一种抗脑癌的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药材料技术领域。更具体地，涉及一种能够抑制脑癌细胞生长的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]脑肿瘤即颅内肿瘤，是指原发性和转移性肿瘤的异质群体，中枢神经系统是危及生命的疾病，其特点是存活率极低。全球原发行脑肿瘤的年发病率是大约为24000例，是一种种类繁多的且通常会使患者治后不愈，留下后遗症。脑肿瘤的转移是另一个重要的类中枢神经系统疾病，主要从系统性癌症肺癌、乳腺癌和皮肤癌转移至脑部。转移性脑部肿瘤发病率较高，在美国年发病率约为100000?170000例。
[0003]目前，恶性脑肿瘤治疗方法包括手术切除、放疗、和化疗及复合疗法，这些方法可以极大的延长患者的生存时间。此外，大脑解剖和成像技术的进步也为脑肿瘤的早期检测、诊断测试、手术计划以及术后评估起了至关重要的作用。但是，尽管在脑肿瘤的诊断和治疗方法上已经付出了极大的努力，但是脑肿瘤的治愈仍然是神经肿瘤的一大挑战，其主要原因有:(1)大脑结构的复杂性；(2)脑肿瘤的多样化和侵入性；(3)无法辨别肿瘤边缘和肿瘤扩散的性；(4)药物治疗上的经验积累不足；(5)化疗产生耐药性。不同于其他组织，脑部组织由血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)保护，血脑屏障可以阻止内生的有害物质和外来物质随血液流入，但同时这也成为脑肿瘤治疗的主要限制因素。研究表明，只有血液中小分子的亲脂性物质，电中性分子以及一些分子量在400?600的营养素可以被动扩散到脑部。因此，要想脑癌提高药物的治疗的疗效，就必须要使药物有效通过血脑屏障到达患处。
[0004]另外，国内外有文献报道，藻蓝蛋白对肿瘤细胞具有直接的杀伤与抑制作用。Schwartz等首先发现藻蓝蛋白对癌细胞有抑制作用，预示着藻蓝蛋白有抗肿瘤潜力；Nishanth等研究了其抗肝癌活性;Subhashin等研究了其对白血病的治疗作用。但是，尚未证明其对脑癌的作用如何，而且藻蓝蛋白分子量较大，很难与细胞直接作用，限制了其在抗癌中的应用。同时，虫草素是一种腺苷类物质，是蛹虫草的主要生物活性成分，具有药理特性。相比普通化学抗癌药物，虫草素作为一种天然中草药成分，对正常机体的毒副作用小，同时具有抗肿瘤、抗癌细胞转移、免疫调节、抗氧化等作用。Chen等已经证明虫草素对大鼠神经胶质瘤细胞系的杀伤作用。虽然虫草素已经被证实对脑癌细胞有抑制作用，但Lu发现虫草素在体内24 h就完全代谢，这也成为虫草素直接应用于脑肿瘤治疗的最大限制因素。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有脑肿瘤治疗技术和药物的不足，提供一种新型的脑癌治疗药物材料，本发明通过美拉德反应将葡聚糖接枝到藻蓝蛋白上形成复合物，再应用自组装机理将虫草素包裹在里面形成胶束，成功的合成了分散性好、尺寸较小的藻蓝蛋白胶束;该胶束能够穿过血脑屏障到达肿瘤处，对脑癌细胞具有抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累，有很大的潜力应用于脑癌的治疗。
[0006]本发明的目的是提供一种能够抑制脑癌细胞生长的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。
[0007]本发明另一目的是提供上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的制备方法。
[0008]本发明的再一目的是提供上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的应用。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种抗脑癌的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，是首先采用美拉德反应的方法将藻蓝蛋白接枝到葡聚糖上，形成藻蓝蛋白-葡聚糖复合物;再通过自组装的机理，将虫草素包裹到藻蓝蛋白里面，自组装形成胶束制备得到。
[0010]其中优选地，制备上述胶束所用的葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为0.25?4:1。
[0011 ]更优选地，所述葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为2?4:1。
[0012]最优选地，所述葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为4:1。
[0013]另外，优选地，所述美拉德反应的条件为50?70°C反应24?60h。
[0014]更优选地，所述美拉德反应的条件为60°C反应48ho
[0015]优选地，制备上述胶束所用的藻蓝蛋白和虫草素的质量比为10?30:1。
[0016]更优选地，所述藻蓝蛋白和虫草素的质量比为20:1。
[0017]优选地，制备上述胶束所用葡聚糖的分子量为65?75KD。
[0018]更优选地，所述葡聚糖的分子量为70KD。
[0019]作为一种优选的可实施方案，上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的具体制备方法包括如下步骤:
51.按照葡聚糖:藻蓝蛋白=0.25?4:1的质量比，将藻蓝蛋白和葡聚糖混合，加入去离子水，超声震荡至葡聚糖和藻蓝蛋白均完全溶解；
52.将步骤S1所得混合溶液的pH值调节至3?4.5，然后将混合溶液冷冻干燥；
53.将步骤S2冷冻干燥所得的固体放在装有饱和KBr溶液的密闭容器中，置于50?70°C下进行美拉德反应24?60h，反应产物即为藻蓝蛋白-葡聚糖复合物；
54.将藻蓝蛋白-葡聚糖复合物加去离子水溶解，得到藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液，再按照藻蓝蛋白:虫草素=10?30:1的质量比，向溶液中加入虫草素，超声振荡4 h以上，即制得藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。
[0020]其中，优选地，步骤S2所述混合溶液的pH值调节至3.8。
[0021 ]优选地，步骤S2所述冷冻干燥的条件为:_50°C，真空1.0Pa。
[0022]优选地，步骤S3所述密闭容器中的相对湿度为70?85%。
[0023]更优选地，步骤S3所述密闭容器中的相对湿度为79%。
[0024]优选地，步骤S4所述去离子水的添加量以得到藻蓝蛋白浓度为15?30mg/ml的藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液为准。
[0025]更优选地，步骤S4所述去离子水的添加量以得到藻蓝蛋白浓度为20mg/ml的藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液为准。
[0026]优选地，步骤S4所述超声振荡的时间为4?1Oh。
[0027]本发明首次利用藻蓝蛋白和葡聚糖制备出复合物，再将虫草素包裹其中，成功制得一种抗脑癌的新型药物，该药物能够穿过血脑屏障到达肿瘤处，对脑癌细胞具有抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累，有很大的潜力应用于脑癌的治疗。
[0028]因此，上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束在制备抗脑癌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0029]本发明利用葡聚糖和藻蓝蛋白合成新型的藻蓝蛋白胶束，利用这一新兴的纳米材料作为药物载体，具有低毒性和高载药率的特点，具有以下优势:首先，可以有效改善难溶性药物的吸收，改善药物循环;其次，具有较高的载药能力，而且可以实现药物的缓慢释放，延长药物作用时间；另外，还可以可有效提高药物效应，减轻毒副作用，提高血药浓度，同时提高药物的稳定性以及实现药物靶向输送。而且，胶束具有亲水的外壳和疏水的内核，因此具有良好的溶解性、高药物包载率、低细胞毒性以及可以有效的避免药物被单核巨噬细胞吞噬，在脑癌的治疗上有很大的优势。
[0030]胶束的形成过程主要依靠自组装原理，但是现有技术中，胶束的合成材料大多为一些聚合物，通常在胶束的合成过程中，会加入大量的有机溶剂，导致胶束本身带有很大的细胞毒性，影响其生物学效应。在本发明中，我们选择了一种天然蛋白质藻蓝蛋白，与葡聚糖通过美拉德反应结合在一起形成复合物。葡聚糖由多个葡萄糖分子间通过α(1，6)糖苷键聚合而成的多糖，含有丰富的羟基，易溶于水，有良好的生物相容性和生物