专利名称：Oct4b蛋白异构体的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种0CT4B蛋白异构体的新用途。
背景技术：
0CT4是由P0U5F1基因编码的一类同源域转录因子，典型的0CT4主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞和具有分化潜能的畸胎瘤细胞中，是维持胚胎干细胞自我更新能力与全能性的关键转录因子。0CT4的缺失或者过量表达都会引起胚胎干细胞的分化。同时，0CT4也是体外诱导全能干细胞技术中最为关键的因子。人的0CT4基因可以通过选择性剪切形成三种mRNA异构体，0CT4A，0CT4BI和0CT4B。其中0CT4A可以生成典型的360个氨基酸的0CT4A蛋白，对维持ES细胞自我更新和多能性起关键作用。0CT4B1可以通过剪切形成0CT4B，并且被预测可产生一类截断的蛋白。0CT4B可以产生多个异构体，其中0CT4B-190被证明在细胞应激条件下具有抗凋亡功能，而其他异构体(如0CT4-265，0CT4-164)的生物学功能大多还不能明确。
发明内容
本发明的一个 目的是提供0CT4B-265蛋白的一种应用。本发明提供的应用为0CT4B-265蛋白在制备细胞凋亡促进剂中的应用或在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；所述0CT4B-265蛋白为如下I)或2):1)序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指为了满足不同机体内蛋白高表达而进行不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述应用中，2)所示0CT4B-265蛋白为序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述细胞凋亡是由细胞凋亡引发剂引起的；所述细胞凋亡引发剂为具有基因毒性的刺激物；所述具有基因毒性的刺激物具体为丝裂霉素C。上述应用中，所述细胞为表达0CT4B-265蛋白的离体细胞，所述肿瘤为乳腺癌；所述表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为内源表达0CT4B-265蛋白的离体细胞和外源表达0CT4B-265蛋白的离体细胞；所述内源表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为离体的人胚胎干细胞hES (H9)、离体的人畸胎瘤PA-1或离体的畸胎瘤细胞NTERA-2 ；所述外源表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞。上述应用中，所述应用为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞；所述转基因细胞的细胞凋亡率大于所述宿主细胞。上述应用中，所述0CT4B-265蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4或序列表中序列2 ;所述宿主细胞为离体的乳腺癌细胞系MCF-7。上述应用中，所述0CT4B-265蛋白的编码基因通过含有0CT4B-265蛋白的编码基因的重组腺病毒导入宿主细胞，上述重组腺病毒可由北京诺赛基因公司合成。上述0CT4B-265蛋白在促进细胞凋亡中的应用也是本发明保护的范围。含有上述0CT4B-265蛋白的编码基因的重组载体或重组腺病毒也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供抑癌基因p53的抑制剂的一个应用。本发明提供的应用为在抑癌基因p53的抑制剂在制备细胞凋亡抑制剂或抑制细胞凋亡的应用也是本发明保护的范围。在上述应用中，所述抑癌基因p53的抑制剂为核苷酸A ;所述核苷酸A为由序列表中序列5所示的正向序列和序列表中序列6所示的反向序列组成的双链核苷酸。在上述应用中，所述抑制细胞凋亡通过降低细胞中所述0CT4B-265蛋白表达量实现；在上述应用中，所述细胞为表达0CT4B-265蛋白的离体细胞，所述表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞；所述宿主细胞具体为离体的乳腺癌细胞系MCF-7。在上述应用中，所述应用为将上述的核苷酸A导入上述转基因细胞中，得到目的细胞；所述目的细胞凋亡率小于所述转基因细胞。本发明的第三个目的是提供一种抑制细胞中0CT4B-265蛋白表达的方法。
本发明提供的方法为干扰细胞中的抑癌基因p53的表达，实现抑制离体细胞中0CT4B-265蛋白表达；所述抑癌基因p53的核苷酸序列为序列表中的序列7。在上述方法中，所述干扰离体细胞中的抑癌基因p53的表达通过将核苷酸A导入细胞实现；所述细胞为表达0CT4B-265蛋白的离体细胞，所述表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为离体的人畸胎瘤PA-1细胞或离体细胞A ;所述离体细胞A为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞；所述宿主细胞具体为离体的乳腺癌细胞系MCF-7。本发明的实验证明，本发明首次鉴定了 0CT4B-265蛋白特异在干细胞中的表达，并首次揭示了 0CT4B-265蛋白在细胞基因毒性应激反应中促进细胞凋亡的功能，并且这一应激反应受到抑癌基因P53的调节。鉴于0CT4B-265蛋白的重要的生物学功能和特异的表达模式，该蛋白可能作为一个靶点进行药物设计，或者作为病理检测标记蛋白，在临床上有重要的应用价值。此外，应用0CT4B-265蛋白在基因毒性应激条件下促进细胞凋亡这一特点，可能有效地用于防治干细胞移植治疗过程和胚胎发育过程中受到的基因损伤毒害。
图1为0CT4B-265蛋白在基因毒性损伤应激反应中的表达图2为0CT4B-265蛋白的亚细胞定位图3为0CT4B-265蛋白转基因细胞系鉴定图4为0CT4B-265蛋白的功能及所受调节
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、在细胞应激条件下不同细胞系中0CT4B-265蛋白的表达及其亚细胞定位0CT4B-265蛋白是0CT4B mRNA以ATG为起始密码子翻译而成的具有265个氨基酸的蛋白异构体，其氨基酸序列为序列表中的序列1，其cDNA的全长序列为序列表中的序列2，整个开放读码框全长798个碱基。一、在细胞应激条件下不同细胞系中0CT4B-265蛋白的表达NTERA-2、MCF_7、293T、PA-1、H印G2、RT-4细胞细胞系购自北京协和细胞中心；资源编号依次分别为 3111C0001CCC000019、3111C0001CCC000013、3111C0001CCC000091、3111C0001CCC000021、3111C0001CCC000035、3131C0001001200015 ；人胚胎干细胞细胞系(hES) H9购自中科院上海生科院生化细胞所干细胞技术平台购买。上述细胞用的培养基具体如下:NTERA-2, MCF-7 和 293T 细胞培养基均为在 Dulbecco’ s modified Eagle’ s培养基中(DMEM,添力[]10 % FBS(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham,MA)中添力口 glutamine (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) > sodiumpyruvate (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA)、non-essential amino acids(Gibco,Invitrogen, Carlsbad, CA)、penicillin (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham,MA)、streptomycin (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)得到的培养基；glutamine 的终浓度为 2mM, sodiumpyruvate 的终浓度为 ImM, non-essential amino acids的终浓度为1%，penicillin的终浓度为100U/ml、streptomycin的终浓度为100u g/ml。PA-1和IfepG2细胞培养基均为在MEM/EBSS培养基中添加glutamine、sodiumpyruvate、non-essential amino acids、penicillin、streptomycin 得到的培养基；glutamine 的终浓度为 2mM，sodium pyruvate 的终浓度为 ImM，non-essential amino acids的终浓度为I%，penicillin的终浓度为100U/ml、streptomycin的终浓度为100u g/ml。RT4 细胞培养基为在 McCOY’s 5a 培养基中(Hyclone，SH30200.01，Thermo FisherScientific，Waltham, MA)添加 glutamine、sodium pyruvate、non-essential aminoacids、penicillin、streptomycin 得到的培养基；glutamine 的终浓度为 2mM，sodiumpyruvate 的终浓度为 ImM,non-essential amino acids 的终浓度为 I%，penicillin 的终浓度为 100U/ml、streptomycin 的终浓度为 IOOu g/ml。hES细胞系培养基为在DMEM培养基中添加FBS、bFGF、^ -巯基乙醇、glutamine、sodium pyruvate、non-essential amino acids、penicillin、streptomycin 得到的培养基；FBS的终浓度为20% ；bFGF的终浓度为lOng/ml，P -巯基乙醇的终浓度为0.1mM,glutamine 的终浓度为 2mM，sodium pyruvate 的终浓度为 ImM，non-essential amino acids的终浓度为I%，penicillin的终浓度为100U/ml、streptomycin的终浓度为100u g/ml。所有细胞均按标准培养方法进行培养。
将上述细胞NTERA-2、MCF_7、293T、PA_1、H印G2、RT-4和H9分别进行如下三组基因毒性损伤处理:丝裂霉素C 处理组(mmc):将细胞 NTERA-2、MCF_7、293T、PA-UHepG2, RT-4 和 H9分别在含有丝裂霉素C(GR_311,Enzo Life Sciences International Inc.)的细胞培养基中培养，丝裂霉素C在含有丝裂霉素C的细胞培养基中的浓度为5 ii g/ml ；多柔比星处理组(dox):将NTERA-2细胞在含有多柔比星(GR-319，Enzo LifeSciences International Inc.)的细胞培养基中培养,多柔比星在含有多柔比星的细胞培养基中的浓度为I U g/ml ；紫外照射处理组(PA-1UV):将PA-1细胞在0-50J/m2剂量的紫外照射下培养。上述三组均用不进行上述各处理而正常培养的细胞作为对照(Ctrl)。培养12小时之后，收集上述三组处理的细胞，分别用添加蛋白酶抑制剂(P8340，Sigma-Aldrich, I: 100 稀释)的 RIPA 裂解液(R0278, SIGMA-ALDRICH)裂解(冰上裂解半小时)各组细胞，在4°C条件下离心(12000g离心30分钟)，分别收集上清液。将上述上清液在12%的SDS-PAGE上进行电泳，随后转膜到PVDF膜上，膜用TBST溶液稀释的10%奶粉室温封闭2小时，随后进行一抗孵育(0CT4B-265抗体:SC_8629 (SantaCruz Biotechnology Inc) 1: 1000稀释)和偶联辣根过氧化物酶的二抗(DonkeyAnt1-Goat, sc-2020 (SantaCruz) 1: 10000)孵育。以 0CT4A (— 抗为 0CT4B-265 抗体:SC-8629 (Santa Cruz BiotechnologyInc) 1: 1000 稀释；二抗为 Donkey Ant1-Goat, sc-2020 (SantaCruz) 1: 10000)和Tubulin (Tubulin 的抗体:T5168 (Sigma-Aldrich) 1: 3000。二抗为:Goat Ant1-Mouse,1030-05 (SouthernBiotech) I: 10000)为参照对照。所用的发光底物为SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce, Thermo Fisher Scientific)。结果如图1所示，A为受到丝裂霉素C(mmc)、多柔比星(D0X，又名阿霉素)和紫外辐照(UV)应激处理时部分细胞中0CT4B-265蛋白的表达，可以看出，在丝裂霉素C (mmc)处理下，0CT4B-265蛋白在畸胎瘤细胞系NTERA-2，PA-1以及人胚胎干细胞H9 (hES)中的均有表达(大小为34KD左右)，且与不进行处理的对照相比，表达量高；在紫外辐照(UV)处理下，0CT4B-265蛋白在PA-1细胞中有表达，且与不进行处理的对照相比，表达量高；B为受到丝裂霉素C(mmc)应激处理时部分细胞中0CT4B-265蛋白的表达，可以看出，在受到丝裂霉素C(mmc)应激处理时，0CT4B-265蛋白在人畸胎瘤PA-1中有表达，且0CT4B-265蛋白在人畸胎瘤PA-1表达量高于不进行处理的对照(ctrl);在乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系H印G2、肾上皮细胞系293T细胞和膀胱癌细胞系RT-4无论是否应激处理，均无0CT4B-265蛋白表达。从上述可以看出，细胞受到基因毒性刺激损伤处理后，内源性的0CT4B-265蛋白在人胚胎干细胞hES(H9)、人畸胎瘤PA-1和畸胎瘤细胞NTERA-2中相对表达量都有增加。研究表明 0CT4B-265蛋白是一个基因毒性应激相关蛋白，细胞中内源性的0CT4B-265蛋白在应激过程中上调，而且这种现象仅限于如胚胎干细胞和畸胎瘤细胞等具有多能性的细胞中。
二、0CT4B-265蛋白的亚细胞定位对0CT4B-265表达序列进行了点突变，以消除OCTB其他异构体蛋白的表达，得到0CT4B-265(m)，突变后的氨基酸为序列表中的序列3，核苷酸序列为序列表中的序列4，其中序列3为将序列I自N末端第102的Met突变为Val得到的氨基酸序列；序列4为将序列2的第226-228的CTG突变为CTT，且将序列2的第304-306位ATG突变为GTC得到的核苷酸序列。1、表达GFP的载体的获得制备GFP，其核苷酸序列为序列8 ；表达GFP的载体为将GFP (序列8)插入pQCXIN穿梭载体(ClontechLaboratories, Inc.)的 BamHI和EcoRI酶切位点间得到的载体命名为pQCXIN_GFP。2、融合表达GFP和0CT4B-265表达载体的构建I)、制备序列1，以下引物进行PCR扩增:正向引物:5，-0CT4B-265ATG5，-ATTACCGGIATGCACTTCTACAGACT-3’ (AgeI 酶切位点被标出);反向引物:3，-QC45，-AGTCGTACGTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (BsiffI酶切位点被标出)，得到798bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中列I。2)、将上述PCR产物经过AgeI和BsiWI酶切，与经过同样酶切的pQCXIN-GFP连接，得到重组载体，PQCXIN-0CT4B-265-GFP。3) 一次突变以pQCXIN-GFP-0CT4B-265 为模板，以 5’ -0CT4B-265ATG 作为正向引物，3’ -0CT4B-190m 5’ -AAATAGAACCCCAAGGGTGAGCC-3’(突变位点 226-228，CTG 变成 CTT)作为反向引物，进行一次PCR扩增，得到一次PCR产物。再在一次PCR产物中加入3’ -0C4进行二次PCR扩增，得到一次突变的PCR产物；4) 二次突变以上述一次突变的PCR产物为模板，以5’ -0CT4B-265ATG作为正向引物，3’ -0CT4B-164m 5’ -CCGCAGCTTACAGACGITCTTGA-3’(突变位点 304-306，ATG 变成 GTC)为反向引物，行一次PCR扩增，得到一次PCR产物。再在一次PCR产物中加入3’ -0C4进行二次PCR扩增，得到二次突变PCR产物。5) pQCXIN-GFP-0CT4B-265 (m)的获得将步骤4)得到的二次突变PCR产物产物经过AgeI和BsiWI酶切，与同样经过酶切的pQCXIN-GFP连接，得到重组质粒为pQCXIN-0CT4B-265-GFP (m)，经过测序，该质粒为将序列表中的序列4所示的核苷酸插入pQCXIN-GFP的AgeI和BsiWI位点间得到的载体。3、0CT4B_265蛋白的亚细胞定位将上述的载体pQCXIN-0CT4B-265-GFP (m)和 pQCXIN-GFP 用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad)转染试剂分别转染到 MCF-7 细胞中，得到MCF-7/pQCXIN-0CT4B-265-GFP(m)和 MCF_7/pQCXIN_GFP，转染后 24 小时进行如下两组处理:正常处理:将细胞MCF-7/pQCXIN-0CT4B-265-GFP(m)和MCF-7/pQCXIN-GFP 在细胞培养基中培养12小时，得到265 (ctrl)和GFP (ctrl)；丝裂霉素C 处理:将细胞 MCF-7/pQCXIN-0CT4B-265-GFP (m)和 MCF-7/pQCXIN-GFP在含有丝裂霉素C (GR-311, Enzo Life Sciences International Inc.)的细胞培养基中培养12小时，丝裂霉素C在含有丝裂霉素C的细胞培养基中的浓度为5 u g/ml，得到265 (mmc)和 GFP(mmc)。用荧光显微镜观察结果如图2所示，265代表转染0CT4B-265组，mmc代表丝裂霉素C处理组；从图中看出，正常状态(正常处理)下，265 (ctrl)中0CT4B-265蛋白在细胞核和细胞质中都有分布；当受到基因毒性损伤(丝裂霉素C处理)时，265 (mmc)中0CT-265蛋白倾向于在核内聚集。实施例2、0CT4B-265蛋白促进细胞凋亡1、腺病毒转染从北京诺赛基因公司购买了含有0CT4B_265(m)蛋白的编码基因腺病毒(0CT4B-265 (m)蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4)和阴性对照病毒；病毒的滴度均为 lX101Qpfu/ml。按照生产厂家标准步骤将稀释为不同滴度(M0I = 70和MOI = 35)的含有0CT4B-265 (m)蛋白的编码基因腺病毒和阴性对照病毒(M0I = 35)转染MCF-7细胞，分别得到不同滴度(M0I = 70和MOI = 35)转染的转基因细胞V-265和对照组V_null细胞。上述转染36小时的不同滴度(M0I = 70和MOI = 35)转染的转基因细胞V-265和对照组V~null 细胞在含有丝裂霉素C(GR_311,Enzo Life Sciences International Inc.)的细胞培养基中分别培养，丝裂霉素C在含有丝裂霉素C的细胞培养基中的浓度为5 u g/ml ;12小时后，得到不同滴度(M0I = 70和MOI = 35)转染的V_265c和V-nullc ;以不进行应激处理为对照，得到不同滴度(M0I = 70和MOI = 35)转染的V-265和V_null ;以丝裂霉素C处理PA-1细胞作为阳性对照(PA-1mmc)。将上述不同滴度 (M0I = 70和MOI = 35)转染的V_265c和V_null C、不同滴度(M0I = 70和MOI = 35)转染的V-265和V-null各组细胞进行western blotting鉴定(提取蛋白和鉴定的方法同实施例1中的一)，结果如图3所示，V-null代表空病毒，MOI代表病毒的滴度，MMC代表丝裂霉素处理，CTRL代表不进行应激处理的正常细胞；可以看出，不同滴度转染的V-265c和不同滴度的V-265均有目的蛋白的表达，说明得到阳性的转基因细胞 V-265。2、细胞凋亡率检测将上述I中得到的且鉴定为阳性的V-265c(M0I = 35), V-null c (MOI = 35)、V-265 (MOI = 35)和V-null (MOI = 35)分别用约I X IO6个细胞进行凋亡检测，具体用北京四正柏公司的Annexin V-FITC (检测早期凋亡)和PI (检测晚期凋亡)双染试剂盒(SiZhengBai, Beijing, China)以及南京凯基生物的Annexin V-APC和7-AAD凋亡试剂盒对细胞样品进行标记，按照说明书的标准步骤，然后将标记好的细胞用FACS-LSR流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测细胞凋亡率。实验重复三次，结果取平均值土标准差。结果如图4A1和图4B所示，其中，图4A1为V-265组和对照组V_null在受到丝裂霉素C处理后的凋亡率；丝裂霉素C处理后V-265组(V-265c)的凋亡率为26.38 ±1.38%;丝裂霉素C处理后对照组V-null (V-null c)的凋亡率为21.64±0.79% ;从上述看出，过量表达0CT4B-265蛋白的MCF-7细胞在基因毒性损伤过程中的凋亡率比对照组细胞的凋亡率显著升高。图4B为Al的流式细胞检测散点图，其中c代表经过丝裂霉素C的处理，可以看出，过量表达0CT4B-265蛋白的MCF-7细胞在基因毒性损伤过程中的凋亡率比对照组细胞的凋
亡率显著升高。实施例3、与0CT4B-265蛋白表达相关基因1、小干扰RNA转染对过量表达0CT4B-265蛋白的MCF-7细胞凋亡率的影响人的P53抑癌基因的核苷酸为序列表中的序列7。人的P53小干扰RNA购自上海吉玛公司，其正向序列为:5’CUACUUCCUGAAAACACGdTdT 3’(序列 5);反向序列为:5’CGUUGUUUUCAGGAAGUAGdTdT3’(序列6)。按照说明书的标准步骤,利用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)转染试剂，将人的P53小干扰RNA转染到由实施例2的I得到的转基因细胞V-265(经过鉴定为阳性，MOI = 35)中，得到转基因细胞 p531-V-265(MCF-7)；对照p531-V-null细胞(MCF-7):将人的p53小干扰RNA转染到由由实施例2的I得到的对照组V-null细胞中，得到对照p531- V-null细胞(MCF-7)；将上述转基因细胞p531-V-265 (MCF-7)和对照p531-V_null细胞(MCF-7)进行western blot检测细胞内磷酸化p53和总p53的量,提取蛋白的方法同实施例1中的一，p-p53 的一抗为 ab-1431 (Abcam)抗体，1: 1000 稀释；二抗为 Goat Ant1-Rabbit,1858415 (Pierce) I: 3000 ;total_p53 的一抗为 ab-7757 (Abeam)，I: 1000 稀释，二抗为Goat Ant1-Mouse,1030-05(SouthernBiotech) 1: 10000。结果为细胞内有磷酸化p53和总p53表达的为阳性转基因细胞p531-V-265 (MCF-7)和阳性对照 p53i_V_null 细胞(MCF-7)(与图 4C 的 p53i ctrl 一致)。将上述鉴定阳性的且转染后36小时得到的转基因细胞p531-V_265 (MCF-7)和对照p531-V-null细胞(MCF-7)在含有丝裂霉素C(GR_311，Enzo LifeSciencesInternational Inc.)的细胞培养基中培养，丝裂霉素C在含有丝裂霉素C的细胞培养基中的浓度为5 ii g/ml ；12小时后，得到p531-V-265c和p531-V_null c ；将上述得到的p531-V_265c和p531-V_null c分别用约I X IO6个细胞进行凋亡检测，具体用北京四正柏公司的Annexin V-FITC(检测早期凋亡)和PI (检测晚期凋亡)双染试剂盒(SiZhengBai, Bei jing, China)以及南京凯基生物的Annexin V-APC和7-AAD凋亡试剂盒对细胞样品进行标记，按照说明书的标准步骤，然后将标记好的细胞用FACS-LSR流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测细胞凋亡率。结果如图4A2 所示，为 p531-v_265 (MCF-7)和对照组 p531-V_null (MCF-7)组在受到丝裂霉素C处理后的凋亡率；丝裂霉素C处理后p531-V-265 (MCF-7, p531-V_265c)的凋亡率为15.83%;丝裂霉素C处理后对照组p531-V-null(MCF-7，p531-V-null c)的凋亡率为14.67% ;可以看出，与图4A1的丝裂霉素C处理后V-265组和对照组V-nul I相比，本实验转入P53小干扰RNA的p531-V-265和p531-V_null的凋亡率均降低；说明外源转入的0CT4B-265蛋白表达受到抑癌基因p53的调节。2、小干扰RNA转染对PA-1中内源0CT4B-265蛋白表达的影响按照上述I的方法将人的p53小干扰RNA转染到PA-1细胞，得到p53i (PA-1)，然后进行如下处理:正常处理:将p53i (PA-1)细胞和PA-1细胞在细胞培养基中培养12小时，得到p53i ctrl 和 ctrl ；丝裂霉素C处理:将p53i (PA-1)细胞和PA-1细胞在含有丝裂霉素C的细胞培养基中培养12小时，丝裂霉素C在含有丝裂霉素C的细胞培养基中的浓度为5 u g/ml，得到p53i mmc 和 mmc。将处理12小时后的p53i ctrl和ctrl、p53i mmc和mmc分别按照实施例1的一的方法进行裂解细胞，Western Blot检测，一抗为0CT4B-265抗体，二抗为 Donkey Ant1-Goat, sc-2020 (SantaCruz) 1: 10000。 以 p-p53 ( —抗为 ab-1431 (Abcam)抗体，1: 1000 稀释；二抗为 Goat Ant1-Rabbit,1858415 (Pierce)I: 3000)、total_p53( — 抗为 ab-7757 (Abeam)，I: 1000稀释，二抗为 Goat Ant1-Mouse,1030-05(SouthernBiotech) 1: 10000)和Tubulin (Tubulin 的抗体:T5168 (Sigma-Aldrich) 1: 3000, 二抗为 Goat Ant1-Mouse,1030-05 (SouthernBiotech) I: 10000)为内参对照。结果如图4C所示，可以看出，p53i(PA_l)细胞内有磷酸化p53和总p53表达，说明为阳性转基因细胞，无论是否经过丝裂霉素C处理，p53i (PA-1)细胞比PA-1细胞中0CTB-265蛋白表达量降低，说明内源的0CT4B-265蛋白表达受到抑癌基因p53的调节。上述可以看出，在细胞中过量表达0CT4B-265蛋白，可以增加细胞在应激基因毒性损伤中的凋亡率，且0CT 4B-265蛋白的表达受到抑癌基因p53的调节。
权利要求
1.0CT4B-265蛋白在制备细胞凋亡促进剂中的应用或在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；所述0CT4B-265蛋白为如下I)或2):1)序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于: 2)所不0CT4B-265蛋白为序列表中序列3所不的氣基酸序列组成的蛋白质； 所述细胞凋亡是由细胞凋亡引发剂引起的；所述细胞凋亡引发剂为具有基因毒性的刺激物；所述具有基因毒性的刺激物具体为丝裂霉素C。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于: 所述细胞为表达0CT4B-265蛋白的离体细胞， 所述肿瘤为乳腺癌； 所述表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为内源表达0CT4B-265蛋白的离体细胞和外源表达0CT4B-265蛋白 的离体细胞； 所述内源表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为离体的人胚胎干细胞hES(H9)、离体的人畸胎瘤PA-1或离体的畸胎瘤细胞NTERA-2 ； 所述外源表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述应用为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞；所述转基因细胞的细胞凋亡率大于所述宿主细胞。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于:所述0CT4B-265蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4或序列表中序列2。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于:所述宿主细胞为离体的乳腺癌细胞系MCF-7。
7.抑癌基因p53的抑制剂在制备细胞凋亡抑制剂或抑制细胞凋亡的应用；所述抑癌基因P53的抑制剂为核苷酸A ;所述核苷酸A为由序列表中序列5所示的正向序列和序列表中序列6所示的反向序列组成的双链核苷酸。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于: 所述抑制细胞凋亡通过降低细胞中所述0CT4B-265蛋白表达量实现； 所述细胞为表达0CT4B-265蛋白的离体细胞，所述表达0CT4B-265蛋白的离体细胞具体为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞；所述宿主细胞具体为离体的乳腺癌细胞系MCF-7。
9.一种抑制细胞中0CT4B-265蛋白表达的方法，为干扰细胞中的抑癌基因p53的表达，实现抑制细胞中0CT4B-265蛋白表达；所述抑癌基因p53的核苷酸序列为序列表中的序列7。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述干扰细胞中的抑癌基因p53的表达通过将所述的核苷酸A导入细胞实现； 所述细胞为表达OCT4B-265蛋白的离体细胞，所述表达OCT4B-265蛋白的离体细胞具体为离体的人畸胎瘤PA-1细胞或离体细胞A ;所述离体细胞A为将0CT4B-265蛋白的编码基因导入宿主细胞中，得到转基因细胞；所述宿主细胞具体为离体的乳 腺癌细胞系MCF-7。
全文摘要
本发明公开了一种OCT4B蛋白异构体的新用途，本发明提供的应用为OCT4B-265蛋白在制备促进细胞凋亡的产品中的应用；所述OCT4B-265蛋白为如下1)或2)1)序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明首次鉴定了OCT4B-265蛋白特异在干性细胞中的表达，并首次揭示了OCT4B-265蛋白在细胞基因毒性应激反应中促进细胞凋亡的功能，并且这一应激反应受到抑癌基因p53的调节。
文档编号A61K48/00GK103191413SQ20121000182
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者肖志峰, 陈冰, 王霞, 高原, 魏建树, 韩津, 戴建武 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所