铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞f9细胞增殖药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用及铁帚清浊片的制备方法。本发明的铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用，所述铁帚清浊片由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得薯蓣皂苷元含量有很大提高。
【专利说明】铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用及铁帚清浊片的制备方法。
【背景技术】
[0002]铁帚清浊丸标准号WS-10190 (ZD-0190) 2002，记载于国家中成药标准汇编内科外科妇科分册。由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆蘚333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、获茶250g、山药250g、益智167g、英丝子250g、沙苑子250g、金楼根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成,具有清热解毒、利湿去池的功效。用于慢性前列腺炎下焦湿热证。
[0003]现有技术中，尚未有铁帚清浊丸在在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用的报道，也未见有铁帚清浊丸提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而直接粉碎、渗漉、挥发油提取， 水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004]发明目的:本发明的目的在于提供一种铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用。
[0005]本发明的另一个目的在于提供一种铁帚清浊片的制备方法。
[0006]本发明的目的是通过如下的方案实现的:
[0007]铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用，所述铁帚清浊片由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆蘚333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、获茶250g、山药250g、益智167g、英丝子250g、沙苑子250g、金楼根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成,所述铁帚清池片的制备方法由下列步骤组成:取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生药.min，萃取时间330-370min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次15-25分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。
[0008]优选的，上述的铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述铁帚清浊片的制备方法由下列步骤组成:取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.π?η，萃取时间350min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-1O大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。
[0009]现有技术中，铁帚清浊丸每次6g，一日3次。铁帚清浊丸服药量大，且丸剂味道不好，患者依从性差。采用本发明方法制备成的铁帚清浊片每片重0.5g，每次仅需3片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂，患者随水吞下即可，服药量小且无苦味，患者易于接受。
[0010]试验一、不同方法制备的铁帚清浊片中薯蓣皂苷元含量的比较
[0011]1、仪器及试药本发明铁帚清浊片:按实施例1方法制备，使用4785g原料药，经提取制成500片，每片重0.5g。原铁帚清浊丸，按照WS-10190(ZD-0190)2002标准方法制备。Agilentl200高效液相色谱仪；METTLER AE240电子分析天平；薯蓣皂苷元对照品(中国药品生物制品检定所)。
[0012]2、方法
[0013]照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。
[0014]色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇一乙腈(60:40)为流动相； 检测波长为206nm。理论板数按薯蓣皂苷元峰计算应不低于3000。
[0015]对照品溶液的制备精密称取在60°C减压干燥4小时的薯蓣皂苷元对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.15mg的溶液，即得。
[0016]供试品溶液的制备取本品20片，研细，取0.25g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加2mol/L硫酸溶液30ml，加热回流2小时，取出，冷却，滤过，用适量水洗涤容器及滤渣，滤洛烘干(70~80°C ),用氯仿加热回流3次(20ml、15ml、15ml),每次15分钟,滤过,合并滤液，挥干氯仿，残渣加流动相适量使溶解，转移至IOml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得。
[0017]对照产品供试品溶液的制备取本品10g，精密称定，研细，取0.50g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加2mol/L硫酸溶液30ml，加热回流2小时，取出，冷却，滤过，用适量水洗涤容器及滤渣，滤渣烘干(70~80°C)，用氯仿加热回流3次(20ml、15ml、15ml)，每次15分钟，滤过，合并滤液，挥干氯仿，残渣加流动相适量使溶解，转移至IOml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得。
[0018]含粉萆蘚以薯蓣皂苷元(C27H42O3)计，不得少于0.030mg。
[0019]3、结果
[0020]结果表明，本发明铁帚清浊片中薯蓣皂苷元的含量为1.2-2.4mg/片；而原铁帚清浊丸中薯蓣皂苷元的含量为0.32mg/g，每次服用量3片的薯蓣皂苷元含量为原丸剂IOg含量的4-8倍，在服用量减少的情况下，薯蓣皂苷元含量有很大提高。
[0021]上述研究表明，采用本发明制备方法制备的铁帚清浊片，有效成分含量远远高于WS-10190 (ZD-0190) 2002标准记载的方法制备的铁帚清浊丸。
【具体实施方式】[0022]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0023]实施例1
[0024]取猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆蘚333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、获茶250g、山药250g、益智167g、英丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g，将铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.min，萃取时间350min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重
0.5g。
[0025]经检测，成品中薯蓣皂苷元的含量为2.38mg/片。
[0026]实施例2
[0027]取猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆蘚333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、获茶250g、山药250g、益智167g、英丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g，将铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30°C，CO2流量lml/g生药.min，萃取时间370min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次15分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重
0.5g。
[0028]经检测，成品中薯蓣皂苷元的含量为1.27mg/片。
[0029]实施例3
[0030]取猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆蘚333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、获茶250g、山药250g、益智167g、英丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g，将铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50°C，CO2流量3ml/g生药.min，萃取时间3300min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次25分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重 0.5g。
[0031]经检测，成品中薯蓣皂苷元的含量为1.84mg/片。[0032]实施例4:铁帚清浊片抑制小鼠畸胎瘤细胞F9细胞增殖的实验研究资料
[0033]1.实验材料
[0034]1.1实验用细胞株
[0035]小鼠畸胎瘤细胞F9细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0036]1.2实验药物
[0037]研究药物:本发明铁帚清浊片:按实施例1方法制备。
[0038]药液储液:称取IOOmg铁帚清池片，溶于5ml无水乙醇中，0.2 μ m滤器过滤，500 μ Idoff管分装，-20°c存储，同时0.2 μ m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0039]1.3实验试剂
[0040]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇(溜博亚杜兰经贸有限公司)；MTT (Biosharp 批号:0793) =PBS (实验室自配)；
[0041]1.4实验器材
[0042]莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190);C02培养箱(F0RMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号=SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:ΚΑ-1000);0.2μπι滤器(MILLIP0RE 型号:SLGP033RB);lcm 培养皿(NEST 公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0043]2.实验方法
[0044]1)F9细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养(10cm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶_0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X IO4个/ml。
[0045]2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 μ 1，培养板放入细胞培养箱中(37°C，5%C02)常规培养。
[0046]3)根据细胞生长情况， 一般长至50%_70%，加入铁帚清浊片溶液，继续培养24h。
[0047]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，继续培养 4h。
[0048]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0049]6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0050]7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
[0051]3.统计处理[0052]采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean+ S.D.表不。
[0053]4.实验结果
[0054]MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对F9细胞增殖抑制有差异(p〈0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P〈0.001)。
[0055]表1铁帚清浊片对F9细胞增殖抑制影响研究(X土 SD)
[0056]
【权利要求】
1.铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用，所述铁帚清浊片由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆蘚333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、获茶250g、山药250g、益智167g、英丝子250g、沙苑子250g、金楼根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成，其特征在于，所述铁帚清浊片的制备方法由下列步骤组成:取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min，萃取时间330_370min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次15-25分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-1O大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。
2.根据权利要求1所述的铁帚清浊片在制备抑制畸胎瘤细胞F9细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述铁帚清浊片的制备方法由下列步骤组成:取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.π?η，萃取时间350min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分钟，合并萃取液，浓缩,加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.·5g。
【文档编号】A61K36/9062GK103705825SQ201310752728
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】孙亚平 申请人:孙亚平