一种定向重组别藻蓝蛋白三聚体作为光学敏化材料的应用的制作方法与工艺

本发明属于生物技术，具体涉及一种定向重组别藻蓝蛋白三聚体作为光学敏化材料的应用。

背景技术：
太阳能是最丰富的可持续的能源资源，地球的表面从太阳每年约获得4×1024J的太阳能。自然界的光合作用是超过3.5亿年典型的太阳能应用。生物过程是规模最大的光子能量转换成吉布斯自由能的过程。光合生物在地球上包括绿色的植物，藻类，光合细菌和蓝藻。在所有生物光合作用复合物中，别藻蓝蛋白三聚体这一天线系统所捕获的光子用于维持跨膜反应中心的电荷分离。近来，基于大分子的染料敏化太阳能电池的研究和利用，尤其是基于叶绿素的人工光伏设备和超分子光合蛋白复合物的发现，促成了很多先进仿生太阳能光伏设备的开发。但是研究主要集中在利用细菌视紫红质（BR），光系统I（PSI），光系统II（PSII）和光捕获复合体（LHCII）创造直接转换太阳能的光伏设备。别藻蓝蛋白是藻胆蛋白中结构较为简单的蛋白，由α和β亚基紧密结合构成异二聚体（通常称为单体），每个亚基只结合一个色基。三个单体通过非共价作用结合为三聚体（αβ）3。别藻蓝蛋白吸收约650～660nm的可见光，发射光约660～670nm的荧光。别藻蓝蛋白（APC）的三聚体组成藻胆体的核心，能高效的传递较低能量的光子（最大波长650nm）。在广泛可见光谱范围内以令人难以置信的效率，作为太阳能捕光天线，将捕获的太阳光能传输至光合反应中心。X-射线晶体学研究已揭示了在0.29纳米分辨率下别藻蓝蛋白三聚体的结构细节。最近的研究表明，在别藻蓝蛋白三聚体中在430-440飞秒的时间尺度上，能量按照福斯特共振机制从三聚体中传递到反应中心叶绿素。2009年，刘少芳等首先装配高度可溶的自组装生物工程别藻蓝蛋白三聚体融合N-末端组氨酸（His标签）来自于Synechocystissp.PCC6803基因组，并在大肠杆菌宿主中表达。通过荧光和吸收光谱法分析已经证明重组别藻蓝蛋白三聚体的结构，热稳定性和荧光特性的于天然三聚体相似。融合的His6-标签提供了一种简便的方法，易于大规模的从细胞裂解物中纯化重组的别藻蓝蛋白三聚体。同时也顺利完成了大规模发酵生产重组别藻蓝蛋白（APC）三聚体。

技术实现要素：
本发明目的在于，提供一种定向重组别藻蓝蛋白三聚体作为光学敏化材料的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种重组别藻蓝蛋白三聚体作为光学敏化材料的应用。通过重组别藻蓝蛋白三聚体溶液处理半导体电极或者金属电极，使电极表面由于重组别藻蓝蛋白三聚体溶液存在通过静电力吸附和氢键相互作用吸附形成定向或非定向的重组别藻蓝蛋白三聚体层，使吸附有重组别藻蓝蛋白三聚体层的电极在光照条件下完成太阳能到电能的转化。所述重组别藻蓝蛋白三聚体溶液为0.001毫克/毫升—10毫克/毫升。所述重组别藻蓝蛋白三聚体溶液中通过静电力吸附和氢键相互作用于电极表面形成定向吸附层的电极为孔径1纳米—1微米的多孔纳米结构或者线性晶体结构。所述吸附有重组别藻蓝蛋白三聚体层的电极可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。本发明与现有技术相比，具有以下优点：1.重组别藻蓝蛋白三聚体具有更快的电子转移速率，较高的量子效率，近红外区有较宽的吸收带，无毒并且有很好的稳定性。利用纳米尺度的光阳极能更好的收集和传输电子，并且可以使用模块化技术降低成本。具有较高的光伏特性。2.本发明重组别藻蓝蛋白三聚体利用大肠杆菌生产重组光活性蛋白，规模化发酵生产，易于培养，生长快，可以大大缩短生产周期，易于纯化，生产过程可以节约能源并且生产效率高。得到的重组蛋白含有His-tag标记，通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白，且纯度较高。同时His-tag标记便于电极表面的定向组装。3.本发明所选用的光敏材料除了模拟自然界中的光合作用以外，同时可以和现有的天然色素敏化染料混合共敏化，增大对太阳光吸收波长的范围和吸收效率。4.本发明以定向重组别藻蓝蛋白三聚体作为敏化染料的生物大分子太阳能敏化电池。其生物大分子染料敏化太阳能电池具有成本低,制作工艺简单，无毒，环境友好。附图说明图1本发明制备以别藻蓝蛋白三聚体为敏化剂的太阳能电池示意图；图2a为本发明以别藻蓝蛋白三聚体为敏化剂的光阳极表面蛋白吸附状态的激光共聚焦显微镜图；图2b为本发明以别藻蓝蛋白三聚体为敏化剂的光阳极表面蛋白吸附状态的扫描电子显微镜图；图2c为本发明以别藻蓝蛋白三聚体为敏化剂的光阳极表面蛋白吸附状态的原子力显微镜图；图3本发明定向重组别藻蓝蛋白三聚体为敏化剂的太阳能电池光伏特性图。具体实施方式下面通过实施实例具体说明本发明：本发明首先带有有利于分离纯化，和定向组装组氨酸标签；其次通过不同浓度蛋白溶液处理电极，而后采用氮气吹干或者真空冷冻干燥，依赖静电力吸附和氢键相互作用在电极表面形成定向或非定向的单层或多层吸附；敏化半导体电极或者金属电极使之在光照条件下可以直接完成太阳能到电能的转化。实施实例1：Ti02电极的构建和敏化1）纳米多孔结构的光阳极和铂对电极都存在于（FTO）玻璃基板：FTO玻璃依次用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。使用丝网印刷法将10-80纳米尺度的球状粒子的二氧化钛沉积与已制备的FTO玻璃（1.8厘米膜厚）的表面上，沉积厚度大约12μm的，即制作得到半导体膜作为阳极电极。将球状粒子（10-1000纳米）的二氧化钛于500℃加热30分钟，使二氧化钛颗粒烧结在一起，以创建一个渗透性的导电网络。阳极电极制备后，在350℃下加热40分钟，然后冷却至50℃，二氧化钛阳极电极浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液（3毫克/毫升）于室温下在黑暗中吸附24小时。吸附后，用去离子水漂洗敏化光阳极，除去不牢固的吸附，然后在氮气下干燥。所述别藻蓝蛋白三聚体根据申请号为200910255643.X、公开号为CN102094029A的专利文献中记载的方式制备所得。敏化后的光阳极表面的表征用激光共聚焦显微镜，原子力显微镜（AFM）和扫描电子显微镜来描述纳米尺度的敏化光阳极的固定特征。首先，559nm波长的固态激光器用于激发荧光信号，然后获取570nm-670nm波长频带的荧光图像，通过共焦激光扫描显微镜（奥林巴斯FLUOFV1000，日本）40倍物镜。接着，利用纳米级原子力显微镜（Veeco公司，USA）在scanasyst空气模式下得到敏化表面的可视化照片。在15mA持续45秒的条件下，铂离子真空溅射镀膜（日立E-1045离子溅射仪，日本），对同一样品使用高分辨率场发射扫描电子显微镜，（日立S-4800，日本）进行了检测。最终得到不规则多层吸附的阳极表面（参见图2）。多层吸附实现的化学原理多层吸附是通过静电相互作用来实现的。如羰基，酰胺，咪唑，这些在生物系统中能形成强力非共价键力的官能团，特别是对大分子之间的氢键形成，发挥关键的作用。在电负性原子参加的定向重组别藻蓝蛋白三聚体之间的氢键，定向重组别藻蓝蛋白三聚体与二氧化钛电极距离小于0.3nm并在与水分子的竞争下的热运动形成这些氢键是可能的。仿生太阳能转换装置的构建以及参数测量。敏化的光阳极和镀铂电极通过直径为7mm的激光切割沙林垫片（SOLARONIXSA，25微米厚）进行组装，中央形成密闭的空腔。将液体电解质溶液（将0.5M的LII，0.05MI2，0.3MDMPII，0.5M的4-TBP和0.1MGNCS共同溶于乙腈）注入此空腔，而后进行测量。在标准光照条件下（100mW/cm-2），使用IV测试系统（CrownTech，美国）对太阳能电池的光伏特性进行了测试，包括短路电流，开路电压，填充因子和转换效率（参见图3）。实施例2以申请号为200910255643.X、公开号为CN102094029A的专利文献中记载，首先将别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因与藻胆素生物合成酶基因ho1和pcyA克隆到一个表达载体中；其次将别藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因与色基裂合酶基因cpcS和cpcU克隆到另一个载体上，将两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选出同时表达上述基因的工程菌。利用所得工程菌在5L发酵罐中表达融合藻蓝蛋白的程序如下:取保存的菌种100μl无菌接种于5ml液体LB培养基，37℃震荡培养12小时，然后转接于含200ml液体LB培养基的三角瓶，37℃震荡培养4小时。工程菌的发酵在5L自动发酵罐中进行，体积比为2％的接种量，诱导前培养温度设为37℃，转速随发酵时间由300-500rpm递增，pH均自动控制；发酵开始4h后，菌体生长至对数期，原培养基中的碳源接近耗尽时，以0.08g/L·min-1的速率进行葡萄糖补料。发酵开始约7h时，先将罐内温度缓慢降至28℃，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol/L，降低转速至150rpm，诱导培养10h以上。别藻蓝蛋白的分离纯化：将上述发酵液离心（5000rpm，10min）得到已表达目的蛋白的菌体，按照每升结合缓冲液（20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，20mmol/L咪唑，pH7.4）加入湿菌体80g的比例将菌体重悬，超声破碎细菌20分钟，12000rpm，4℃条件下离心，收集上清液，上样于Ni2+亲和色谱柱，用5倍柱体积的缓冲液（20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，50mmol/L咪唑，pH7.4）冲洗色谱柱后，用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，400mmol/L咪唑，pH7.0)洗脱，洗脱液经millipore蛋白浓缩柱脱盐浓缩后即得到脱盐蛋白。通过Superdex200凝胶色谱柱，用50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）洗脱，洗脱速度为10ml/h，收集A650nm/A620nm>1.3的流出液，为目的蛋白，即纯化后别藻蓝蛋白三聚体荧光蛋白。别藻蓝蛋白为两个亚基α和β的N端重叠呈“弯月”形单体结构，三个单体（αβ）围绕中心轴形成一个具有中央空洞的圆盘状三聚体结构，该圆盘状厚度约为3纳米，圆盘外周直径约为12纳米，内部中空的直径为1.5－5纳米。以纳米多孔（10-100纳米）结构的金箔片作为光阳极，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（1毫克/毫升）室温下在黑暗中吸附24小时。吸附后，用去离子水漂洗敏化光阳极，除去不牢固的吸附，然后在氮气下干燥。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例3与实施例1不同之处在于：采用纳米多孔结构的金箔片作为光阳极，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。将别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（2毫克/毫升）滴加在金箔片电极表面，而后于黑暗条件下利用真空冷冻干燥机干燥，在电极表面形成定向三聚体多层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例4与实施例1不同之处在于：采用纳米多孔结构的金银合金箔片作为光阳极表面，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（0.001毫克/毫升）黑暗条件下利用真空冷冻干燥机干燥，在电极表面形成定向三聚体多层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例5与实施例1不同之处在于：采用氧化锌纳米线作为光阳极表面，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。将别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（0.01毫克/毫升）滴加在金箔片电极表面，而后于黑暗条件下利用氮气吹干电极表面，在电极表面形成非定向三聚体多层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例6与实施例1不同之处在于：采用纳米多孔结构的金银合金箔片作为光阳极，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（0.1毫克/毫升），室温下在黑暗中吸附24小时。吸附后，用去离子水漂洗敏化光阳极，除去不牢固的吸附，然后在氮气下干燥。在电极表面形成定向三聚体多层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例7与实施例1不同之处在于：采用氧化锌纳米线作为光阳极表面，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（1.5毫克/毫升）室温下在黑暗中吸附24小时。吸附后，用去离子水漂洗敏化光阳极，除去不牢固的吸附，然后在氮气下干燥。在电极表面形成非定向三聚体多层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例8与实施例1不同之处在于：采用纳米多孔结构的金箔片作为光阳极，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（0.5毫克/毫升）室温下在黑暗中吸附24小时。吸附后，用去离子水漂洗敏化光阳极，除去不牢固的吸附，然后在氮气下干燥。在电极表面形成定向三聚体多层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例9与实施例1不同之处在于：采用烧结的二氧化钛颗粒纳米层作为光阳极表面，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（1.5毫克/毫升）黑暗条件下利用真空冷冻干燥机干燥，在电极表面形成非定向三聚体多层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例10与实施例1不同之处在于：采用烧结的二氧化钛颗粒纳米层作为光阳极表面，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（0.05毫克/毫升）黑暗条件下利用真空冷冻干燥机干燥，在电极表面形成非定向三聚体单层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例11与实施例1不同之处在于：采用氧化锌纳米线作为光阳极表面，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（0.04毫克/毫升）黑暗条件下利用真空冷冻干燥机干燥，在电极表面形成非定向三聚体单层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。实施例12与实施例1不同之处在于：采用纳米多孔结构的金银合金箔片作为光阳极，铂作为对电极。用乙醇，氯仿进行20分钟超声波振动处理后，紫外臭氧消毒10分钟。金箔片电极被浸泡在别藻蓝蛋白三聚体的PH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液溶液（0.008毫克/毫升），室温下在黑暗中吸附24小时。吸附后，用去离子水漂洗敏化光阳极，除去不牢固的吸附，然后在氮气下干燥。在电极表面形成定向三聚体单层吸附。所得电极在光照条件下可直接完成太阳能到电能的转化，即可作为太阳能电池或光学传感器的电极使用。