电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于蛋白凝胶电泳分离领域，具体涉及电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒。该电泳分离方法是基于酸性条件下Cu2+与蛋白质中氨基酸残基的选择性配位作用，使得蛋白质不仅由碱性氨基酸残基的质子化带上正电荷，而且还由金属离子的选择性配位作用使相似氨基酸序列组蛋白异构体带上不同的正电荷，施加直流电后，带不同正电荷的组蛋白异构体具有不同迁移速率，从而得以分离；一维电荷分离后，可进一步进行SDS-PAEG凝胶电泳，利用电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳实现对组蛋白异构体的分离。本发明电泳分离方法操作过程简单，分辨率高，成本低，克服了现有技术中等电点聚焦电泳容易发生蛋白质沉淀以及对组蛋白异构体分析的局限性。
【专利说明】电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白凝胶电泳分离领域，具体涉及电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]组蛋白是真核细胞染色质中的碱性蛋白，也表观遗传的物质基础，大量研究表明组蛋白与许多人类重大疾病的发生发展密切相关，因此组蛋白的分离和鉴定对认识基本生理病理过程具有重要意义。然而，各种组蛋白异构体结构非常相似，而且存在大量翻译后修饰，这使分析技术面临很大挑战。
[0003]现有的凝胶电泳技术中，一般采用等电点聚焦进行第一维分离，再采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二维质量分离。等电点聚焦的缺点主要有两个方面:
(I)碱性蛋白的分辨能力差；(2)蛋白质容易沉淀。而且，组蛋白不同异构体的分子量非常相似，这使得第二维的质量分离能力也受到影响。
【发明内容】
[0004]本发明的发明目的是针对现有技术的不足，提供电荷-质量聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒。本发明所述电泳分离方法可以将组蛋白异构体从蛋白样品中有效的分离出来。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0007]( I)组蛋白生物样品预处理:配制样品质子化缓冲溶液，将组蛋白生物样品溶解于所述样品质子化缓冲溶液中，得到质子化组蛋白生物样品溶液；再向质子化组蛋白生物样品溶液中加入CuSO4溶液，使Cu2+与组蛋白充分结合，得到组蛋白生物样品上样液；
[0008](2)第一维电荷电泳分离:制备吐温-醋酸-尿素浓缩胶和吐温-醋酸-尿素分离胶，采用常规电泳系统进行第一维电荷电泳分离，将步骤(1)得到的组蛋白生物样品上样液加样至上样口，施加电压开始电泳，电泳结束后，得到第一维电荷电泳分离凝胶胶条；
[0009](3)将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行脱色和染色后得到第一维电荷电泳分离电泳图；或者将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条切下后横放于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶上，加入指示剂，进行第二维SDS-PAGE质量电泳分离，电泳结束后，得到电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条，所述电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条经染色和脱色后得到电荷-质量二维电泳分离凝胶电泳图。
[0010]上述方案中，所述样品质子化缓冲溶液的各组分配比为:尿素0.36g，冰醋酸50 μ I，0.2wt%派洛宁Y溶液60 μ I，加水定容至600 μ L.
[0011]上述方案中，所述质子化组蛋白生物样品溶液配制过程中每Img组蛋白生物样品所需要的样品质子化缓冲溶液的体积为200~1000 μ I。
[0012]上述方案中，所述CuSO4溶液的浓度为40 μ g/ μ I，所述CuSO4溶液与组蛋白质子化生物样品溶液按照质量比为I~5:1的比例混合。
[0013]上述方案中，步骤(2)所述的第一维电荷电泳分离的电泳条件为:首先采用30伏电压运行I小时，待上样液浓缩成一条直线后，再采用100伏电压运行150分钟。
[0014]上述方案中，步骤(2)中所述吐温-醋酸-尿素浓缩胶的各组分配比为:含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250 μ 1、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30 μ I和10wt%过硫酸铵140 μ I ;步骤(2)中所述吐温-醋酸-尿素分离胶的各组分配比为:尿素3.6g、含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500 μ 1、蒸馏水3.73ml、10vt% (体积百分比)吐温-100370 μ 1、四甲基二乙胺60 μ I和10wt%S硫酸铵 280 μ I。
[0015]上述方案中，步骤(2)所述第一维电荷电泳分离的电泳液为5vt%醋酸水溶液。
[0016]上述方案中，将步骤(3)所述第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行染色的染色液各组分配比为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%，所述甲醇和水的体积比为1:1 ;将步骤(3)所述的第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行脱色的脱色液各组分配比为:甲醇50wt%、NH4HC035wt%和水45wt%。 [0017]上述方案中，所述第二维SDS-PAGE质量电泳分离的电泳条件为:采用70伏电压运行I小时，然后改变电压至120伏继续电泳，当指示剂跑出电泳槽，停止电泳。
[0018]上述方案中，步骤(3)所述指示剂的各组分配方为:1.25ml0.5M Tris-HCl溶液，
2.50ml甘油，2.0mll0wt%+二烷基磺酸钠溶液，0.2ml0.5wt%溴酚蓝溶液，50 μ IlM 二硫苏糖醇溶液，加水定容至1ml。
[0019]电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳试剂盒,包括如下12种试剂:
[0020]试剂I为样品质子化缓冲溶液，其各组分配比为:尿素0.368，冰醋酸5(^1，0.2wt%派洛宁Y溶液(Pyronin Y) 60 μ 1，加水定容至600 μ I ；
[0021 ] 试剂2为CuSO4溶液，所述CuSO4溶液的浓度为40 μ g/ μ I ;
[0022]试剂3为吐温-醋酸-尿素浓缩胶，其各组分配比为:含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250 μ 1、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30 μ I和10wt%过硫酸铵140 μ I ；
[0023]试剂4吐温-醋酸-尿素分离胶，其各组分配比为:尿素3.6g、含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500μ 1、蒸馏水3.73mlU0vt%吐温-100370 μ 1、四甲基二乙胺60 μ I和10wt%过硫酸铵280 μ I ;
[0024]试剂5为第一维电荷分离电泳的电泳液，其组分为:5vt%醋酸水溶液；
[0025]试剂6为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的电泳液，其各组分配比为:Tris碱30.3g、甘氨酸144g、十二烷基磺酸钠10g，加水定容至1L，充分溶解后再稀释10倍；
[0026]试剂7为第二维SDS-PAGE质量分离电泳分离胶，其各组分配比为:含30wt%丙烯酰胺和0.8wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液6ml，pH为8.8的Tris_HCl/SDS溶液3.75ml，蒸馏水3.75ml,四甲基二乙胺10 μ 1，10wt%过硫酸铵50 μ 1，所述pH为8.8的Tris_HCl/SDS溶液的配制方法为:将91g Tris碱溶解于300ml水中，滴加IM的HCl溶液，调节其pH至
8.8,加入2g十二烷基磺酸钠,溶解后加水定容至500ml ；
[0027]试剂8为第一维电荷分离电泳的染色液，其各组分配比为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%，所述甲醇和水的体积比为 1:1 ;
[0028]试剂9为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的染色液，其各组分配比为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇、水和醋酸的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%，所述甲醇:水:醋酸的体积比为:5:4:1;
[0029]试剂10为第一维电荷分离电泳的脱色液，其各组分配比为:甲醇50wt%、NH4HC035wt% 和水 45wt% ；
[0030]试剂11为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的脱色液，其各组分配比为:甲醇40vt%、醋酸 10vt% 和水 50vt% ；
[0031]试剂12为第二维SDS-PAGE质量分离电泳指示剂，其各组分配比为:1.25ml0.5MTris-HCl溶液，2.50ml甘油，2.0mll0wt%十二烷基磺酸钠溶液，0.2ml0.5wt%溴酚蓝溶液，50 μ IlM 二硫苏糖醇溶液，加水定容至1ml。[0032]本发明所述组蛋白异构体的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法的原理为:利用酸性条件下Cu2+与蛋白质中氨基酸残基的选择性配位作用，使得蛋白质不仅由碱性氨基酸残基的质子化带上正电荷，而且还由金属离子的选择性配位作用使相似氨基酸序列组蛋白异构体带上不同的正电荷，施加直流电后，带不同正电荷的组蛋白异构体具有不同迁移速率，从而得以分离。同时一维电荷分离后，还可进一步进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质再次以质量进行分离，从而利用电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳实现对组蛋白异构体的分离。本发明中，组蛋白生物样品经第一维电荷分离电泳后，对得到的相关蛋白条带进行质谱分析，结果显示，部分组蛋白异构体可以从蛋白生物样品中有效的分离出来；同时，将组蛋白生物样品进行电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离后，对相关蛋白泳道的质谱分析结果也显示，部分组蛋白异构体可以从蛋白生物样品中有效的分离出来。
[0033]本发明的有益效果:
[0034](I)本发明所述电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳方法操作过程简单，对组蛋白质异构体的分离效果好，分辨率高，成本低。
[0035](2)与现有等电点聚焦-十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺二维凝胶电泳相比，本发明电泳分离方法大大提高了对相似的组蛋白异构体的分辨能力，克服了等电点聚焦容易发生蛋白质沉淀以及对组蛋白异构体分析的局限性。
[0036]( 3)本发明所述试剂盒绿色环保，安全实用，配制简单，保存容易。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为对比例I中没有Cu2+辅助的第一维电荷分离凝胶电泳图，其中I~9为蛋白条带。
[0038]图2为实施例1中Cu2+辅助的第一维电荷分离凝胶电泳图，其中I~10为蛋白条带。
[0039]图3为上图2中蛋白条带3所对应的蛋白的质谱鉴定图。
[0040]图4为对比例2中没有Cu2+辅助的电荷-质量二维电泳分离凝胶电泳图，其中I为蛋白点。
[0041]图5为实施例2中Cu2+辅助的电荷-质量二维电泳分离凝胶电泳图，其中I为蛋白点。[0042]图6为上图5中蛋白点I所对应的蛋白的质谱鉴定图。
【具体实施方式】
[0043]为了更好地理解本发明，下面结合实施例、附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0044]实施例1
[0045]采用第一维电荷电泳分离方法对大鼠肝脏组蛋白进行分离，具体操作步骤为:
[0046](I)大鼠肝脏组蛋白的提取:先将大鼠肝脏组织用生理盐水洗去血液，再与核分离试剂一起匀浆，离心后用不含吐温X-100和NP40的洗涤液清洗，分离得到的细胞核用0.2M硫酸溶液抽提后用三氯乙酸沉淀，离心后用冰丙酮洗涤，并冷冻干燥，得到组蛋白生物样品冻干粉。所述核分离试剂的各组成成分为=Tris-HCl (15mM)、KCl (60mM)、CaCl2(IlmM)、NaCl (5mM)、MgCl2 (5mM)、蔗糖(250mM)、DTT (ImM)、丁酸钠(IOmM)、NaN3 (0.02wt%)、
0.4wt%NP40和0.80wt%吐温-XlOO。所述洗涤液除不含吐温和NP40外，其余组分与核分离试剂相同。
[0047](2)样品预处理:配制样品质子化缓冲溶液，该缓冲溶液呈酸性，可使组蛋白生物样品中碱性氨基酸残基质子化，从而使样品带上正电荷，所述缓冲溶液的各组分配比为:尿素0.36g，冰醋酸50 μ I，0.2wt%派洛宁Y (Pyronin Y)溶液60 μ I，加水至总体积为600 μ I ；将步骤(1)得到组蛋白生物样品冻干粉溶解于上述样品质子化缓冲溶液中，得到质子化组蛋白生物样品溶液，所 述质子化组蛋白生物样品溶液的配制过程为:每5yg组蛋白生物样品冻干粉溶解在I μ I样品质子化缓冲溶液；配制浓度为40 μ g/ μ I CuSO4溶液；再将CuSO4溶液与上述质子化组蛋白生物样品溶液按照质量比为1:1比例混合，得到组蛋白生物样品上样液；
[0048](3)第一维电荷电泳分离:制备吐温-醋酸-尿素浓缩胶和分离胶，所述吐温-醋酸-尿素浓缩胶的各组分配比为:尿素1.88、含60被％丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250μ 1、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30 μ I和10wt%过硫酸铵140 μ I ;所述吐温-醋酸-尿素分离胶的各组分配比为:尿素3.6g、含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500μ 1、蒸馏水3.73mlU0vt%吐温-100370 μ 1、四甲基二乙胺60 μ I和10wt%过硫酸铵280 μ I ;采用常规一维十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统进行第一维电荷分离电泳，电泳液为:5vt%醋酸水溶液，将步骤(2)所得组蛋白生物样品上样液加入凝胶电泳进样口，施加直流电压，开始电泳:首先30伏电压下运行I小时，待蛋白样品浓缩成一直线后，再在100伏电压下运行150分钟，电泳结束后，得到第一维电荷电泳分离凝胶胶条；
[0049](4)将所得第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行拷蓝染色，具体操作步骤为:将凝胶胶条取出后放入染色液，染色液的用量以完全浸泡凝胶为准，在震荡摇床上染色I~2小时，所述染色液的组成成分为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%，所述甲醇和水的体积比为1:1 ;
[0050](5)染色结束后，将凝胶胶条进行脱色，具体操作步骤为:将凝胶取出后放入脱色液中，脱色液的用量以完全浸泡凝胶为准，在震荡摇床上脱色I~2小时；所述脱色液的组成成分包括甲醇(50wt%)、NH4HCO3 (5wt%)和水(45wt%)；[0051](6)脱色结束后，取出凝胶胶条，扫描，得到第一维电荷分离凝胶电泳图(图2)，图2中显示分离得到10条蛋白条带；将图2中的10条蛋白条带分别切下，用胰蛋白酶切处理后，分别进行质谱分析鉴定，其中蛋白条带3的质谱分析鉴定结果见图3，图3的结果表明，蛋白条带3所对应的蛋白为组蛋白异构体H3。
[0052]实施例2
[0053]采用电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法对大鼠肝脏组蛋白进行分离，具体操作步骤为:
[0054]步骤(1)~步骤(3)同实施例1 ;
[0055](4)质量分离电泳:将步骤(3)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条切下后横放于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶上，在两边空隙处填加空白吐温-醋酸-尿素分离胶(TAU胶)以保证电流分布均匀，加入50μ I指示剂，再加入电泳液使之浸泡整个分离胶，施加电压，开始电泳:采用70伏电压运行I小时，然后改变电压至120伏继续电泳，当指示剂跑出电泳槽，停止电泳，得到电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条；
[0056]所述指示剂各组分配比为:1.25ml0.5M Tris-HCl溶液，2.50ml甘油，2.0mll0wt%十二烷基磺酸钠溶液，0.2ml0.5wt%溴酚蓝溶液，50 μ IlM 二硫苏糖醇溶液，加水定容至Iml ;所述电泳液各组分配比为:Tris碱30.3g、甘氨酸144g、十二烷基磺酸钠IOg,加水定容至1L，充分溶解后再稀释10倍；
[0057]所述十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶，其各组分配比为:含30被％丙烯酰胺和0.8wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液6ml，pH为8.8的Tris_HCl/SDS溶液3.75ml，蒸馏水
3.75ml,四甲基二乙胺10 μ` 1，10wt%过硫酸铵50 μ 1，所述pH为8.8的Tris_HCl/SDS溶液的配制方法为:将91g Tris碱溶解于300ml水中，滴加IM的HCl溶液，调节其pH至8.8，加入2g十二烷基磺酸钠,溶解后加水定容至500ml ；
[0058](5)将步骤(4)得到的电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条取出后，进行拷蓝染色，具体操作步骤为:将凝胶胶条取出后放入染色液，染色液的用量以完全浸泡凝胶为准，在震荡摇床上染色I~2小时，所述染色液的组成成分为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇、水和醋酸的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%，所述甲醇:水:醋酸的体积比为:5:4:1 ；
[0059](6)染色结束后，将凝胶胶条进行脱色，具体操作步骤为:将凝胶取出后放入脱色液中，脱色液的用量以完全浸泡凝胶为准，在震荡摇床上脱色I~2小时；所述脱色液的组成成分包括甲醇(40vt%)、醋酸(10vt%)和水(50vt%)；
[0060](7)脱色结束后，取出凝胶胶条，扫描，得到电荷-质量二维电泳分离凝胶电泳图(图5)，图5中显示分离得到若干个蛋白点，其中蛋白点I明显与其他蛋白点显著分离；将图5中蛋白点I切下，用胰蛋白酶切处理后，进行质谱分析鉴定，质谱结果见图6，图6的结果显示，蛋白点I所对应的蛋白为组蛋白异构体H1。
[0061]对比例I
[0062]对比例I中，采用第一维电荷电泳分离方法对大鼠肝脏组蛋白进行分离，具体操作步骤与实施例1大致相同，不同之处在于:
[0063]( I)样品的预处理过程中未加入CuSO4溶液，即所述质子化组蛋白生物样品溶液即为组蛋白生物样品上样液。[0064]对比例1中，得到第一维电荷分离电泳的凝胶电泳图(见图1)，图1中显示分离得到9条蛋白条带。
[0065]对比图1和图2，可以看出，样品的预处理过程中加入CuS04溶液，利用Cu2+离子与氨基酸残基的选择性配位作用，经过第一维电荷分离凝胶电泳，图2中出现了非常明显的蛋白条带3，而在图1中与之相对应的位置，并没有明显的蛋白条带出现，同时将图2中蛋白条带3进行质谱分析的结果表明:蛋白条带3所对应的蛋白为组蛋白异构体H3，由此说明，通过第一维电荷分离凝胶电泳，组蛋白异构体H3可以得到显著分离。
[0066]对比例2
[0067]对比例2中，采用电荷-质量二维凝胶电泳分离方法对大鼠肝脏组蛋白进行分离，具体操作步骤与实施例2大致相同，不同之处在于:
[0068]( 1)样品的预处理过程中未加入CuS04溶液，即所述质子化组蛋白生物样品溶液即为组蛋白生物样品上样液。
[0069]对比例2中，得到电荷-质量二维分离电泳的凝胶电泳图(图4)，图4结果显示分离得到若干个蛋白点，其中蛋白点1明显与其他蛋白点显著分离。
[0070]对比图4和图5，可以看出，经过电荷-质量二维分离凝胶电泳，在图4和图5中均出现了蛋白点1，但有Cu2+离子辅助下的电荷-质量二维分离凝胶电泳(图5)，其各蛋白点的分离效果会更好，进一步对 蛋白点1进行质谱分析鉴定，结果表明，蛋白点1所对应的蛋白为组蛋白异构体H1，由此说明，通过电荷-质量二维分离电泳，组蛋白异构体H1可以被显著分离。
[0071]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
【权利要求】
1.电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)组蛋白生物样品预处理:配制样品质子化缓冲溶液，将组蛋白生物样品溶解于所述样品质子化缓冲溶液中，得到质子化组蛋白生物样品溶液；再向质子化组蛋白生物样品溶液中加入CuSO4溶液，使Cu2+与组蛋白充分结合，得到组蛋白生物样品上样液； (2)第一维电荷电泳分离:制备吐温-醋酸-尿素浓缩胶和吐温-醋酸-尿素分离胶，采用常规电泳系统进行第一维电荷电泳分离，将步骤(1)得到的组蛋白生物样品上样液加样至上样口，施加电压开始电泳，电泳结束后，得到第一维电荷电泳分离凝胶胶条； (3)将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行染色和脱色后得到第一维电荷电泳分离电泳图；或者将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条切下后横放于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶上，加入指示剂，进行第二维SDS-PAGE质量电泳分离，电泳结束后，得到电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条，所述电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条经染色和脱色后得到电荷-质量二维电泳分离凝胶电泳图。
2.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:所述样品质子化缓冲溶液的各组分配比为:尿素0.36g，冰醋酸50μ 1，0.2wt%派洛宁Y溶液60 μ 1，加水定容至600 μ I。
3.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:所述质子化组蛋白生物样品溶液配制过程中每Img组蛋白生物样品所需要的样品质子化缓冲溶液的体积为200 μ I~1000 μ I。
4.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:所述CuSO4溶液的浓度为40 μ g/ μ 1，所述CuSO4溶液与质子化组蛋白生物样品溶液按照质量比为I~5:1的比例混合。
5.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:步骤(2)所述的第一维电荷电泳分离的`电泳条件为:首先采用30伏电压运行I小时，待上样液浓缩成一条直线后，再采用100伏电压运行150分钟。
6.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:步骤(2)中所述吐温-醋酸-尿素浓缩胶的各组分配比为:含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250 μ 1、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30 μ I和10被％过硫酸铵140 μ I ;步骤(2)中所述吐温-醋酸-尿素分离胶的各组分配比为:尿素3.6g、含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500 μ 1、蒸馏水3.73ml、10vt%吐温-100370 μ 1、四甲基二乙胺60 μ I和10wt%过硫酸铵280 μ I。
7.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:步骤(2 )所述第一维电荷电泳分离的电泳液为5vt%醋酸水溶液。
8.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:将步骤(3)所述第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行染色的染色液各组分配比为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%,所述甲醇和水的体积比为1:1 ;将步骤(3)所述的第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行脱色的脱色液各组分配比为:甲醇50wt%、NH4HC035wt%和水45wt%。
9.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于:所述第二维SDS-PAGE质量电泳分离的电泳条件为:采用70伏电压运行I小时，然后改变电压至120伏继续电泳，当指示剂跑出电泳槽,停止电泳。
10.电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳试剂盒,包括如下12种试剂: 试剂I为样品质子化缓冲溶液，其各组分配比为:尿素0.36g，冰醋酸50 μ 1，0.2wt%派洛宁Y溶液60 μ I，加水定容至600 μ I ; 试剂2为CuSO4溶液，所述CuSO4溶液的浓度为40 μ g/ μ I ; 试剂3为吐温-醋酸-尿素浓缩胶，其各组分配比为:含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250 μ 1、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30 μ I和10wt%过硫酸铵140 μ I ; 试剂4吐温-醋酸-尿素分离胶，其各组分配比为:尿素3.6g、含60wt%丙烯酰胺和0.4wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500 μ 1、蒸馏水3.73ml、10vt%吐温-100370 μ 1、四甲基二乙胺60 μ I和10wt%过硫酸铵280 μ I ; 试剂5为第一维电荷分离电泳的电泳液，其组分为:5vt%醋酸水溶液； 试剂6为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的电泳液，其各组分配比为:Tris碱30.3g、甘氨酸144g、十二烷基磺酸钠IOg,加水定容至1L,充分溶解后再稀释10倍； 试剂7为第二维SDS-PAGE质量分离电泳分离胶，其各组分配比为:含30被％丙烯酰胺和0.8wt%甲叉双丙烯酰胺的水溶液6ml，pH为8.8的Tris_HCl/SDS溶液3.75ml，蒸馏水3.75ml,四甲基二乙胺10 μ 1，10wt%过硫酸铵50 μ 1，所述pH为8.8的Tris_HCl/SDS溶液的配制方法为:将91g Tris碱溶解于300ml水中，滴加IM的HCl溶液，调节其pH至8.8，加入2g十二烷基磺酸钠,溶解后加水定容至500ml ； 试剂8为第一维电荷分离电泳的染色液，其各组分配比为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%，所述甲醇和水的体积比为1:1 ; 试剂9为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的染色液，其各组分配比为:将考马斯蓝R250溶解在甲醇、水和醋酸的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.lwt%，所述甲醇:水:醋酸的体积比为:5:4:1 ； 试剂10为第一维电荷分离电泳的脱色液，其各组分配比为:甲醇50wt%、NH4HC035wt9aP水 45wt% ； 试剂11为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的脱色液，其各组分配比为:甲醇40vt%、醋酸 10vt% 和水 50vt% ； 试剂12为第二维SDS-PAGE质量分离电泳指示剂，其各组分配比为:1.25ml0.5MTris-HCl溶液，2.50ml甘油，2.0mll0wt%十二烷基磺酸钠溶液，0.2ml0.5wt%溴酚蓝溶液，50 μ IlM 二硫苏糖醇溶液，加水定容至1ml。
【文档编号】C07K1/26GK103694329SQ201310754419
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】钟鸿英, 张文洋, 唐雪妹, 郑石, 黄璐璐 申请人:华中师范大学