专利名称：使用抗－cd52抗体诱导调节性t细胞分化和/或使调节性t细胞增殖的方法以及为此使用 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于抑制免疫的新方法，特别是一种通过诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞(其还可被称作抑制性T细胞)增殖的方法，以及用于这种方法的药物组合物。
背景技术：
我们发现4C8单克隆抗体(4C8 mAb)在人类T细胞与血管内皮细胞粘附后，抑制这种细胞的跨内皮细胞迁移(Masuyama，J.等人(1999)J.Exp.Med.，189，979)。对于T细胞移动到外周组织如包含炎症的组织中，需要一种使T细胞经由整联蛋白分子与血管内皮细胞牢固粘附，形态学改变以适于细胞移动，然后通过血管内皮细胞之间的空隙迁移出去的方法。已知并不是与血管内皮细胞粘附的所有T细胞均在内皮下迁移，但CD4-阳性CD45RO-阳性CD-26-强阳性活化记忆T细胞选择性迁移。具体而言，4C8 mAb是一种不抑制T细胞与血管内皮细胞粘附且特异性抑制T-细胞-亚群-选择性跨内皮迁移的单克隆抗体。
此外，已经报道过诱导调节性T细胞的能力是4C8 mAb的新功能(Masuyama，J.等人(2002)J.Immunol.，169，3710)。当用低浓度CD3激动剂刺激T细胞，这样单独的CD3激动剂就不能活化T细胞时，T细胞可被适宜的共同刺激的同时应用活化。这种共同刺激不仅可提高CD3激动剂的活化能力，而且在活化后对T细胞功能具有重要作用。当把抗-CD3抗体OKT3用作CD3激动剂时，用4C8 mAb刺激可发挥共同刺激的作用，由此活化CD4-阳性T细胞并使T细胞增殖。此外，通过用CD3和4C8 mAb同时刺激而活化的细胞由于多克隆刺激，显示出对CD4-阳性T细胞增殖的体外抑制活性，揭示了调节性T细胞已被诱导。
1.调节性T细胞T细胞形成在作为针对各种病原体的宿主防御系统的免疫系统中起重要作用的一组细胞。T细胞大致分为CD4-阳性辅助T细胞和CD8-阳性细胞毒性T细胞。特别是基于用抗原刺激后，在特定分化及成熟阶段的细胞因子产生模式，前一种T细胞可主要分为产生IFN-γ的Th1细胞，产生IL-4的Th2细胞等。通常，前一种T细胞广泛参与宿主防御，作为用于细胞-介导的免疫的细胞，而后一种T细胞也广泛参与宿主防御，作为用于体液免疫的细胞。免疫反应通过精确平衡下，具有不同性质的这类T细胞的功能而广泛参与病原体的消除和对感染抵抗力的获得。通常，已知在健康的免疫反应中，因为已经建立了免疫学耐受性，因此机理只消除外源性非-自体抗原，但消除机理不会针对形成活体的自体抗原。然而，对自体抗原的过度免疫反应导致自身免疫疾病的发展。因此，对自体抗原的免疫学耐受性不是绝对的。然而，在T细胞水平下，诱导各种类型免疫学耐受性的机理是已知的。其中一种类型的免疫学耐受性是用于消除胸腺中自我-反应性T细胞克隆的机理，其被称作中心耐受性(Kisielow，P.等人，1988，Nature333742-746)。另一种类型是被称作外周耐受性的机理，通过该机理可控制胸腺外的自我-反应性T细胞。作为后一种机理，细胞死亡的诱导或对自体抗原无反应性的诱导机理(Rocha，B.和H.von Boehmer，1991，Science 2511225-1228；Jenkins，M.K.和R.H.Schwartz，1987，J.Exp.Med.165302-319)和调节性T细胞主动抑制的机理(Shevach，E.M.，2000，Annu.Rev.Immunol.18423-449)是已知的。“调节性T细胞”是近来提出的新概念，并用于限定对其它T细胞具有抑制作用的T细胞。免疫反应是在精确平衡下建立的。例如，已经了解上述Th1细胞和Th2细胞拮抗性作用于彼此的免疫反应；即，其中一种起另外一种的调节性T细胞的作用。在此期间，由调节性T细胞组成的细胞群的存在的证实及其性质分析在免疫学近来的历史中是非常有争议的。已经研究出这类调节性T细胞是具有体外或体内抑制或调节特异性免疫反应功能的细胞。结果，基于细胞表面标记、所产生细胞因子的类型、抑制和/或调节机理等，调节性T细胞已被报道为各种细胞群的成员(Roncarolo，M.G.和M.K.Levings，2000，Curr.Opinion.Immunol.12676-683)。
在这些调节性T细胞中，近来，研究最多的细胞群是T细胞群，如下所述，其标记是CD4-阳性和CD25-阳性的。主要在除人类以外的物种，如小鼠和大鼠中研究了这类T细胞群。具体而言，已经揭示了器官-特异性自身免疫疾病是通过除去CD25-阳性细胞、RT6.1-阳性细胞(在绝大多数大鼠的成熟T细胞中表达)、CD5强-阳性细胞、或CD45RB弱-阳性(小鼠)或来源于正常小鼠的CD45RC弱-阳性(大鼠)细胞或大鼠CD4-阳性脾细胞，然后通过将剩余的T细胞转移到免疫缺陷动物中而诱导的。还没有发现这类调节性T细胞-特异性标记。上述标记与调节性T细胞的功能并不直接相关且仅仅是显示活化细胞状态、用抗原刺激的细胞状态、或记忆状态的标记。然而，通过使用不仅具有在免疫缺陷动物中诱导器官-特异性自身免疫疾病功能，而且具有通过转移特异性细胞群而抑制自身免疫疾病和自身免疫炎症的功能作为指标，已经提高了调节性T细胞群的分析。因此，已知对CD4和CD25阳性的T细胞群可成为调节性T细胞的标记(Sakaguchi，S.等人，1985，J.Exp.Med.16172；Itoh，M.等人，1999，J.I mmunol.1625317-5326；Sakaguchi.S.等人，1995，J.Immunol.1551151-1164；Asano，M.等人，1996，J.Exp.Med.184387-396；Read，S.等人，2000，J.Exp.Med.192295-302；Salomon，B.等人，2000，Immunity 12431-440；Stephens，L.A.和D.Mason，2000，J.Immunol.1653105-3110)。
如上所述，已经在小鼠和大鼠中鉴定了CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞。然而，相似细胞在人类中的存在是最终在2001年由若干组报道的(Jonuleit，H.等人，2001，J.Exp.Med.1931285-1294；Levings，M.K.等人2001，J.Exp.Med.1931295-1301；Dieckmann，D.等人，2001，J.Exp.Med.1931303-1310；Taama，L.S.等人，2001，Eur.J.Immunol.311122-1131；Stephens，L.A.等人，2001，Eur.J.Immunol.311247-1245；Baecher-Allan，C.等人，2001，J.Immunol.1671245-1253)。这些报道基于下列事实使用CD4和CD25的表达(已知在小鼠中)作为指标并使用从人外周血中分离出来的细胞群所获得的结果与已经关于小鼠报道过的结果在各种细胞表面标记、对用于细胞活化的刺激无反应性、所产生细胞因子的类型、体外抑制正常T细胞增殖的功能及其机理等方面等价。具体而言，从人外周血中分离出来的CD4-阳性CD25-阳性T细胞表达CD45RO-阳性记忆T细胞标记，且与CD4-阳性CD25-阴性T细胞相比，以高水平表达活化标记如HLA-DR。此外，CD4-阳性CD25-阳性T细胞在自身内恒定表达CTLA-4，且CTLA-4的表达通过刺激而增加。此外，用抗-CD3抗体刺激、用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体刺激、用同种异体成熟树突细胞(同种异体成熟DC)等刺激不能观察到CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞所致的DNA合成及细胞因子产生。T细胞处于对抗原刺激无反应性的状态。除了用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体刺激外，用细胞因子如IL-2、IL-4、IL-15等刺激可提高CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞的DNA合成。但提高的DNA合成能力与CD4-阳性CD25-阴性T细胞不等价。与没有CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞存在下的刺激相比，当在有CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞存在的条件下，用抗-CD3抗体或同种异体成熟树突细胞(同种异体成熟DC)刺激CD4-阳性CD25-阴性T细胞时，观察到CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞数-依赖性增殖-抑制作用。CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞具有产生抑制性细胞因子如IL-10和TGFβ1的能力，其低于小鼠这类细胞的能力。已经报道过通过中和针对这些细胞因子的抗体的作用不能消除对CD4-阳性CD25-阴性T细胞的增殖-抑制作用。还报道了这类抑制作用需要CD4-阳性CD25-阴性T细胞与CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞之间直接的细胞-细胞接触。在小鼠、大鼠和人类中，已经报道了CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞的存在且已经为此发展了性质分析。然而，还有待阐明详细的分化机理和这些细胞的抑制作用机理。还没有发现为此的特异性标记。
此外，还报道过在小鼠和人类中，调节性T细胞是在有IL-10存在的条件下用同种异体抗原刺激而诱导的或用同种异体未成熟的树突细胞(同种异体未成熟DC)反复刺激而诱导的(Groux，H.等人，1997，Nature 389737-742；Jonuliet，H.等人，2000，J.Exp.Med.1921213-1222)。与Th1细胞和Th2细胞不同，这些细胞的特征在于产生大量IL-10，中等水平的TGF-β1，INF-γ，和IL-5，低水平的IL-2，并且不产生IL-4。这些细胞被称作Tr1细胞。与CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞相似，Tr1细胞也是无反应性的。然而，抑制T细胞的机理可部分基于由Tr1细胞产生的IL-10或TGF-β1解释。然而，还不知道Tr1细胞是完全不同于CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞的T细胞亚群，还是两种类型相同，只是在分化及活化阶段不同。
通过CD4和CD25的表达(它们是小鼠和大鼠中已知的调节性T细胞标记)作为指标，已经从人外周血等中分离出了CD4-阳性CD25-阳性T细胞。结果，通过比较小鼠和大鼠T细胞中已知的其它细胞表面标记和功能与人类T细胞的那些，证实了人类CD4-阳性CD25-阳性T细胞与小鼠和大鼠的那些相似。结果表明人类中存在CD4-阳性CD25-阳性调节性T细胞。
这些细胞形成稀有细胞群，仅占外周血CD4-阳性T细胞的5％-10％，且对活化和/或增殖刺激无反应性。在此情况下，细胞增殖可通过加入含细胞因子如IL-2、IL-4或IL-5的刺激物，以用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体刺激而促进。然而，这种扩增水平对于临床应用，如扩增细胞计数及将这种细胞转移到人类中是不够的。
在动物实验中，调节性T细胞通过将这些细胞转移到动物中而发挥作用，抑制自身免疫疾病，且它们可抑制移植排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)(Hara，M.等人，2001，J.Immunol.1663789-3796；Taylor，P.A.等人，2001，J.Exp.Med.1931311-1317)。因此，可将调节性T细胞用于治疗自身免疫疾病、器官移植等，其中使用利用调节性T细胞免疫抑制作用的细胞药物。研究出了包括用药物组合物使调节性T细胞增殖，从而促进调节性T细胞增殖或通过体外处理从患者或其它人采集的外周血或骨髓细胞，然后将该细胞返回到预期患者体内的疗法。
2.4C8抗原4C8抗原是在某些免疫系统细胞上表达的。这类抗原最初是在鉴定涉及人类T细胞与血管内皮细胞粘附后跨内皮迁移的分子过程中发现的。通过利用T细胞体外深处血管外的抑制作为指标，筛选通过用人类T细胞给小鼠接种免疫获得的单克隆抗体，已经获得了可识别4C8抗原的单克隆抗体(Masuyama，J.等人，1999，J.Exp.Med.189979-989；国际专利公开号WO99/12972)。对于T细胞移动到外周组织如包含炎症的组织中，需要一种过程，从而经由整联蛋白分子使T细胞与血管内皮细胞牢固粘附，形态学改变以适于细胞移动，然后通过血管内皮细胞之间的空隙迁移出去。已知并不是与血管内皮细胞粘附的所有T细胞均在内皮下迁移，但CD4-阳性CD45RO-阳性CD-26-强-阳性活化记忆T细胞选择性迁移。具体而言，抗-4C8单克隆抗体(mAb)不会抑制T细胞与血管内皮细胞粘附，但却是特异性抑制T-细胞-亚群-选择性跨内皮迁移的mAb。认为4C8抗原是对这种迁移非常重要的功能性分子。根据使用4C8 mAb的4C8抗原表达的证实，4C8抗原在CD3-阳性T细胞中强表达且也在B细胞、NK细胞、单核细胞和嗜酸性细胞中表达。然而，它们不再在中性粒细胞和内皮细胞中表达。与4C8 mAb交联不仅可促进T细胞的肌动蛋白聚合从而提供具有极性的细胞形态学，而且可刺激细胞移动。
3.CD52(campath-1抗原)Campath-1由Waldmann等人发现，是一种能除去人骨髓移植物中淋巴细胞的大鼠抗体(Hale，G.等人(1983)Blood，62，873)。长时间以来都不了解Campath-1的抗原(CD52)，其作为一种新的分子在1991年由Xia等人鉴定(Xia，M.Q.等人(1991)European J.Immunol.，21，1677)。此外，1993年报道了已由Kirchhoff等人鉴定为男性生殖管上皮特异性分子的HE5是与CD52相同的分子(Kirchhoff，C.等人(1993)Molecular Reproduction and Development，34，8)。
Campath-1通过结合CD52而具有除去淋巴细胞的作用，其在淋巴细胞上高水平表达，从而利用补体或抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)而诱导细胞死亡。作为非常有效的除去淋巴细胞的抗体，积极研究了抗体在除去骨髓移植物中淋巴细胞，用于缓解GvHD的应用和在淋巴瘤治疗中的相同应用。Campath(商标)(Alemtuzumab)是通过大鼠抗体Campath-1G的人源化制备的Campath-1H，其已经作为B细胞淋巴瘤的治疗药物由Millennium Pharmaceuticals，Inc.销售(Pangolis GA等人(2001)Medical Oncology，18，99)。
然而，CD52，即Campath-1的抗原的功能还没有被揭示到显著的程度。已经报道过当CD52与T细胞上的抗体交联时，观察到了与抗原受体被刺激相类似的蛋白磷酸化(Hederere RA等人(2000)International Immunology，12，505)。此外，已经报道过CD52与抗体的交联提供共同刺激(除了用抗-CD3抗体或抗-CD2抗体刺激外)，由此提高T细胞增殖(ValentinH等人(1992)Transplantation，54，97；Rowan WC等人(1994)International Immunology，7，69)。然而，什么信号由CD52介导和通过用CD52的这种共同刺激对细胞功能提供什么作用还未可知。
如上所述，除了淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等外，CD52还在男性生殖管的上皮层中表达。在男性生殖管上皮中表达的CD52从上皮层细胞中释放出来，然后在精子成熟过程中，掺入到精子表面上的糖包被中。由CD52加入的糖链的唾液酸的负电荷被认为在防止精子聚集方面发挥作用。此外，还报道了抗CD52的抗体引起不育的例子。然而，CD52在精子功能等中的作用几乎完全未知(Kirchhoff C等人(2001)Cells Tissues Organs，168，93)。
CD52是由12个氨基酸组成的肽，且经由GPI锚与细胞膜结合(Xia，M.Q.等人(1991)European J.Immunol.，21，1677)。该分子本身非常小且CD52没有胞内结构域。因此，很难从其结构预测CD52的功能。这可能是在有关CD52功能的研究中没有进展的其中一个原因。
专利文献1 国际专利公开号No.WO99/12972专利文献2 JP专利公开号(Kohyo)2-503514A(1990)非专利文献1 Masuyama，J.等人(2002)J.Immunol.，169，3710非专利文献2 Hale，G.等人(1983)Blood，62，873非专利文献3 Xia，M.Q.等人(1991)European J.Immunol.21，1677非专利文献4 Kirchhoff，C等人(1993)Molecular Reproductionand Development，34，8非专利文献5 Pangolis GA等人(2001)Medical Oneology，18，99非专利文献6 Hiederere RA等人(2000)International Immunology，12，505非专利文献7 Valentin H.等人(1992)Transplantation，54，97非专利文献8 Rowan WC等人(1994)International Immunology，7，69非专利文献9 Kirchhoff C等人(2001)Cells Tissues Organs，168，93发明概述本发明的一个目的是提供一种通过使用CD52诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的方法；一种通过使用CD52抑制免疫细胞跨内皮细胞迁移的方法，一种使用这些方法抑制免疫的方法及用于这些方法的药物组合物，具体而言，一种含抗-CD52抗体作为活性成分的药物组合物。
我们已经集中研究了可由4C8抗体识别的4C8抗原，由此发现该抗原是一种CD52分子。基于有关CD52的常规发现，不能预测CD52参与活化T细胞的跨内皮细胞迁移的抑制或对调节性T细胞的诱导。我们还集中研究了抗-CD52抗体。因此，我们新发现了抗-CD52抗体(仅仅已知其除去B-细胞淋巴瘤患者中淋巴细胞的抗体活性)出乎意料地具有抑制跨内皮细胞迁移的活性及诱导调节性T细胞的活性。此外，我们发现了抑制活化T细胞的跨内皮细胞迁移的抗-CD52抗体活性及诱导调节性T细胞的活性可广泛用于免疫疗法。因此，我们完成了本发明。
本发明如下1.一种用于免疫抑制的药物组合物，其含有除4C8抗体外的CD52激动剂作为活性成分。
2.一种用于诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的药物组合物，其含有除4C8抗体外的CD52激动剂作为活性成分。
3.根据上面2所述的药物组合物，其中该调节性T细胞具有抗原-选择性抑制活性。
4.根据上面1-3任何一项所述的药物组合物，其还含有CD3激动剂。
5.根据上面4所述的药物组合物，其中该CD3激动剂是抗-CD3抗体或其片段。
6.根据上面5所述的药物组合物，其中该抗-CD3抗体是人源化抗体或人类抗体。
7.一种用于抑制免疫细胞的跨内皮细胞迁移的药物组合物，其含有除4C8抗体外的CD52激动剂作为活性成分。
8.根据上面1-7任何一项所述的药物组合物，其中该CD52激动剂是抗-CD52抗体或其片段。
9.根据上面8所述的药物组合物，其中该抗-CD52抗体是人源化抗体或人类抗体。
10.根据上面9所述的药物组合物，其中上述人源化抗体是大鼠人源化抗体Campath-1H。
11.根据上面1-10任何一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗自身免疫疾病、变应性疾病、或移植免疫反应。
12.一种用于诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的方法，其包括使除4C8抗体外的CD52激动剂作用于在免疫细胞表面上表达的CD52。
13.根据上面12所述的用于诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的方法，其中该调节性T细胞具有抗原-选择性抑制活性。
14.根据上面12所述的方法，其中该CD52激动剂是抗-CD52抗体或其片段。
15.根据上面14所述的方法，其中该抗-CD52抗体是人源化抗体或人类抗体。
16.根据上面15所述的方法，其中上述人源化抗体是大鼠人源化抗体Campath-1H。
17.根据上面12所述的方法，其中还包括使CD3激动剂作用于在上述免疫细胞表面上表达的CD3。
18.根据上面17所述的方法，其中该CD3激动剂是抗-CD3抗体或其片段。
19.根据上面18所述的方法，其中该抗-CD3抗体是人源化抗体或人类抗体。
20.根据上面12-19任何一项所述的方法，其中上述免疫细胞包含在外周血、淋巴结、或胸腺中。
21.根据上面20所述的方法，其中上述免疫细胞是T细胞。
22.根据上面21所述的方法，其中上述免疫细胞是外周血单核细胞。
23.根据上面12-22任何一项所述的方法，其中用CD3激动剂刺激免疫细胞和用CD52激动剂刺激免疫细胞是离体进行的。
24.根据上面12-22任何一项所述的方法，其中用CD3激动剂刺激免疫细胞和用CD52激动剂刺激免疫细胞是体内进行的。
25.一种生产用于具有免疫抑制作用、诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖作用、和/或抑制免疫细胞的跨内皮细胞迁移作用的药物的抗-CD52人源化抗体或人类抗体的方法。
26.一种使用与CD52的相互作用作为指标，筛选具有免疫抑制作用、诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖作用、和/或抑制免疫细胞的跨内皮细胞迁移作用的药物的方法。
本说明书包括日本专利申请No.2003-95765和日本专利申请No.2003-413786的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，它们为本申请的优先权文件。
附图简述
图1表示对其中引入了1个4C8-阳性克隆的COS-1细胞进行FACS分析的结果。连续的粗线表示用4C8 mAb染色的结果，虚线表示用同种型对照染色的结果。相似的结果从其它阳性克隆获得。
图2表示当用4C8 mAb或Campath-1H共同刺激细胞且加入CD3时，并且然后由于用抗-CD3抗体刺激导致CD4-阳性T细胞增殖，这是基于胸腺嘧啶核苷的掺入测量的，4C8 mAb-共同刺激的细胞和Campath-1H-共同刺激的细胞均可抑制CD4-阳性T细胞的增殖，这是由于以细胞数依赖性方式用抗-CD3抗体刺激所致。
图3表示在人脐带静脉内皮细胞单层下，通过加入4C8 mAb或Campath-1H抑制CD3-阳性T细胞迁移到胶原凝胶中的检测结果。4C8mAb和Campath-1H都抑制CD3-阳性T细胞的跨内皮迁移特性。
图4表示利用4C8 mAb-共同刺激的细胞抑制混合的淋巴细胞培养反应的检测结果。4C8 mAb-共同刺激的细胞可以细胞数依赖性方式抑制CD4-阳性-T细胞混合的淋巴细胞培养反应。
图5表示使用Campath-1H诱导的调节性T细胞抑制异体抗原刺激的CD4-阳性T细胞反应的检测结果。Campath-1H-共同刺激的细胞可以细胞数依赖性方式抑制CD4-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应。
图6表示通过用抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞抑制CD8-阳性T细胞混合的淋巴细胞培养反应的检测结果。4C8 mAb-共同刺激的细胞可以细胞数依赖性方式抑制CD8-阳性-T-细胞混合的淋巴细胞培养反应。
图7表示通过用Campath-1共同刺激诱导的调节性T细胞抑制CD8-阳性T细胞-混合的淋巴细胞培养反应的检测结果。通过用Campath-1H共同刺激诱导的调节性T细胞可以细胞数依赖性方式抑制CD8-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应。
图8表示异体抗原反应后，从CD4-阳性T细胞诱导调节性T细胞的检测结果。在对来源于供体B(其是用于异体抗原反应中的单核细胞衍生的成熟树突细胞的供体)的细胞的反应中，异体抗原-反应后的调节性T细胞显示出强于对照调节性T细胞的抑制活性。然而，在对来源于第三名受试者，即供体C的细胞的反应中，彼此的抑制活性相等。
图9表示通过用抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞体外扩增时，细胞数的变化。由于在培养第3-8天中，在IL-2存在的条件下培养，观察到调节性T细胞的扩增。
图10表示培养第8天，调节性T细胞的抑制测定的结果。对由此扩增的调节性T细胞观察到抑制能力降低。
图11表示再次用抗-CD52抗体共同刺激(第15天)的调节性T细胞的抑制测定结果。由此扩增的调节性T细胞的抑制能力与对照细胞的相等。
图12表示通过用Campath-1H共同刺激诱导的调节性T细胞体外扩增的检测结果。由于在有IL-2存在的条件下培养，Campath-1H-共同刺激的细胞以和4C8 mAb-共同刺激的细胞相似的方式，扩增了10倍或更多。
图13表示扩增后，Campath-1H-共同刺激的细胞的抑制活性的检测结果。Campath-1H-共同刺激的细胞以和4C8 mAb-共同刺激的细胞相似的方式扩增后，保留了抑制活性。
图14表示将1×107或2×107个人类PBMC单独给予SCID小鼠时，小鼠体重的波动，其中在给予TM-β1抗体后当天已用亚致死剂量的X-射线辐射该小鼠，将用4C8 mAb共同刺激诱导的1×107或2×107个调节性T细胞单独给予这种SCID小鼠，或将通过用4C8 mAb共同刺激诱导的1×107个PBMC和1×107个调节性T细胞的混合物(共2×107个细胞)腹膜内给予所述SCID小鼠。
图15表示将1×107或2×107个人类PBMC单独给予SCID小鼠时，SCID小鼠的存活率，其中在给予TM-β1抗体后当天已用亚致死剂量的X-射线辐射该小鼠，将用4C8mAb共同刺激诱导的1×107或2×107个调节性T细胞单独给予这种SCID小鼠，或将通过用4C8mAb共同刺激诱导的1×107个PBMC和1×107个调节性T细胞的混合物(共2×107个)腹膜内给予所述SCID小鼠。
图16表示将1.2×107个人类PBMC单独给予SCID小鼠时，小鼠体重波动的检测结果，其中在给予TM-β1抗体后当天已用亚致死剂量的X-射线辐射该小鼠，将用Campath-1H共同刺激诱导的1.2×107个调节性T细胞单独给予这种SCID小鼠，或将通过用Campath-1H共同刺激诱导的1.2×107个PBMC和1.2×107个调节性T细胞的混合物(共2.4×107个)腹膜内给予所述SCID小鼠。单独给予PBMC的那组小鼠表现出在约1周后，短暂体重恢复的倾向，但随后表现出持续的体重减轻。其间，给予PBMC和调节性T细胞混合物的该组小鼠表现出与没有给予细胞的组的那些相似的体重变化。此外，因为单独给予调节性T细胞的该组小鼠在第12天被解剖，因此直到第12天才测量体重。
图17表示将1.2×107个人类PBMC单独给予SCID小鼠时，SCID小鼠的存活率，其中在给予TM-β1抗体后当天已用亚致死剂量的X-射线辐射该小鼠，将用Campath-1H共同刺激诱导的1.2×107个调节性T细胞单独给予这种SCID小鼠，或将通过用Campath-1H共同刺激诱导的1.2×107个PBMC和1.2×107个调节性T细胞的混合物(共2.4×107个)腹膜内给予所述SCID小鼠。单独给予PBMC组的所有小鼠(所有例子)均在第21天内死亡。没有给予细胞的组的所有小鼠(所有例子)及给予PBMC和调节性T细胞混合物的组的所有小鼠(所有例子)均在观察期间存活。
图18表示有关单独给予PBMC组的小鼠及给予PBMC和调节性T细胞混合物组的小鼠消化道(盲肠)的组织分析。在实验中期进行消化道观察(有关消化道的组织发现)时，在单独给予PBMC组中(左图)，观察到各种程度的单核细胞浸润和粘膜下层水肿、毛细血管扩张等，特别是在盲肠中。然而，在给予PBMC和调节性T细胞混合物的组(右图)、单独给予调节性T细胞的组、或没有给予细胞的组中，没有观察到这种变化。
实施本发明的最佳方式下面将详细描述本发明。
在本说明书中，“CD52激动剂”是指可通过作用于在免疫细胞表面上表达的CD52抗原，经由CD52将信号传输给细胞的物质。可通过用CD52激动剂刺激而诱导的信号所诱导的反应是1)相关细胞分化成调节性T细胞和/或2)调节性T细胞增殖，但仍然保留它们作为调节性T细胞的性质；和/或3)细胞的跨内皮细胞迁移的抑制。这种CD52激动剂的例子包括CD52抗原的天然或合成配体，特别是，经由CD52分子诱导信号的所有分子；和针对CD52抗原的抗体。这种抗体可以是识别CD52任何位点的那些，只要它们经由CD52诱导信号。用于本发明中的抗体的例子是对CD52抗原具有激动剂功能的抗体。这种抗体是通过使用T细胞体外外渗的抑制作为指标，从单克隆抗体选择获得的，该单克隆抗体是从用人类T细胞免疫接种的动物获得的，如Masuyama等人(Masuyama，J.等人，1999，J.Exp.Med.189979-989；国际专利公开号WO99/12972)的报道。此外，仍然保留抗体分子的抗原-识别位点的抗-CD52抗体片段也可用作本发明的CD52激动剂。
此外，用于本发明中的这种CD52激动剂的其它例子是大鼠人源化抗体Campath-1H(Alemtuzumab)。该抗体由Campath(商标)销售并提供。生产该抗体的详细方法在日本专利公开号(Kohyo)No.2-503514A(1990)中公开。
所需抗体可在从人类采集的外周血单核细胞级分与在胶原凝胶上培养的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)共同培养形成单层后，使用穿过并迁移出该单层的单核细胞作为T细胞(用作抗原)而有效获得。为选择杂交瘤，将通过杂交瘤JM-1(在国际专利生物保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(AIST)保藏，保藏号为FERM BP-7757，保藏日为2001年9月26日)生产的抗-4C8抗体用作竞争试剂。这种试剂的使用与利用所试验抗体对T细胞染色的抑制而进行选择相结合(即，与由杂交瘤JM-1生产的抗-CD52抗体相同的表位的识别)作为指标。因此，进一步促进了所需抗体的获得。通过把选择可识别与抗-4C8抗体识别的表位相同的抗体的步骤，以及在本发明的实施例中描述的评价诱导调节性T细胞分化和/或增殖能力的步骤相结合，可很容易获得本发明所用抗体。此外，例如，通过将杂交瘤JM-1产生的抗-CD52抗体的可变区移植到人类抗体的构架中，还可获得所谓的人源化抗体作为本发明所用抗体。此外，通过使用仍然保留未重排人类抗体基因且通过用抗原致敏，产生对抗原特异的人类抗体的小鼠(例如，Tomizuka等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97722)，可获得可用作本发明抗体的人类抗体。
在本发明方法中，CD52可通过使除CD52外的CD3激动剂作用于表达CD52的免疫细胞而发挥其诱导调节性T细胞分化并促进调节性T细胞增殖的能力。CD3-分子-介导的信号转导系统，其是参与T细胞分化的主要刺激传递途径，被认为是重要的刺激途径。因此，CD52-介导的途径是所谓的共同刺激途径。在本说明书中，除CD3-分子-介导的刺激外的CD52-介导的刺激的提供可被称作用CD52共同刺激。在本说明书中，“CD3激动剂”是指可作用于在免疫细胞表面上表达的CD3分子，从而引起CD3-介导的信号转导到细胞中并引起反应发生，由此促进相关细胞分化的物质。这种CD3激动剂的例子包括激动性抗-CD3抗体如OKT3(ATCC CRL-8001)、UCHT1(B.D.Pharmingen)和HIT3a(B.D.Pharmingen)。此外，各种T细胞抗原受体的激动剂，且特别是，具有激动剂作用的抗体或其片段，也可用作本发明中的CD3激动剂，因为它们引起T细胞抗原受体和CD3复合物的形成并引起CD3-介导的信号转导到细胞中。具体而言，这种激动剂的例子是针对人类T细胞抗原受体Vβ6.7的OT145抗体(Posnett等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83(20)7888-92)。此外，此处还可使用的物质由于T-细胞抗原受体的识别而具有激动剂作用，如可溶性HLA分子，或HLA分子和抗原肽的四聚物分子。
炎性细胞如T细胞和巨噬细胞通过血管内皮向血管外炎性部位的迁移是炎性反应中的重要步骤。已经进行过很多尝试来通过使用低分子量拮抗剂、抗体等，抑制分子如已知参与该步的趋化因子或粘附因子而控制变态反应或各种免疫疾病(Yang，G.X.等人(2003)Med.Res.Rev.23369-392；Aydt，E.等人(2002-2003)70297-301；Erin，E.M.等人(2002)Curr.Pham.Des.91201-1208)。目前已经新近揭示出CD52参与T细胞的跨内皮细胞迁移。因此，揭示出T细胞外渗可通过给予针对CD52的抗体或配体或低分子量激动剂或拮抗剂，由此抑制炎性反应和/或免疫反应而抑制的可能性。
关于抗-CD52抗体Campath-1H(Alemtuzumab)，已经针对关节风湿病、多发性硬化、肾-移植排斥等进行了用于抑制免疫的抗体的临床研究(Issacs，J.D.等人，2001，Arthritis Rheum.441998-2008；Coles，A.J.等人(1999)Lancet 3541691-1695；Calne，R.等人(1999)Transplantation 681613-1616)。Campath-1H的作用机理包括由于补体毒性或抗体-依赖性细胞毒性而除去表达CD52的淋巴细胞(Hale，G.，2001，Cytotherapy，3137-143)。除去淋巴细胞导致淋巴细胞数减少的状态，直到通过分化再次产生新的淋巴细胞。Campath-1H对关节风湿病的临床试验揭示出由Campath-1H诱导的淋巴细胞数减少的状态持续了非常长的时间。在给予Campath-1H后，数目减少的各种淋巴细胞恢复正常细胞计数所需的时间为NK细胞或单核细胞1个月，B细胞3-6个月。就T细胞而言，T细胞的细胞计数甚至在3年后，仍然维持低于正常水平(Isaacs，J.D.等人，2001，Arthritis Rheum.441998-2008)。具体而言，甚至在用Campath-1H处理后停止，产生副作用，导致感染等高危状态继续。为了解决该问题，新获得的发现揭示出不具有除去细胞作用的抗-CD52抗体具有免疫抑制作用。通过给予给予这种具有抑制跨内皮细胞迁移作用机理且没有除去淋巴细胞作用的抗-CD52抗体，可获得免疫抑制作用，而不会引起淋巴细胞数持续减少，这一点与Campath-1H不同。
这种不具有除去淋巴细胞作用的抗-CD52抗体可通过下列方法选择。首先，已知补体的细胞毒性，其是通过抗体除去细胞的主要作用机理，并且抗体-依赖性细胞毒性主要取决于抗体亚类。例如，人类抗体中的IgG4和小鼠抗体中的IgG1是特征在于补体细胞毒性较低且抗体-依赖性细胞毒性较低的亚类(Maloney，D.G.(1998)“淋巴瘤的未偶联单克隆抗体疗法”，Grossbard ML，ed.癌症的基于单克隆抗体的疗法，New YorkDekker53-79)。选择不具有除去细胞活性的亚类的抗体或通过基因重组技术引入和/或替换该亚类的Fc部分，然后进行该抗体细胞毒性活性的体外筛选。补体的细胞毒性活性可通过下列方法筛选。37℃用51Cr孵育表达CD52的靶细胞1小时，由此用51Cr标记靶细胞。洗涤该细胞，然后接种在96-孔平板上。将抗-CD52抗体和人类补体加入到平板中，接着37℃孵育2小时。孵育后，收集上清液，然后使用Top计数(Packard)等测量上清液中释放的51Cr计数。因此，可评价抗体补体的细胞毒性活性。此外，可通过下列方法筛选抗体-依赖性细胞毒性活性。37℃用51Cr孵育表达CD52的靶细胞1小时，由此用51Cr标记靶细胞。洗涤该细胞，然后接种在96-孔平板上。将抗-CD52抗体和人外周血单核细胞加入到平板中，接着37℃孵育4小时。孵育后，收集上清液，然后使用Top计数等测量上清液中释放的51Cr计数。因此，可评价抗体的抗体-依赖性细胞毒性活性。通过上述方法选择的抗体没有除去淋巴细胞的活性可通过在给予人类后，最终监测淋巴细胞数而加以证实。
如上所述，跨内皮细胞迁移可通过使CD52激动剂作用于CD52上而被抑制，这样就可抑制免疫反应。此外，通过CD3和CD52的共同刺激促进调节性T细胞的分化诱导和/或促进调节性T细胞的增殖。用CD3和CD52同时刺激还可抑制免疫反应。因此，本发明提供的含CD52激动剂作为活性成分的药物组合物及含CD52激动剂和CD3激动剂作为活性成分的药物组合物可被用作免疫抑制剂。此外，这类药物组合物可被用作靶向特异性免疫系统作用机理的药物，且特别是作为诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的药剂。
此外，本发明提供的药物组合物可体内给药或可用于处理从患者或其它人类采集的离体的物质，包括免疫细胞，特别是T细胞或含淋巴细胞的外周血、淋巴液、淋巴结细胞和胸腺细胞。本发明的药物组合物可通过已知方法配制。具体而言，可生产其中加入在治疗作用方面可接受的各种添加剂，如载体、pH缓冲剂、稳定剂和赋形剂的药物制品。这种制品优选含有生理学可接受的稀释剂或载体。适宜载体的例子包括，但不限于，生理盐水溶液、磷酸盐缓冲的盐水溶液、磷酸盐缓冲的盐水的葡萄糖溶液、和缓冲的生理盐水溶液。可选择性地，CD52激动剂是冻干的，然后在需要时，通过加入上述缓冲的水溶液重构使用。给药途径的例子包括其中使用上述制品的给药形式，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、和糖浆剂的口服途径，以及其中上述制品的给药形式，如注射剂、滴剂和栓剂的非肠道途径。
上述药物组合物的给药方法和剂量可根据临床前试验和临床试验方法适当确定。例如，口服给药的剂量根据症状、年龄、体重等而有所不同，且成人通常约为0.01mg-1000mg/天。该剂量可给药一次或若干次。此外，就非肠道给药而言，约0.01mg-1000mg的单一剂量可通过皮下注射、肌内注射、或静脉内注射给药。
所治疗的疾病为需要提供免疫抑制作用过程的疾病。这类过程的具体例子包括为治疗或预防移植物抗宿主疾病(GvHD)或移植排斥目的的器官或细胞移植前或后进行的过程和为了治疗或预防自身免疫疾病如风湿病或变应性疾病如接触性过敏症而进行的过程。
可用于本发明中的疗法包括处理从患者或其它人采集的离体的物质，包括免疫细胞或含免疫细胞的外周血、淋巴液、淋巴结细胞、或胸腺细胞，从而使调节性T细胞增殖，然后将该细胞返回到患者体内。干细胞移植疗法，其包括从活体采集外周血或骨髓细胞，然后将该细胞返回到患者体内，已经实现。此外，已经进行了癌症疗法，其包括人工处理构成免疫细胞类型的树突细胞，然后将该细胞返回到患者体内(M.Jefford等人，The Lancet Oncology，2343-353，2001年6月)。通过使CD52激动剂和CD3激动剂作用于所采集的免疫细胞，可引起调节性T细胞的分化诱导和/或增殖促进。然后，调节性T细胞增殖，接着将该细胞返回到患者体内，从而产生治疗或预防作用。这种所谓的离体的方法的实现在治疗部位构成实验系统的几乎直接再现，这种系统已经在基础研究场所得到发展。与体内给药相比，这种离体的方法的实际应用的危险较低，体内给药中可能不会导致这类药物像预期那样发挥其治疗作用，这是由于未知因素等的体内吸收、代谢、干扰作用。
此外，本发明还包括，用于开发具有诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖作用和/或抑制免疫细胞的跨内皮细胞迁移作用，使表达CD52的细胞与候选化合物接触，检测两者的相互作用或CD52对刺激的反应，并因此使用与CD52的相互作用作为指标，筛选可能成为CD52激动剂的化合物。
实施例14C8抗原的鉴定我们已经揭示出针对4C8抗原的4C8单克隆抗体(其中4C8抗原是由某些免疫系统的细胞表达的膜蛋白，且是在人类T细胞与血管内皮细胞粘附后，涉及其跨内皮迁移的分子鉴定过程中首次发现的)抑制T细胞的体外外渗(Masuyama.J.等人，1999，J.Exp.Med.189979-989；国际专利公开号WO99/12972)。
首先，尝试了4C8抗原的鉴定。分离出4C8抗原并通过使用CD3-阳性细胞作为基因来源构造4C8mAb-阳性细胞级分形式的cDNA文库，然后使用4C8 mAb和MACS系统(Miltenyi Biotec)浓缩已被导致瞬时表达该文库的COS-1细胞而鉴定。
使用Ficoll-Hypaque，通过密度梯度离心，分离出肝素化人外周血中的外周血单核细胞。CD3-阳性T细胞是使用抗-CD3抗体(MiltenyiBiotec)和MACS系统制备的。总RNA，90μg，是使用Rneasy Mini试剂盒(QIAGEN Inc.)从108个CD3-阳性T细胞获得的。聚(A)+RNA是使用OligotexTM-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(TAKARA BIO Inc.)纯化的。聚(A)+RNA，1.7μg，是从90μg总RNA获得的。通过琼脂糖凝胶电泳，使用cDNA合成所用的SuperscriptTM选择系统，使从聚(A)+RNA合成的cDNA经过大小分级分离。将1-Kb至10-Kb cDNA克隆到真核细胞表达载体pEF 18S(Ohashi，H.等人，1994，Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A.91158-162)中。结果，获得由7×106个独立克隆组成的CD3-阳性-T-细胞-衍生的cDNA文库。
质粒，270μg，是使用Endofree Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN Inc.)从上述文库的500ml LB(Luria-Bertani)培养溶液获得的。使用Trans IT-LT1(TAKARA BIO Inc.)将该质粒，100μg，瞬时引入到2×107个COS-1细胞中。4C8 mAb-阳性细胞是使用抗体和MACS系统从已瞬时表达该文库的COS-1细胞纯化的。质粒是通过Hirt方法从4C8 mAb-阳性COS-1细胞收集的(Hirt B.，1967，J.Mol.Biol.，26365-369)。将该质粒引入到大肠杆菌(ElectroMAX DH10B，InvitrogenCo.)中进行扩增，然后按照与上述相似的方式制备。将从引入到COS-1细胞中到收集质粒的上述方法再重复3次。
独立质粒克隆，384个克隆，是从由此获得的浓缩文库随机分离出来的。将该质粒克隆按照与上述相似的方式瞬时引入到COS-1细胞中，然后使用FACSCalibur(Becton-Dickinson)将4C8-阳性克隆与其它克隆区别开来。结果，揭示3个克隆是4C8-阳性的(图1)。
该阳性克隆的核苷酸序列是使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪(Applied Biosystems)分析的，接着进行核苷酸数据库的BLAST检索。揭示所有3个阳性克隆均编码CD52(Xia，M.Q.等人，1991，Eur.J.Immunol.211677-1684)。还用Campath-1H将由COS-1细胞的cDNA表达产生的产物染色，已知其是抗-CD52抗体。当通过FACSCalibur分析CD48、CD58和CD59(它们是GPI锚定蛋白样CD52)的cDNA转染的细胞的4C8 mAb可染色性时，结果为阴性。因此，证实了4C8 mAb不能识别GPI锚定蛋白的共有结构(图中没有表示)。因此，4C8被推断为CD52。
实施例2通过用Campath-1H共同刺激而诱导调节性T细胞当抗原是CD52的单克隆抗体Campath-1H(C1H)用于共同刺激时，进行有关调节性T细胞是否是按照与4C8 mAb共同刺激相似的方式，从CD4-阳性T细胞诱导的检测。
外周血单核细胞是使用Ficoll-Paque Plus(Amersham Pharmacia)通过密度梯度离心方法从健康成年志愿者的外周血中分离出来的。CD4-阳性T细胞是使用MACS CD4+T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)，根据试剂制造商的操作过程，通过负选择从外周血单核细胞制备的。
如下所述将抗体固定在平板上。将使用PBS制备的浓度为100ng/ml的抗-CD3抗体(ORTHOCLONE OKT3，Ortho Biotech)分配在48-孔平板(Costar)上，4℃孵育24小时进行固定，并类似固定使用PBS制备的浓度为10μg/ml的4C8mAb或Campath-1H(CAMPATH，Berlex)。
将通过上述方法制备的CD4-阳性T细胞悬浮于补充了10％FCS和15mM HEPES缓冲液的RPMI1640培养基(GIBCO)中。以8×107个细胞/孔将所得物接种在通过上述方法在其上固定了抗体的平板上，接着在CO2培养箱中，在37℃和5％CO2条件下培养3天。培养后，收集细胞并洗涤。然后将该细胞再次悬浮于培养基中，然后以1×106个细胞/孔接种在24-孔平板(Costar)上。在不进行刺激从而使细胞处于静息状态的条件下再培养4天后，使4C8 mAb-共同刺激的细胞或Campath-1H-共同刺激的细胞经过抑制测定。
抑制测定是如下进行的。将用X-射线(5000rad)辐射的CD4-阳性T细胞和外周血单核细胞分别以1×105个细胞/孔和4×105个细胞/孔共同接种在96-孔U形-底平板(ICN)上。以25ng/ml的终浓度加入抗-CD3抗体，接着培养3天。之后，比较没有加入调节性T细胞的对照组和以0.5×105-2×105个细胞/孔加入4C8 mAb-共同刺激的细胞或Campath-1H-共同刺激的细胞(两者均用X-射线(5000rad)辐射为调节性T细胞)组的[3H]胸腺嘧啶核苷掺入，由此评价抑制活性。[3H]胸腺嘧啶核苷掺入是通过在培养第3天，以0.2μCi/孔加入[3H]胸腺嘧啶核苷，在8小时后收集细胞，然后使用β平板(Perkin Elmer)测量细胞掺入的[3H]胸腺嘧啶核苷计数而评价的。第一次测定中使用的所有细胞都来源于同一供体。
如图2所示，Campath-1H-共同刺激的细胞由于用抗-CD3抗体刺激而以细胞数依赖性方式抑制CD4-阳性T细胞增殖，与4C8mAb-共同刺激的细胞类似。
实施例3利用Campath-1H抑制CD3-阳性T细胞的跨内皮细胞迁移使用Campath-1H进行有关在4C8 mAb的情况下报道的(Masuyama，J.等人，Journal of Experimental Medicine，189(6)，979-989)CD3-阳性T细胞的跨内皮细胞迁移的抑制活性是否也可利用其它类型的抗-CD52抗体观察到的检测。为此使用的方法是如下所述，基于在上页中报道的方法进行的。
CD3-阳性T细胞是通过使用尼龙织物柱自外周血单核细胞浓缩CD3-阳性T细胞级分，然后使用抗-CD16-磁性抗体进行负选择而制备的(Advanced Magnetics，Inc.)。
培养人脐带静脉内皮细胞，在具有其中以50μl/孔沉积的胶原凝胶的96-孔平底平板(Becton Dickinson)上融合，然后进行测定。通过向补充了0.5％BSA的M199培养基(GIBCO)中加入0.3μg//ml-3μg/ml 4C8 mAb或Campath-1H而对CD3-阳性T细胞进行预处理，然后在冰上孵育20分钟。用抗体处理CD3-阳性T细胞(3×105个/孔)，然后在没有洗涤的条件下，接种在其中沉积了人脐带静脉内皮细胞的上述平板上。以50×g离心该平板1分钟，接着37℃孵育3小时。通过用EDTA洗涤除去未粘附的CD3-阳性T细胞和血管内皮细胞。用相差显微镜计算迁移到人脐带静脉内皮细胞层下胶原凝胶中的T细胞数。比较用抗体处理组和未处理组的每个单位面积中迁移的细胞数。所有实验都是重复三次进行的。
如图3所示，Campath-1H以和4C8mAb相似的方式抑制CD3-阳性T细胞的跨内皮细胞迁移。因此，揭示出Campath-1H，抗-CD52抗体，可按照与4C8 mAb相似的方式诱导跨内皮细胞迁移的抑制。
实施例4-1利用通过抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞抑制CD4-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应进行CD4-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应测定，以检测通过用抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞是否由于异体抗原刺激而抑制CD4-阳性T细胞反应。4C8 mAb用作抗-CD52抗体。
调节性T细胞是通过实施例2中所述方法诱导的。用作刺激细胞的单核细胞-衍生的成熟树突细胞是如下诱导的。CD14-阳性细胞是使用MACS微珠CD14(Miltenyi Biotec)，按照试剂制造商的操作过程，通过正选择从外周血单核细胞制备的。将CD14-阳性细胞悬浮于补充了10％FCS、2-巯基乙醇(GIBCO)、100ng/ml IL-4、和50ng/ml GM-CSF的RPMI1640培养基中，然后以3×106个细胞/孔接种在6-孔平板(Falcon)上。培养5天后，加入10ng/ml终浓度的LPS，然后进一步培养所得物24小时，由此诱导单核细胞-衍生的成熟树突细胞。使用流式细胞计(FACScan，Becton Dickinson)分析细胞级分，由此证实成熟树突细胞标记的表达。
混合的淋巴细胞培养反应是通过在96-孔U形-底平板上接种从供体A制备的CD4-阳性T细胞(1×105个细胞/孔)及从不同供体，供体B制备的单核细胞-衍生的成熟树突细胞(1×104个细胞/孔)，接着培养4天而进行的。之后，比较没有加入调节性T细胞的对照组和以1×105-2×105个细胞/孔加入4C8 mAb-共同刺激的细胞(用X-射线(5000rad)辐射细胞为调节性T细胞)组的[3H]胸腺嘧啶核苷掺入，由此评价抑制活性。[3H]胸腺嘧啶核苷掺入是按与实施例1相似的方式测量的，区别在于确定从加入[3H]胸腺嘧啶核苷到收集细胞的培养时间为16小时。
如图4所示，4C8mAb-共同刺激的细胞可以细胞数依赖性方式抑制CD4-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应。
实施例4-2利用通过Campath-1H共同刺激诱导的调节性T细胞抑制CD4-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应就异体抗原刺激所致的CD4-阳性T细胞反应是否也被使用Campath-1H作为抗-CD52抗体诱导的调节性T细胞抑制进行检测。实验是通过与上述实施例4-1相似的方法进行的，区别在于确定反应时间为3天。
如图5所示，Campath-1H-共同刺激的细胞可以细胞数依赖性方式抑制CD4-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应。
因此，显示通过用Campath-1H共同刺激诱导的调节性T细胞可按照与用4C8 mAb共同刺激诱导的调节性T细胞相似的方式，由于异体抗原刺激而抑制CD4-阳性T细胞反应。
实施例5-1利用通过抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞抑制CD8-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应为了检测通过用抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞是否也可由于异体抗原刺激而抑制CD8-阳性T细胞增殖，进行了CD8-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应。4C8 mAb用作抗-CD52抗体。
CD8-阳性T细胞是使用MACS CD8+T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)，按照试剂制造商的操作过程，通过负选择从外周血单核细胞制备的。调节性T细胞是通过实施例2所述方法诱导的。用作刺激细胞的单核细胞-衍生的成熟树突细胞是按照与实施例4-1相似的方式诱导的。
混合的淋巴细胞培养反应是通过在96-孔U形-底平板上接种从供体A制备的CD8-阳性T细胞(1×105个细胞/孔)和从不同供体，供体B制备的单核细胞-衍生的成熟树突细胞(1×104个细胞/孔)，接着培养3天而进行的。之后，比较没有加入调节性T细胞的对照组和以1×105-2×105个细胞/孔加入4C8 mAb-共同刺激的细胞(用X-射线(5000rad)辐射细胞为调节性T细胞)组的[3H]胸腺嘧啶核苷掺入，由此评价抑制活性。[3H]胸腺嘧啶核苷掺入是按照与实施例4-2相似的方式测量的。
如图6所示，4C8 mAb-共同刺激的细胞可以细胞数依赖性方式抑制CD8-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应。
实施例5-2利用通过Campath-1H共同刺激诱导的调节性T细胞抑制CD8-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养反应进行CD8-阳性-T-细胞-混合的淋巴细胞培养增殖测定，以检测使用Campath-1H诱导的调节性T细胞作为抗-CD52抗体是否也由于异体刺激，而显示针对CD8-阳性T细胞反应的抑制。该实验是用与实施例5-1相似的方法进行的。
如图7所示，Campath-1H-共同刺激的细胞可以细胞数依赖性方式抑制混合的淋巴细胞培养反应。
因此，显示通过用Campath-1H共同刺激诱导的调节性T细胞可按照与用4C8 mAb共同刺激诱导的调节性T细胞相似的方式，由于异体抗原刺激而抑制CD8-阳性T细胞反应。
实施例6异体抗原反应后，从CD4-阳性T细胞诱导调节性T细胞对有关具有抗原-选择性抑制活性的调节性T细胞是否可在异体抗原反应后，通过用抗-CD52抗体对CD4-阳性T细胞施加共同刺激而诱导进行检验。
如下诱导作为刺激细胞的单核细胞-衍生的成熟树突细胞。将使用实施例4-1所示方法制备的CD14-阳性细胞悬浮于补充了1％热-灭活自体血浆、100mg/ml IL-4、和50ng/ml GM-CSF的X-VIVO-15培养基(Cambrex)中。以3×106个细胞/孔在6-孔平板上培养7天后，收集细胞，然后洗涤。然后将该细胞悬浮于通过加入10ng/ml IL-1β(R&D系统)、3μg/ml IL-6(在KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA的设备中生产)、10ng/ml TNFα(PeproTech)和1μg/ml前列腺素E2(Sigma)到上述培养基中而制备的培养基中。以1×106个细胞/孔将所得细胞接种在6-孔平板上，然后进一步培养2天，由此诱导单核细胞-衍生的成熟树突细胞。CD4-阳性CD45RA-阳性T细胞是使用MACS CD45RAMicroBead(Miltenyi Biotec)，按照试剂制造商的操作过程，通过正选择从CD4-阳性T细胞(通过上面实施例2所述方法分离)制备的。
异体抗原反应和调节性T细胞的诱导是如下进行的。将从供体A制备的CD4-阳性CD45RA-阳性T细胞(1×106个细胞/孔)和从不同供体，供体B制备的单核细胞-衍生的成熟树突细胞(1×105个细胞/孔)悬浮于补充了pyrubic acid(Gibco)和MEM非-必需氨基酸溶液(Gibco)的X-VIVO-15培养基中，然后接种在24-孔平板上。培养6天后，采集细胞，再次制备成浓度为1×106个细胞/孔，然后进一步培养4天。将所得细胞用作异体抗原反应后的T细胞。具体而言，调节性T细胞是从细胞群诱导的。调节性T细胞是通过实施例2所示方法诱导的，区别在于使用异体-反应后的T细胞代替CD4-阳性T细胞。作为对照组，从供体A制备的CD4-阳性T细胞诱导调节性T细胞。之后，将从异体-反应后的T细胞诱导的调节性T细胞称作异体抗原-反应后的调节性T细胞。从CD4-阳性T细胞诱导的调节性T细胞被称作对照调节性T细胞。
各类型调节性T细胞的抑制活性时通过实施例4所述混合的淋巴细胞培养反应评价的。然而，作为刺激细胞，使用从供体B制备的单核细胞-衍生的成熟树突细胞(在制备异体抗原-反应后的T细胞后使用)或从第三名受试者，供体C制备的单核细胞-衍生的成熟树突细胞。将补充了pyrubic acid和非-必需氨基酸溶液的X-VIVO-15培养基用于该反应。确定培养时间为3天。
如图8所示，在对来源于供体B的细胞的反应中，异体抗原-反应后的调节性T细胞显示出强于对照调节性T细胞的抑制活性。然而，在对第三名受试者，供体C的反应中，两者的抑制活性彼此相等。如上所述，揭示出具有异体抗原-选择性抑制活性的调节性T细胞是通过使用来源于异体抗原-反应后的T细胞的抗-CD52抗体诱导调节性T细胞而获得的。
实施例7-1通过用抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞的体外扩增对有关是否可在有IL-2存在的条件下，通过培养用抗-CD52抗体共同刺激诱导的调节性T细胞而扩增进行检测。
以8×105个细胞/孔将CD4-阳性T细胞接种在其上已经通过实施例2所述方法固定了抗-CD3抗体和4C8 mAb的平板上，然后培养3天。培养后采集并洗涤，然后将该细胞再次悬浮于含100U/ml IL-2(Chiron)的培养基中，然后以1×106个细胞/孔接种在24-孔平板上。培养2天后，收集细胞，然后再次制备成在含100U/ml IL-2的培养基中浓度为1×106个细胞/孔，接着培养3天。总共培养8天后，采集细胞。第一次抑制测定(第8天)是使用部分细胞通过实施例2所述方法进行的。此外，在培养8天后洗涤一些细胞，在其上固定抗-CD3抗体和4C8 mAb的平板上培养3天，然后在不进行刺激的条件下，通过实施例2所述方法培养4天。第二次抑制测定(第15天)是使用由此获得的细胞进行的。作为对照组，使细胞经过完全相同处理，区别在于在培养第3-8天，在不含IL-2的培养基中培养，用于各抑制测定。
如图9所示，在有IL-2存在的条件下，细胞数在培养5天后增加了10-倍或更多。然而，如图10所示，在有IL-2存在的条件下，培养后立即进行的第一次抑制测定(第8天)中，抑制活性与对照组相比明显减弱。然而，如图11所示，在其中细胞再次用抗-CD52抗体共同刺激的第二次抑制测定(第15天)中，观察到抑制活性的恢复。在整个15天的培养时间后，细胞数增加了30-倍。
实施例7-2通过用Campath-1H共同刺激诱导的调节性T细胞的体外扩增对有关是否可在有IL-2存在的条件下，通过培养使用Campath-1H作为抗-CD52抗体诱导的调节性T细胞而扩增进行检测。
调节性T细胞是通过实施例7-1所述方法诱导并扩增的，区别在于使用Campath-1H(以30μg/ml或100μg/ml固定在平板上)用于共同刺激。此外，在该实施例中，在有IL-2存在的条件下培养4天，且抑制测定仅在第14天进行。没有提供未加入IL-2的组。使用4C8 mAb进行共同刺激的组，与实施例7相似，被确定为对照组。Campath-1H的活化能力倾向略低于4C8 mAb。因此，为了获得有效活化，该实施例中的浓度被确定为高达30μg/ml或100μg/ml作为用于固定的条件。
如图12所示，通过在有IL-2存在的条件下培养，按照与4C8 mAb-共同刺激的细胞相似的方式，Campath-1H-共同刺激的细胞被扩增了10-倍或更多。此外，如图13所示，Campath-1H-共同刺激的细胞在扩增后仍保留了抑制活性，与4C8 mAb-共同刺激的细胞的方式相似。
因此，显示仍保留抑制活性的调节性T细胞可通过在有IL-2存在的条件下扩增后，通过反复用抗-CD52抗体共同刺激而扩增。
实施例8-1通过调节性T细胞的同时转移抑制由于人外周血转移到SCID小鼠中的小鼠致死率和调节性T细胞的体内安全性为了抑制NK细胞活性，从而促进人类细胞在SCID小鼠(6周龄，雄性，从CIEA Japan，Inc.获得)中的粘附及整合，在转移人类细胞前一天，腹膜内给予识别IL-2受体β链的TM-β1抗体(20μg/小鼠，Pharmingen)，然后在转移人类细胞那天，用亚致死剂量(2.5Gy)的X-射线辐射该小鼠。然后转移该人类细胞。单核细胞(PBMC)是使用Lymphoprep(AXIS-SHIELD)，通过使来源于健康成年人的白细胞提取(leukapheresis)样品经过比重离心获得的。可选择性地，调节性T细胞是通过使用已经通过实施例2所述方法从同一供体PBMC中分离出来的CD4-阳性T细胞的4C8 mAb扩增和/或诱导(按照实施例7所示方法)这类调节性T细胞而制备的。提供单独给予1×107个或2×107个PBMC的组，单独给予1×107个或2×107个调节性T细胞的组，或腹膜内给予1×107个PBMC和1×107个调节性T细胞(共2×107个)的混合物组。除这些组外，还提供没有转移细胞的组。此外，用抗-CD3抗体(Pharmingen)将转移的PBMC染色，然后使用FACSCalibur流式细胞计(Becton Dickinson)分析。因此，证实包括在PBMC中的CD3-阳性T细胞的比例为42％。各组使用5只小鼠。在细胞转移后，观察体重和情况共30天。
先前已证实当把人类PBMC腹膜内给予已经接受TM-β1抗体的SCID小鼠时，人类T细胞被活化从而在小鼠体内增殖。小鼠因此发展(异体)移植物抗宿主疾病的症状，然后越来越虚弱并死亡。在该实验中，已经单独转移了1×107个或2×107个PBMC的任何组的小鼠(所有例子)均在约2周内死亡(图15)，且由于在实验开始时进行的X-射线辐射，瞬时体重减轻没有恢复(图14)。另一方面，关于已经单独转移了1×107个或2×107个调节性T细胞的小鼠，没有观察到死亡的例子且直到30-天的观察期结束，所有小鼠(所有例子)均存活(图15)，同时显示与没有给予细胞组的那些几乎完全相似的体重变化(图14)。在给予PBMC和调节性T细胞混合物的组中，5只小鼠(例子)中有3只死亡，时间稍晚于单独转移了PBMC的组。然而，5只(例子)中剩余的2只直到观察期结束仍然存活，且显示出与已经单独给予PBMC的所有组相比，明显延长的存活时间(基于Logrank试验)(图15)。
实施例8-2通过调节性T细胞的同时给药抑制由于将人外周血给予SCID小鼠所致的小鼠致死率和调节性T细胞的体内安全性为了抑制NK细胞活性，从而促进人类细胞在SCID小鼠(8周大，雌性，从CIEA Japan，Inc.获得)中的粘附及整合，在给予人类细胞前那天，腹膜内给予识别IL-2β受体的TM-β1抗体(20μg/小鼠，Pharmingen)。在给予人类细胞那天，用亚致死剂量(2.5Gy)的X-射线辐射该小鼠。然后给予该人类细胞。用Lymphoprep(AXIS-SHIELD)，使来源于健康成年人的白细胞提取(leukapheresis)样品经过比重离心。调节性T细胞是通过使用来源于由实施例2所述方法从同一供体PBMC中分离出来的单核细胞(PBMC)或CD4-阳性T细胞的Campath-1H扩增和/或诱导(见实施例7-2)而制备的。提供单独给予1.2×107个PBMC的组，单独给予1.2×107个调节性T细胞的组，腹膜内给予1.2×107个PBMC和1.2×107个调节性T细胞(共2.4×107个)的混合物组，及没有给予细胞的组。除了已经单独给予调节性T细胞的组外，将各组小鼠分成在给予细胞后第11天解剖用于观察急性期症状(包括组织发现)的组和经过21天有关体重和情况测量的观察组。每组使用5只小鼠。此外，单独给予调节性T细胞组的小鼠(2只)仅在给予细胞后第12天解剖，这是由于所得细胞数。此外，通过用抗-CD3抗体(Pharmingen)给T细胞染色，然后使用FACSCalibur流式细胞计(Becton Dickinson)分析，先前已经证实包含在所给予PBMC中的CD3-阳性T细胞的比例为49.4％。
我们先前已经证实当把人类PBMC腹膜内给予已经接受TM-β1抗体的SCID小鼠时，人类T细胞被活化从而在小鼠体内增殖。小鼠因此发展(异体)移植物抗宿主疾病的症状，然后越来越虚弱并死亡。在该实验中，已经单独给予PBMC的任何组的小鼠(所有例子)均在第21天内死亡(图17)，且由于在该实验开始时用X-射线辐射，瞬时体重减轻没有恢复(图16)。在已经给予PBMC和调节性T细胞混合物组的小鼠中，虽然所给予的这类人类细胞的总数只是其它例子中给予的人类细胞数的2倍，但该组显示出与没有给予细胞组的那些几乎完全相似的体重波动(图16)。该组的所有小鼠(所有例子)均存活(图17)。此外，单独给予调节性T细胞的小鼠显示高于没有给予细胞组的体重增加的恢复趋势(图16)。因此表明急性期侵害仅针对小鼠发展。此外，在实验过程中解剖时，在单独给予PBMC的组中观察到消化道的单核细胞浸润、水肿、毛细血管扩张等。然而，在给予PBMC和调节性T细胞混合物的组及单独给予调节性T细胞的组中没有观察到这类改变(图18)。
通过上述结果揭示出与PBMC不同，该体内模型系统中单独的调节性T细胞对小鼠完全没有致病性。还揭示出由于单独给予PBMC所致的小鼠致死率可通过调节性T细胞的同时给药被显著抑制。这些结果进一步表明由抗-CD52抗体诱导的调节性T细胞可抑制人类T细胞的过度体内活化，其给药对伴有T细胞异常活化的各种类型疾病的发展而言均可能成为一种有效的疗法。
此处引证的所有公开出版物、专利和专利申请均整体引入此处作为参考。
工业实用性根据本发明，揭示出由CD52介导的信号可诱导免疫抑制具体而言，调节性T细胞的分化诱导和/或增殖促进以及跨内皮细胞迁移的抑制。CD52激动剂，包括针对CD52的抗体，可用作免疫抑制，包括调节性T细胞的分化诱导和/或增殖促进以及跨内皮细胞迁移的抑制的药物组合物活性成分。这种组合物包括用于自身免疫疾病和变应性疾病、对移植的免疫反应的抑制等的药物组合物。此外，本发明能够使用CD52激动剂体内制备调节性T细胞，并因此利用这种细胞治疗和/或预防自身免疫疾病和症状和/或需要免疫抑制，如抑制移植免疫反应的疾病。
通过使用本发明具有抗原选择性的调节性T细胞，可预期单独抑制靶抗原-特异性免疫反应，同时避免抑制整个免疫系统抑制所伴随的副作用，其可利用常规的免疫抑制剂进行。
权利要求
1.一种用于免疫抑制的药物组合物，其含有除4C8抗体外的CD52激动剂作为活性成分。
2.一种用于诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的药物组合物，其含有除4C8抗体外的CD52激动剂作为活性成分。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中该调节性T细胞具有抗原-选择性抑制活性。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的药物组合物，其还含有CD3激动剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中该CD3激动剂是抗-CD3抗体或其片段。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中该抗-CD3抗体是人源化抗体或人类抗体。
7.一种用于抑制免疫细胞的跨内皮细胞迁移的药物组合物，其含有除4C8抗体外的CD52激动剂作为活性成分。
8.根据权利要求1-7任何一项所述的药物组合物，其中该CD52激动剂是抗-CD52抗体或其片段。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中该抗-CD52抗体是人源化抗体或人类抗体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中上述人源化抗体是大鼠人源化抗体Campath-1H。
11.根据权利要求1-10任何一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗自身免疫疾病、变应性疾病、或移植免疫反应。
12.一种用于诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的方法，其包括使除4C8抗体外的CD52激动剂作用于在免疫细胞表面上表达的CD52。
13.根据权利要求12所述的用于诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的方法，其中该调节性T细胞具有抗原-选择性抑制活性。
14.根据权利要求12所述的方法，其中该CD52激动剂是抗-CD52抗体或其片段。
15.根据权利要求14所述的方法，其中该抗-CD52抗体是人源化抗体或人类抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中上述人源化抗体是大鼠人源化抗体Campath-1H。
17.根据权利要求12所述的方法，其中还包括使CD 3激动剂作用于在上述免疫细胞表面上表达的CD3。
18.根据权利要求17所述的方法，其中该CD3激动剂是抗-CD3抗体或其片段。
19.根据权利要求18所述的方法，其中该抗-CD3抗体是人源化抗体或人类抗体。
20.根据权利要求12-19任何一项所述的方法，其中上述免疫细胞包含在外周血、淋巴结、或胸腺中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中上述免疫细胞是T细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中上述免疫细胞是外周血单核细胞。
23.根据权利要求12-22任何一项所述的方法，其中用CD3激动剂刺激免疫细胞和用CD52激动剂刺激免疫细胞是离体进行的。
24.根据权利要求12-22任何一项所述的方法，其中用CD3激动剂刺激免疫细胞和用CD52激动剂刺激免疫细胞是体内进行的。
25.一种生产用于具有免疫抑制作用、诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖作用、和/或抑制免疫细胞的跨内皮细胞迁移作用的药物的抗-CD52人源化抗体或人类抗体的方法。
26.一种使用与CD52的相互作用作为指标，筛选具有免疫抑制作用、诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖作用、和/或抑制免疫细胞的跨内皮细胞迁移作用的药物的方法。
全文摘要
提供一种诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的方法；一种抑制免疫细胞的血管流－介导的内皮细胞迁移的方法；使用这些方法的免疫抑制方法；及用于这些方法中的药物组合物。即，一种通过用含抗－CD52抗体的CD52激动剂处理表达CD52的T细胞从而诱导调节性T细胞分化和/或促进调节性T细胞增殖的方法，一种抑制免疫细胞的血管流－介导的内皮细胞迁移的方法，及使用这些方法的免疫抑制方法。
文档编号C07K16/18GK1798577SQ20048001510
公开日2006年7月5日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年3月31日
发明者益山纯一, 渡边智子, 相马良明, 山口泰范 申请人:麒麟麦酒株式会社