L/G提取段。L/G提取段的碳水化合物组合物由比率为3∶2的阿拉伯糖及半乳糖以及微量的岩藻糖、鼠李糖、葡糖胺、葡糖及甘露糖组成。
基于在氯仿∶甲醇混合物中的溶解性通过在硅胶色谱柱中或薄层色谱(TLC)板上进行拆分，可将L/G提取段做进一步分离。
然后，将此物质在硅酸(即Mallinckrodt SiO2·xH2O100目粉末)上进行预色谱步骤。将活性物质装载于氯仿中并用氯仿或氯仿∶甲醇(90∶10)的混合物洗涤，并用甲醇或氯仿∶甲醇(10∶90或20∶80)洗脱。
活性物质可在二醇柱如Diol SepPak柱(Waters，Millipore)上经色谱法进一步纯化。例如，硅胶纯化的L/G、粗商用植物凝集素或其它溶于氯仿中的豆磷脂制剂可作为起始物质。例如，将约100-1000mg的样品以约为100mg/ml的浓度溶于氯仿中并将其装载于已平衡的10g二醇柱上。用2-5体积的氯仿洗涤，用2-5体积的异丙醇，2-5体积的乙醇洗脱，最后用2-5体积的甲醇洗脱。虽然在乙醇洗脱液中也发现了一些活性，但大部分活性存在于甲醇洗脱液中。通过干燥将活性物质由甲醇中分离出。适当的干燥方法包括但不限于旋转蒸发或减压蒸馏。一些样品在-20℃储存过夜后产生沉淀，但此沉淀可通过离心除去而不损失活性。
活性物质可通过HPLC色谱在硅胶柱如Rainin InstrumentCo.，Inc.的Dynamax 60A Si柱上进一步分离。所用洗脱活性物质的洗脱液的梯度为乙腈∶甲醇∶水∶氢氧化铵95∶3∶2∶0.05至65∶21∶14∶0.35。在205nm下检测洗脱液的情况。如下面给出的实施例中描述的，此纯化阶段产生5个分离的产品，指定为提取段1-5。这些产品被分离并对其组份及抗编程性细胞死亡活性分别进行分析。将几个提取段合并并检测它们的抗编程性细胞死亡活性。发现主要含有溶血磷脂酸(LPA)的流出液(如下所述)是一类化合物。当测其活性时，发现市售LPA，L-α-溶血磷脂酸、油酰基(C181，〔顺〕-9)没有抗编程性细胞死亡活性。在此提取段中发现的LPA及市售LPA在与其特定结合的一种蛋白质或多种蛋白质的存在下，确实具有抗编程性细胞死亡活性。因此，本发明的一个实施方案是含有LPA及有效量的特定结合蛋白的组合物。优选此结合蛋白是血清白蛋白。注意Bowman-Birk抑制剂的存在不影响LPA的抗编程性细胞死亡活性。还发现在提取段“B”的存在下，LPA也具有抗编程性细胞死亡的活性。提取段“B”主要是磷脂酰肌醇，并不具有抗编程性细胞死亡活性。因此本发明的另一实施方案是含有LPA及有效量的提取段B或其某种活性成分的组合物。注意提取段B不含蛋白质，因此不仅仅由于磷脂的存在才诱发LPA具有抗编程性细胞死亡活性。虽然没有任何理论阐述，但提取段B的作用可能是由于形成胶粒或脂质体，它能保护LPA和/或能让LPA正确地引进细胞中。
提取段“D”也可制得并具有抗编程性细胞死亡活性。此提取段对应于实施例8中的峰3。因此本发明的另一实施方案是含有提取段D的组合物。
提取段“L”也可制得并发现其具有抗编程性细胞死亡活性。此提取段对应于实施例8中的峰5。因此本发明的另一实施方案是含有提取段L的组合物。提取段D及提取段L在其抗编程性细胞死亡活性上可以加和。因此本发明的另一实施方案是含有提取段D和提取段L的组合物。
因此，上述实施方案也包括在术语PAI中并适用于本文描述的症状和组合物。LPA具有下列结构 其中R是未取代或取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的具有11至约23个碳原子的烷基。
另外，本文中使用的LPA包含多种分子，包括但不限于结构式如下的2-脱氧或2-脱氧-2-卤代-溶血磷脂酸化合物或其药用盐 其中-R是未取代或取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的具有11至约23个碳原子的烷基；每个X独立地为O或S；Y是O或CH2；Z是H、卤素、NH2、SH、OH或OPO3H2。
另外还包括RC(O)O-是月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、棕榈油酰基、油酰基或亚麻酰基；特别是油酰基、棕榈油酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基或月桂酰基；特别是肉豆蔻酰基或月桂酰基。
LPAs的药用盐包括但不限于碱金属盐如钠及钾盐；碱土金属盐如钙和镁盐；无毒重金属盐；铵盐；三烷基铵盐如三甲基铵盐和三乙基铵盐和烷氧基铵盐如三乙醇铵盐、三(2-羟乙基)铵盐及三甲胺(三(羟甲基)氨基甲烷)。特别优选钙盐。与特定结合蛋白或提取段B联合使用的优选的LPA化合物包括但不限于L和D1-肉豆蔻酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-月桂酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-油酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-棕榈油酰基-2-氟-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D肉豆蔻酰基-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-月桂酰基-2-氯-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-肉豆蔻酰基-2-氯-2-脱氧-甘油基-3-磷酸酯及其钙盐。
可能影响这些组合物活性的其它因素是LPA的链长，胆固醇的存在，胶粒、脂质体、洗涤剂及乳化剂的存在及在LPA中链的位置，即是在甘油的第一还是第二个碳上。对于胶粒、脂质体及洗涤剂，胶粒和脂质体将提高活性而洗涤剂及类洗涤剂分子将引起活性的降低。
由HPLC硅胶色谱获得的活性提取段可根据它们的疏水性进一步分离，例如在C18柱(Dynamax 60A，Rainin Instrument Co.Inc.)上用含有缓冲液的多种甲醇进行HPLC，所述甲醇液包括但不限于含800mg/l乙酸铵的100％甲醇；含有1mM磷酸钠(pH7.4)的99％甲醇及含有10％磷酸钠(pH7.4)的90％甲醇。以90∶10甲醇5mM磷酸钠(pH7.4)洗脱此物质。
本领域已知多种纯化及分析类脂的方法。任何本领域已知的方法都可用于本发明，只要它能纯化活性提取段。有关综述见Blighand Dyer(1959)Can.J.Biochem.Physiol.37911-917；Patton等人(1982)J.Lipid Res.23190-196；Jungalwala(1985)RecentDevelopments in Techniques for Phospholipid Analysis，inPhospholipids in Nervous Tissues(Eichberg编辑)John Wileyand Sons，pp.1-44；Mamilton等人(1992)，A Practical Approach(Richwood等人编辑)IRL Press at Oxford University Press；及Kates(1986)Techniques of LipidologyIsolation，Analysis andIdentification in Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(Burdon等人编辑)Elsevier。
一般地讲，豆粉面或其某些提取段是通过悬浮于水(对于粉面20％重量/体积)并加入两体积的甲醇及一体积的氯仿提取的。这是个单相并于室温下搅拌/混合30分钟至1小时。向此混合物中加入一体积的氯仿，混合后加入一体积的水。形成两相，在首先除去任何固体后(如果是用粉面做原料)，通过离心或分液漏斗进行分相。活性物质在有机相(底部)中。
PAIs在体外对编程性细胞死亡的抑制活性似乎主要限于活性增殖细胞；相对而言，对非活动的细胞似乎无作用。
PAIs的活性组份在蛋白酶的存在下非常稳定。例如，用胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草蛋白酶及蛋白酶K在适于蛋白水解的条件下处理PAIs，但此蛋白酶对它们的活性无影响。
本发明还包括含有基本纯化的PAIs的治疗组合物。组合物所需纯化水平可按照经验确定，这是本领域技术人员已知的。所述组合物适用于如下描述的多种功能紊乱中，并可用于人和兽。
用纯化方法得到的PAIs及其活性提取段的活性可用任何本领域已知的抗编程性细胞死亡试验检测。这些包括但不限于C3H10T1/2细胞的血清缺乏试验，它详细描述于公众可得到的PCT
发明者I·C·巴萨尔斯特, J·D·布拉德雷, L·D·托梅, P·J·巴尔 申请人:Lxr生物技术有限公司