专利名称：处理或抑制细胞损伤或细胞死亡的方法
技术领域：
本发明涉及通过提供使用TNFα拮抗剂的疗法处理或者抑制缺血事件后的细胞损伤或者细胞死亡，处理或者抑制再灌注损伤，和降低心肌梗塞后的死亡率。
血管床血流的减少或者中断是许多临床事件的原因，这些事件需要立即处理并且对受损器官或者组织恢复充分灌注。不同组织可以承受不同程度的缺血损伤。然而，如果不进行再灌注，所有组织会发展为不可逆的损伤和细胞坏死。心脏组织减少灌注(缺血)，会导致心脏因为组织缺少氧气和能量而丧失正常工作的能力。永久损伤与心肌所经受的氧气缺少的持续时间直接相关。缺血组织再灌注，简单的是指到那些组织或者器官系统的血流恢复。通过机械或者药理方法实现再灌注的必要性，已经为医疗团体所接受，特别是在心肌梗塞临床处理中。数据显示当血流回到组织时，“再灌注损伤”会损害组织救治的程度。
如冠状血管成型术溶栓治疗这样的治疗干预，是直接针对急性心肌缺血治疗的。已经熟知，发生心肌梗塞病人的死亡率，直接依赖于左心室功能障碍的程度，后者与形成梗塞并因此失去功能的心肌的数量直接相关。一般有这样的共识，经受一段时间缺血的心肌组织，取决于在确定时间内用于恢复细胞存活力和功能的血流恢复。
缺血后的受损组织只能通过再灌注进行恢复。虽然再灌注的做法会进一步加重损伤。因为研究者开始认识到这一点，所以研究工作都是针对作用机制，以及开发用于抑制与再灌注损伤相关的细胞损伤的潜在治疗方法。很多细胞机制被认为是造成缺血引起的再灌注损伤的原因。
TNFα是一种巨噬细胞和单核细胞分泌的细胞因子，它对很多细胞类型都可以造成广泛的作用。TNF蛋白质通过与在TNF应答细胞浆膜上表达的特异性TNF受体(TNFR)蛋白质结合，激发对细胞的生物效应。TNFα引起的效应包括，对肿瘤细胞系的抑制作用或者细胞毒性作用，刺激成纤维细胞的增殖以及骨髓细胞的细胞吞噬/细胞毒活性，诱导内皮细胞的粘连分子，抑制脂肪细胞中特定酶的合成，以及诱导组织相容性抗原的表达。[参见，美国专利5,610,279]。TNFα也能引起促炎作用，该促炎作用引起组织损伤，例如软骨和骨降解[Saklatvala，Nature 322547(1986)；Bertolini，Nature 319516(1986)]。TNFα也与感染、免疫紊乱、肿瘤病理、自身免疫病理、以及对宿主的移植疾病相关。TNFα也涉及引起与癌症相关的称作恶病质的衰竭综合征，它包括反应于恶性生长的进展性体重减轻、厌食、以及对瘦弱体质的持续侵蚀。[参见WO 98/51344]。
TNFα也被认为有助于引起心室功能紊乱、肺水肿、以及心肌病。[Torre-Amione G，J Am Coll Cardiol 271201-1206(1996)]。不断增加的证据表明，由TNF与TNF受体I和II(TNFR，p55，p75)结合触发的炎症级联反应的成分是造成在心肌中观察到的急性损伤效应的直接原因[Oral，H.，J Biol Chem.272(8)4836-4842(1997)；Kapadia，S.，Am J.Physiol.268H517-H525(1995)]。
已表明包括TNF的炎症细胞因子是由肌细胞在缺血发生后立即释放[Meldrum，D.R.，J Mol Cell Cardiol.301683-1689(1998)]，并且认为其参与粘连分子的表达，这些粘附分子有助于中性粒细胞外渗。鞘磷脂酶途径可以通过TNF释放而激活，而且被认为是细胞因子重要的信号传递途径[Kim et al.J Biol Chem 266484-489(1991)；Dressler et al.，Science 2551715-1718(1992)；Yang et al.J Biol Chem 26820520-20523(1993)]。该途径被证明存在于心肌细胞中。[Oral et al.，J Biol Chem 2724836-4842(1997)]。鞘磷脂酶可被TNF激活，而将与膜结合的鞘磷脂降解为神经酰胺。内源神经酰胺酶催化神经酰胺合成鞘氨醇。已证明神经酰胺和鞘氨醇都具有第二信使特性。已表明鞘氨醇能通过降低钙诱导的肌浆网钙释放以及直接抑制L-型钙流的能力而抑制心脏功能。Cain等[Crit CareMed.27(7)1309-1318(1999)]使用悬浮在器官浴中的激活的人心房小梁，并且记录了组织产生的展开力。加入浓度分级的TNF-α、IL-1β或者TNF-α+IL-1β，并评估功能。另外，在TNF-α或者IL-1β之前把组织暴露于N-油酰乙醇胺(NOE)。TNF-α和IL-1β都以浓度依赖方式抑制人心肌的功能。通过NOE对心肌鞘氨醇抑制，消除了TNF-α或者IL-1β的心肌抑制作用。研究者总结了TNF-α和IL-1β能分别和协同抑制人心肌功能。鞘氨醇可能参与导致人心肌功能抑制的TNF-α和IL-1β信号。
细胞损伤也被证明存在于其他组织中。在鞘氨醇和代谢物以及C2、C8或者C16神经酰胺存在或者不存在的情况下培养成人肾脏近端小管(HK-2)细胞0-20小时。鞘氨醇(＞或者＝10微摩尔每升)和选择的神经酰胺(C2和C8)在没有DNA梯或者细胞凋亡的形态改变时，都诱导快速的浓度依赖的细胞毒性，表明是细胞死亡的一种坏死形式。研究者能够在人包皮成纤维细胞中重现该结果，表明这与急性细胞损伤和修复区域广泛相关[Iwata et al.，PANS 92(19)8970-8974(1995)]。
ENBREL(etanercept；p75TNFRFc)是一种二聚体融合蛋白质，由人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合蛋白质，和与其连接的人IgG1 Fc部分组成。Etanercept是一种目前市场上销售的用于治疗类风湿性关节炎的TNFα拮抗剂，而且正在进行慢性心力衰竭治疗的临床试验[Bozkurt B，JACC(Suppl)184-185A(1999)；Deswal A，Circulation (suppl)96(8)I-323(1997)]。
WO 98/51344公开了结合VEGF拮抗剂使用TNFα拮抗剂治疗或者预防TNF-介导疾病，包括类风湿性关节炎、克隆氏病、以及与移植有关的急性和慢性免疫疾病。
发明详述本发明提供了一种处理或者抑制缺血事件后的细胞损伤或者细胞死亡的方法，该方法包括提供有效剂量的TNFα拮抗剂。更具体地，本发明提供了通过提供有效剂量的TNFα拮抗剂，处理或者抑制由于心肌梗塞、心肌缺血、视网膜缺血、视网膜中动脉阻塞、外周动脉阻塞(例如，栓塞)、短暂缺血发作(例如，脑缺血发作)、缺血性卒中、缺血性动脉阻塞引起的细胞损伤或者细胞死亡，以及处理和抑制由于冻疮、动脉血栓形成和阻塞、以及挤压伤引起的再灌注损伤的一种方法。本发明也提供了一种通过提供有效剂量TNFα拮抗剂以降低心肌梗塞后死亡率的方法。本发明另外提供了一种通过提供有效剂量TNFα拮抗剂以抑制心脏缺血事件后心脏损伤的方法。本发明进一步提供了一种通过提供有效剂量TNFα拮抗剂以处理或者抑制再灌注损伤的方法。
本发明所使用的术语提供有效剂量TNFα拮抗剂，是指或者直接给予这种拮抗剂，或者给予能在体内形成有效剂量TNFα拮抗剂的药物前体、衍生物或者类似物。
术语TNFα拮抗剂在WO 98/51344中有精确定义，定义为在体内降低、阻断、抑制、消除或者干扰TNFα活性。例如，合适的TNFα拮抗剂能够结合TNFα，并且包括抗-TNFα抗体、其抗原结合片段，以及受体分子和特异结合TNFα的衍生物。合适的TNFα拮抗剂也能阻止或者抑制TNFα合成和/或TNFα释放，并且包括这样的化合物，例如酞胺哌啶酮、替尼达普，以及磷酸二酯酶抑制剂，例如，但不局限于己酮可可碱和咯利普兰。能阻止或者抑制TNFα合成和/或TNFα释放的合适的TNFα拮抗剂，也包括A2b腺苷受体增强子和A2b腺苷受体激动剂(例如，51-(N-环丙基)-羧基酰胺腺苷，51-N-乙基羧基酰胺腺苷，环己基腺苷和R-N6-苯基-2-丙基腺苷)参见，例如，Jancobson，GB 2 289218A。合适的TNFα拮抗剂也能够阻止或者抑制TNFα受体信号传导，包括分裂素激活蛋白(MAP)激酶抑制剂。其他合适的TNFα拮抗剂包括降低、阻断、抑制、消除或者干扰膜TNFα剪切的试剂，例如，但不局限于金属蛋白酶抑制剂；降低、阻断、抑制、消除或者干扰TNFα活性的试剂，例如，但不局限于血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，例如卡托普利、依那普利和赖诺普利；以及降低、阻断、抑制、消除或者干扰TNFα产生和/或合成的剂试，例如，但不局限于MAP激酶抑制剂。
TNFα拮抗剂优选结合TNFα。更优选的TNFα受体分子是一种TNFα受体片段/免疫球蛋白融合蛋白。更加优选的是，该融合蛋白包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重链的部分或者全部恒定区。
特别优选的TNFα拮抗剂是etanercept(p75TNFRFc)，它是一种二聚体融合蛋白质，由人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合蛋白质，和与其连接的人IgG1 Fc部分组成。Etanercept的商业销售名称是ENBREL，目前被允许用于治疗类风湿性关节炎。Etanercept可以根据美国专利5,605,690，5,478,925，EP 464533和EP 670730中描述的方法制备，这些专利在此引入作为参考。
另一种优选的TNFα拮抗剂称作p55TNFRFc，它是一种二聚体融合蛋白质，由人55千道尔顿(p55)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合蛋白质和与其连接的人IgG1 Fc部分连接。p55TNFRFc的制备公开在美国专利5,610,279中，该专利此处收作参考。
TNFα拮抗剂处理或者抑制缺血事件后的细胞损伤或者细胞死亡的能力，以及处理或者抑制再灌注损伤的能力，在两个体内标准药理学试验过程中得到评估。第一个试验过程评估了TNF和鞘氨醇对心脏功能的影响，第二个试验过程评估了主冠状动脉阻塞30分钟后再灌注后的存活率。在第二个试验过程中，Etanercept作为代表性的TNFα拮抗剂被评估，该试验模拟急性心肌梗塞。也进行了一个体外标准药理学试验过程，以评估鞘氨醇对肌细胞的心脏抑制作用。使用的步骤和得到的结果描述如下。
步骤手术准备用戊巴比妥钠(50 mg/kg I.P.)麻醉体重为505±5g的雄性Sprague-Dawley大鼠。气管插管缝合到一定位置，与小动物呼吸器(Harvard Apparatus，Model 683，South Natick，MA)连接，设置到100次呼吸/分钟，潮气量为2-3mL/呼吸。用具有循环热水的加热垫(K-model 100，Baxter Laboratories)维持体温。进行左胸切开术，暴露心脏，除去心包。使用连接血管导管(20 Gauge)的充盐水聚乙烯导管测量左心室压力，该血管导管穿过心尖，并且与一个P23 ID Statham/Gould压力传导器相连。动脉血压通过插入左颈动脉的充盐水聚乙烯导管(PE 50)监测。右颈静脉也套管插入聚乙烯导管(PE 50)，用于静脉内药物灌注和补充体积(0.9％NaCl)。皮下针置于四肢，用于心电图记录。所有的数据输出都记录于具有Po-Ne-Mah数据获取系统(Valley View，OH)的Gould Model 6600(Valley View，OH)系列记录仪，显示在生理平台CRS800W/CRS400W记录仪(GeneralScanning Inc.，Bedford MA)上。
在第一个试验过程中，手术处理大鼠(开胸，但不阻塞)，并通过低速静脉输注(每5分钟0.1mg/kg)给予TNF、鞘磷脂、或者鞘氨醇。每只动物连续观察15分钟，然后进行第二次给药，低速静脉输注(每5分钟0.3mg/kg)，每只动物再观察15分钟。
在第二个试验过程中，进行冠状动脉阻塞的大鼠主冠状动脉被固定，并在接近起点处使用5-0缝合进行阻塞，缝合通过血管下，可以通过束紧PE管(PE 20)的一小段发动局部缺血。通过除去PE管小片段恢复再灌注。
确定梗塞大小取出心脏，切成5到6个冠状切片，浸在1％氯化三苯四氮唑(TTC)中10-15分钟。取出心脏切片，吸干，描记在乙酸盐纸上。梗塞区域在缺血区以灰白色清楚分界，而未阻塞心肌是砖红色的。用平面测量法确定所有切片的面积，梗塞区域以左心室的百分比表示。
大鼠血清中TNF的测定不用任何抗凝血剂，用注射器收集血液样品，迅速置于Microtainer血清分离管(Becton Dickinson)中，2000g离心6分钟。取出血清，立即冷冻，贮存于-20℃直至进行分析。对每只大鼠，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，根据制造商说明使用Factor-Test-X(Genzyme Inc，Cambridge，MA.，Cat #80-3905-01)，测定在预选时间点收集的血清TNF浓度。简言之，在0.1％牛血清白蛋白/磷酸缓冲液中1∶2稀释100μL血清，加入双份至96-孔微量滴定板上。通过大鼠TNF标准的浓度对其吸光度作图，得到标准曲线。制造商的分析和我们实验室的确认表明这种分析可以测定游离TNF和结合etanercept的TNF(数据未显示)。该分析的测量极限是10pg/mL。另外，制造商已确定该ELISA对于大鼠TNF是高度特异的。大鼠INF-γ，GRO-β/MIP-2，GRO/KC，和白细胞介素IL-1β，IL-2和IL-4，以及小鼠LIF，SCF，GM-CSF，和白细胞介素IL-1α，IL-3，IL-5，IL-7和IL-10，在浓度达到106pg/mL时，不产生可检测到的交叉反应。
心室肌细胞的分离使用Sliver，et al.，(13)中列出的改进的Langendorff灌注方法分离心室肌细胞。简言之，用戊巴比妥钠(40mg/kg I.P.)麻醉体重2-4kg的任何性别的猫。在麻醉时，切开胸骨，迅速切除心脏，浸入4℃的无Ca++的Krebs-Henseleit缓冲液(KHB)，用于主动脉套管插入。KHB有以下组分(mM)130 NaCl，4.8KCl，1.2MgSO4，1.2 NaH2PO4，25 NaHCO3，12.5葡萄糖。用95％O2/5％CO2气体混合物平衡时溶液pH为7.35-7.40。溶液在整个过程中活跃通气。插入套管的心脏在37℃用KHB清洗2-4分钟，然后用含有0.7mg/mL II型胶原酶(197单位/mg；Worthington；Freehold，NJ USA)的KHB灌注12-15分钟。把消化的心室组织与心房剖离开，切碎，用200μm孔的尼龙筛子过滤。滤出液50xg离心1-2分钟，分离的细胞沉淀重悬浮于新鲜KHB。后一步骤进行3次。在第三次重复时，沉淀重悬浮于含有2％牛血清白蛋白和100μMCa++的KHB中。得到的细胞悬浮液分成2等分。一份用Tyrode’s溶液(成分如下)1∶1稀释，置于室温(19-25℃)，在分离12小时内用于细胞记录。第二个等分用于平铺细胞，用于以后的记录，并分散至DMEM/F-12培养基(BioWhittaker，Walkersville，MD，USA)1∶1混合物，该培养基补充了硫酸链霉素(200μg/mL)和青霉素-G钠盐(200单位/mL)。平铺的细胞在孵育箱(pH＝7.2)中维持室温。悬浮培养基每两天更换一次。
肌细胞的电生理记录在36-37℃，用破碎的整细胞结构膜片，进行膜片钳电流和电压记录(14)。对于L-型Ca2+电流的研究，细胞用改进的Tyrode’s溶液浸泡，该溶液含有(mM)157TEA-Cl，5 CaCl2，0.5 MgC12和10 HEPES。电极内溶液含有(mM)10L-谷氨酸，20 CsCl，10 EGTA，1 MgCl2，1 CaCl2，20 HEPES和5 ATP-Mg2+；用CsOH调节pH。在所有研究中，测得的电极电阻为2-3.5MΩ。在形成封闭之前，在浸液中调节参照零点电位。使用连接有DigiData 1200 DA/AD获取系统的Axon Instruments 200B放大器(Axon Instruments，CulverCity，CA USA)进行记录。通过从-30到+60 mV的去极化电压梯度(长度1秒)激发离子流，以10-mV增加，维持电位为-40mV，频率1Hz。通过注入主瞬时去极化电流脉冲，以1Hz频率引发动作电位。数据获取和分析中使用的软件是pClamp v.6.04和Originv 5.0(MicrocalSoftware，Northampton，MA)。
结果未阻塞大鼠的血液动力学参数下表显示了鞘氨醇、鞘磷脂和TNF在未发生心肌缺血的开胸大鼠中，对下列血液动力学参数的影响心率、平均血压、左心室血压(LVL)和其一阶导数(+dP/dt)。
在未发生心肌缺血的开胸大鼠中测量的心血管参数组心率 平均血压 LVPdev +dP/dt大鼠TNF-α0.1mg/kg iv(n＝5) -3±1 4±7 1±410±5+0.3mg/kg iv -3±2 4±6 -1±39±8鞘磷脂0.1mg/kg iv(n＝4) 7±9 -3±173±111±13+0.3mg/kg iv 8±10 2±2 4±126±15鞘氨醇0.3mg/kg iv(n＝4) -4±4 -24±12 -24±8*-33±12*+1.0mg/kg iv -18±1*-17±19 -24±14 -32±18*数据以平均值±标准误表示。数据是在用药15分钟后，相对用药前基线的百分比变化。*是指整个观察期间与其他预处理组相比p＜0.05。
该试验过程的结果显示，输注鞘氨醇(0.1+0.3mg/kg)之后，整体心肌功能显著降低LVP从基线降低24±8％，+dP/dt从基线降低33±12％。在本试验方法中，给大鼠外源给药的TNF剂量所造成血清浓度，比心肌缺血后内源产生的TNF Cmax高2倍。然而，在没有炎症反应时，即便非常高的TNF血清浓度也不能产生急性心脏功能抑制，这种炎症反应对于激发鞘脂类级联反应是必需的。在没有肌细胞损伤时，给予鞘磷脂将不会抑制功能，因为膜鞘磷脂酶将不会被TNF浓度增加而激活，不能把鞘磷脂降解为神经酰胺，神经酰胺是前面所述的能在分离肌细胞中降低其收缩性的代谢物。
鞘氨醇对分离肌细胞的作用为了进一步评估鞘氨醇对心肌功能和细胞损伤的作用，分离出分离的肌细胞，如上述测定鞘氨醇对钙流的作用。以前的研究表明，鞘氨醇能通过减少钙离子从肌浆网的释放而影响动作电位产生[Yasui，et al，Am J.Physiol.270C645-649(1996)；MacDonell，et al.Am J. Physiol.275H2291-2299(1998)]。上述标准药理学试验方法得到的结果显示，鞘氨醇以浓度依赖方式缩短了分离的猫心室肌细胞的动作电位持续时间(APD)，0.25μM、2.5μM、25μM鞘氨醇分别使95％完全复极化(APD95)待续时间降低16±2％、28±2％和39±2％(n＝4)。APD缩短，主要是抑制了平台期的结果。在外部和吸液管中的溶液中，通过使用一种K+流阻断剂Cs+，抑制其他K+流，分离出Ca+2流(ICa-L)。通过维持肌细胞在-40mV，并且在外部溶液中用TEA-C1代替NaCl，消除快速Na+流(INa)，其中-40mV是阻止大部分(INa)的电位。暴露于鞘氨醇(2.5和25μM)，造成ICa-L的显著阻断(25μM时阻断17±7和75±4％)。心脏动作电位的减少和内向Ca+2流的减少被认为是与在全身给药之后直接观察到的或者在TNFR1激活后间接观察到的负性肌力改变有关。鞘氨醇(25μM)最终引起心肌细胞死亡，细胞死亡是通过暴露于最高浓度鞘氨醇之后造成的形态和其失去活性确定的。用TNF(200-20,000单位/mL)处理肌细胞不改变动作电位或者ICa+2-L。
有阻塞大鼠中的TNF水平如上所述，手术准备大鼠并阻塞冠状动脉。下表显示了有心肌缺血的开胸大鼠中TNF的血清浓度。
组 赋形剂 Etanercept-30分钟 0±0 0±00分钟 6056±9252299±357*30分钟2122±3712057±34960分钟740±153 1592±258*90分钟585±112 1108±279*120分钟 338±44 721±209150分钟 204±7 580±193*数据以平均值±标准误表示，单位pg/ml。
*是指在相同时间点，与赋形剂处理组相比p＜005。
基线＝-30分钟，缺血结束＝0分钟，再灌注＝30，60，90......分钟。
在该试验过程中，手术打开胸腔，但是没有任何诱导的阻塞(假手术动物)的大鼠在整个试验过程中具有稳定的TNFα浓度，最大浓度242±90pg/mL。这些数据表明，血管阻塞造成TNFα水平大大增加，在缺血时期结束时达到顶峰。结果也表明，etanercept显著降低0分钟时反应于血管阻塞的巨大TNFα浓度脉冲。
TNFα拮抗剂处理在有阻塞大鼠中对于死亡率的影响心肌缺血/再灌注后的存活百分比。在这个试验中也进行了评估。结果总结于下表。
进行心肌缺血/再灌注的开胸大鼠，在有和无etanercept(3mg/kgiv)时的存活百分比组 赋形剂 Etanercent-30分钟 100 1000分钟 100 10030分钟 83 10060分钟 66 10090分钟 50 89120分钟 33 89*150分钟 17 88*数据以存活百分比表示。
*是指在相同时间点，与赋形剂处理组相比p＜0.05。
基线＝-30分钟，缺血结束＝0分钟，再灌注＝30，60，90......分钟。
在该标准药理学试验方法中，在阻塞之前立即给予etanercept(3mg/kg i.v.)，显著降低由于心肌缺血/再灌注造成的死亡率。对于整体死亡率，在再灌注后期(t＝90分钟)开始出现不同。例如，在t＝90分钟时，赋形剂处理组的9只大鼠有4只死亡，相比较etanercept处理组的9只大鼠只有1只死亡，尽管差异没有达到统计学显著性(p＝0.08)。在再灌注120和150分钟时，etanercept和赋形剂对照组之间的差异，达到了统计学显著。在观察到的赋形剂处理组7例死亡中，6例是由于急性泵衰竭和进行性心动过缓，还有一只动物是死于再灌注之后早期的室性心律失常。etanercept处理组的两例死亡都是由于心动过缓和泵衰竭。以左心室百分比表示的梗塞大小，在Etanercept组是24±3％，在赋形剂对照组是26±2％，表明不同的存活率不是梗塞大小不同的结果。这些结果表明，用TNFα拮抗剂处理，降低了心肌缺血/再灌注引起的死亡率，推测可能是由于阻止了从鞘磷脂产生鞘氨醇的级联反应，该级联反应发生在响应缺血/再灌注损伤的TNFα与TNFR1结合之后。
基于在上述标准药理学试验方法中获得的结果，TNFα拮抗剂在降低心肌梗塞后死亡率上是有效的。基于获得的结果，TNFα拮抗剂也在处理或者抑制缺血事件后的细胞损伤或者细胞死亡方面是有效的。更具体地，本发明提供了一种处理或者抑制由于心肌梗塞、心肌缺血、视网膜缺血、视网膜中动脉阻塞、外周动脉阻塞(例如，栓塞)、短暂缺血发作(例如，脑缺血发作)、缺血性卒中、缺血性动脉阻塞冻伤导致的损伤、动脉血栓形成和阻塞、以及挤压伤引起的细胞损伤或者细胞死亡的一种方法。本发明对于处理或者抑制再灌注损伤也是有效的。用TNFα拮抗剂处理在过程之前或者过程期间也都是有效的，该过程包括缺血事件和其后的再灌注，例如移植手术，供体器官经过一段时间缺血，然后再通过受体血液供给进行再灌注；血管成型术或者冠状血管内支架放置；血栓溶解治疗；心脏瓣膜置换；以及旁路手术。
TNFα拮抗剂可以按照药剂配方标准方法单独配制，或者结合一种或者多种可药用载体给药。给药途径包括口服、肠道外用药(包括，但不局限于，静脉注射、肌肉注射、皮下注射)、鼻内、腹膜内、直肠、阴道内、经皮给药。给药途径根据TNFα拮抗剂的性质和用药原因而变化。例如，当TNFα拮抗剂在肠内很快降解时，就优选使用肠道外用药。对于处理或者抑制缺血事件后的细胞损伤或者细胞死亡，因为etanercept的酸不稳定性和需要快速开始起效，优选用静脉注射提供etanercept。
当通过口服提供TNFα拮抗剂时，可以以这样的形式提供，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒，或者含有例如大约0.05％到5％悬浮剂的悬浮液，含有例如大约10％到50％糖类的糖浆，以及含有例如大约20％到50％酒精的酏剂，以及类似的形式，或者通过肠道外提供时，以无菌可注射溶液或者在等渗介质中含有例如大约0.05-5％悬浮剂的可注射悬浮液的形式提供。这些药物制剂可以含有，例如，大约0.05％到90％与载体结合的活性成分，更经常是大约5％～60wt％。
对于片剂或胶囊用药的配方，可以包括固体载体，包括淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和高岭土，而液体载体包括无菌水、聚乙二醇、非离子表面活性剂和食用油，例如玉米、花生和芝麻油，这些都适合活性成分的性质以及用药所需的特殊形式。也可以优选包括通常用于制备药物组合物的佐剂，例如调味剂、着色剂、防腐剂和抗氧化剂，例如维生素E、抗坏血酸、BHT和BHA。
当肠道外或者腹膜内给予TNFα拮抗剂时，可以在适当混合羟基-丙基纤维素等表面活性剂的水中，把这些活性化合物的溶液或者悬浮液当作游离碱或者可药用盐类来制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇和其在油中的混合物中，制备分散体。在常规贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合注射的药剂形式包括，用于临时制备无菌注射溶液或者分散体的无菌水溶液或者分散体和无菌粉末。在所有情况下，制剂必须是无菌的，而且必须具有流动性，易于注射。必须在制造和贮存条件下稳定，必须能防止细菌和真菌等微生物污染。载体可以是溶剂或者分散介质，含有例如，水、酒精、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适当的混合物、以及植物油。例如商业提供的Etanercept，是白色不含防腐剂的冻干粉末，在用水重建后肠道外用药。
TNFα拮抗剂的剂量，预期根据TNFα拮抗剂的性质、用药原因、以及接受治疗的病人个体不同而改变。对于长期治疗，通常推荐以最小有效剂量开始治疗，根据医生监测调整剂量。用etanercept治疗，设计的静脉内用药剂量可以为0.05-25mg/kg etanercept。针对特定的缺血事件，考虑可以以单个剂量或者多个剂量给予TNFα拮抗剂，或者针对将发生的缺血事件长期用药，以抑制细胞损伤或者坏死。例如，预期可以长期给予遭受短暂缺血事件的患者TNFα拮抗剂，其中短暂缺血事件经常在长时间内发生。另外，考虑TNFα拮抗剂也可以在预计缺血事件将要发生的情况下预防性用药(例如，移植手术或者血管成型术之前)。
权利要求
1.一种处理或者抑制发生缺血事件后有需要的哺乳动物中细胞损伤或者抑制其细胞死亡的方法，该方法包括给该哺乳动物提供有效量的TNFα拮抗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中的细胞损伤或者死亡起因于心肌梗塞、心肌缺血、视网膜缺血、视网膜中动脉阻塞、外周动脉阻塞、短暂缺血发作、缺血性卒中、缺血性动脉阻塞、冻疮、动脉血栓形成和阻塞或者挤压伤。
3.如权利要求1所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是一种TNF受体/免疫球蛋白融合蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其中的TNFα拮抗剂包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重链的部分或者全部恒定区。
5.如权利要求4所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是etanercept。
6.如权利要求4所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是p55TNFRFc。
7.一种处理或者抑制有需要的哺乳动物中再灌注损伤的方法，该方法包括给该哺乳动物提供有效量的TNFα拮抗剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中的损伤起因于移植手术、血管成型术、冠状动脉内支架放置、溶栓治疗、心脏瓣膜置换或者旁路手术。
9.如权利要求7所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是一种TNF受体/免疫球蛋白融合蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其中的TNFα拮抗剂包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重链的部分或者全部恒定区。
11.如权利要求10所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是etanercept。
12.如权利要求10所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是p55TNFRFc。
13.一种降低有需要的哺乳动物心肌梗塞后死亡率的方法，该方法包括给该哺乳动物提供有效量的TNFα拮抗剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是一种TNF受体/免疫球蛋白融合蛋白。
15.如权利要求14所述的方法，其中的TNFα拮抗剂包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重链的部分或者全部恒定区。
16.如权利要求15所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是etanercept。
17.如权利要求15所述的方法，其中的TNFα拮抗剂是p55TNFRFc。
18.TNFα拮抗剂在制造用于防止、处理或者抑制由于缺血事件造成的细胞损伤或者细胞死亡的药物中的用途。
19.TNFα拮抗剂在制造用于防止、处理或者抑制再灌注损伤的药物中的用途。
20.TNFα拮抗剂在制造用于降低心肌梗塞后死亡率的药物中的用途。
21.如权利要求18所述的用途，其中的细胞损伤或者死亡起因于心肌梗塞、心肌缺血、视网膜缺血、视网膜中动脉阻塞、外周动脉阻塞、短暂缺血发作、缺血性卒中、缺血性动脉阻塞、冻疮、动脉血栓形成和阻塞或者挤压伤。
22.如权利要求18-21中任一项所述的用途，其中的TNFα拮抗剂是一种TNF受体/免疫球蛋白融合蛋白。
23.如权利要求18-21中任一项所述的用途，其中的TNFα拮抗剂包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重链的部分或者全部恒定区域。
24.如权利要求18-21中任一项所述的用途，其中的TNFα拮抗剂是etanercept。
全文摘要
本发明通过提供使用TNFα拮抗剂的疗法，提供了一种处理或抑制缺血事件后细胞死亡、处理或抑制再灌注损伤、和降低心肌梗塞后死亡率的方法。
文档编号A61P43/00GK1406132SQ01804781
公开日2003年3月26日 申请日期2001年2月8日 优先权日2000年2月10日
发明者G·S·弗里德里希斯, R·E·斯维洛, B·H·－N·乔, T·R·布里达尔, R·E·努曼, L·M·瓦纳, L·M·基拉 申请人:惠氏公司