专利名称：：含藻蓝蛋白提取物的抗病毒组合物及藻蓝蛋白的提取的制作方法
技术领域：
：本发明涉及藻类生物体的提取物及其应用，特别是藻蓝蛋白的提取和应用。藻蓝蛋白广泛存在于蓝绿藻中，它在叶绿素出现之前已在地球上进化了几十亿年。由于它既含有镁又含有铁，所以藻蓝蛋白质又被视为叶绿素和血红素的先驱，是植物和动物共同的生命之源。藻蓝蛋白除含有丰富的高质量蛋白质外，还富集多种人体所需要的矿物质，特别是钙，因此开发和利藻蓝蛋白意义重大。对于藻蓝蛋白的提取和应用，目前鲜有文献报道。本发明的目的之一是提供一种含藻蓝蛋白提取物的抗病毒剂，其中含有治疗有效量的藻蓝蛋提取物和／或药物上可接受的载体。本发明的另一目的是提供一种提取藻蓝蛋白的方法，此方法包括下列步骤a．将蓝绿藻粉溶于5-20倍水中，低温保持8-30小时，b．固液分离，将溶液的pH值调至酸性，放置，c．收集所得固体为藻蓝蛋白粗品。图1为藻蛋白的U．V．扫描图谱；图2为藻蛋白分离后的U．V．扫描图谱。本发明详述本发明提供了一种含藻蓝蛋白提取物的抗病毒组合物，所述组合物中包含治疗有效量的藻蓝蛋白提取物和／或药物学上可接受的载体。所述藻蓝蛋白提取物以如下步骤制备a．将藻粉溶于5-20倍水中，低温保持8-30小时，b．固液分离，将溶液的pH值调至酸性，放置，c．收集所得固体为藻蓝蛋白粗品。其中步骤a中的藻粉优选为螺旋藻粉，而且其中水的用量优选为藻粉的8-15倍，最好是10倍，由于藻蓝蛋白易在高温下破坏，因此整个提取过程必须保持低温，通常10-15℃为宜。步骤b中的溶液的pH值优选调节至3．8-4．2。由本发明的含藻蓝蛋白提取物的抗病毒组合物具有有效地抑制病毒的复制和繁殖的能力。本发明中所述的治疗有效量由本领域普通技术人员容易掌握，通常根据患者的情况，病症，年龄，体重等情况而定。由于藻蓝蛋白提取物无毒，因此，根据需要，药物组合物可以直接由藻蓝蛋白提取物制成。当组合物中含有其它药物学上可接受的载体时，它们可由制药领域常规方法制得。所述药物学上可接受的载体包括本领域常规使用的那些，如溶剂，各种赋形剂，解崩剂等。所述药物组合物可制成溶液，口服液，糖浆，丸剂，片剂，冲剂，粉剂，颗粒剂，栓剂等剂型形式。以下结合实施例对本发明作进一步说明。1．氨基酸分析精确称取实施例1产物约0．2mg产品．加入1ml5．7NHCl，抽气后封口，在110℃下水解24小时，开管后真空抽干盐酸，加入50ml双蒸水，再真空抽干，残渣用双蒸水稀释至100ml或者00ml(根据样品浓度决定)．用Backman121MB氨基酸分析仪测定各样品的氨基酸组成。实验结果见表1表1．氨基酸含量分析数据表(mg／g样品)氨基酸分析结果表明样品中含有丰富的氨基酸，其中天冬氨酸和酪氨酸的含量尤高，而天冬氨酸能加速肌肉中ATP、CP及糖原的合成，又有利于乙酰辅酶A进入三羧酸循环。2．元素分析结果准确称取实施例1所得样品约0．1克，滴加浓硝酸加热使其水解后，加入双氧水约0．5ml，用蒸馏水稀释至50ml，再用等离子光谱仪(JCAP9000ST型)进行定量分析。供本实验用的测试液浓度为2．42mg／ml，元素含量以ng／ml表示。所得分析结果如下<tablesid="table2"num="002"><table>元素含量元素含量Pb0．0621Mo0．0041Au0．0056Cr0．00271Fe4．556Mn0．1821Mg13．62Co0．0113Si6．920P50．18Al2．358Ba0．1946Ti0．0755B0．3915Cu0．0972Sr0．1320Ni0．0247In0．0639Zn0．4016La0．0698Cd0．0613Ce0．0497Bi0．0454Y0．0055Ga0．0747Sc0．0025Ag0．0152Be0．0041Ca59．41As-V0．0149Nd0．2402</table></tables>3．生化分析(1)U．V．光谱藻蛋白经SephadexG-100柱层析后被分为两个主要的色素蛋白，即分子量较大的黄色蛋白和分子量较小的蓝色蛋白，如图1所示。其中使用SephadexG100柱(2×105cm)，洗脱剂采用0．05M磷酸缓冲液，PH8．0，流速3．5ml／min。如图2所示，藻蛋白经分离后的成分中Emax670nm(黄色蛋白)，Emax615nm(藻蓝蛋白)，650nm(别藻蓝蛋白)。(2)化学稳定性藻蓝蛋白提取物冻干粉在干燥的室温条件下，可保存两年不退色，不变质。质检方法1)蛋白含量测定[试剂]BSA，购自中科院东方仪器公司，批号90090。Shimadzu公司UV-240分光光度计。双缩脲法(1)制做标准曲线分别量取0，0．15，0．30，0．60，0．90，1．20，1．50ml的标准蛋白贮存液(1．2mg／ml)，用双蒸水补足到1．5ml／管，各加入1．5ml6％NaOH和0．15ml双缩脲试剂，混匀，在室温下静置20分钟，于310nm处比色，画出OD值与样品浓度的相关曲线。(2)测定样品(藻蓝蛋白)中蛋白含量称取样品13．2mg，用双蒸水溶解并定溶至50ml，测量方法同上。2)灰份含量测定灼烧法[测定方法]测定灰份(包括无机盐类物质)，采用灼烧、恒重、称量法测定。3)氨基酸分析精确称取约0．2mg样品，加入1ml5．7NHCl，抽气后封口，在110℃下水解24小时。开管后真空抽干盐酸，加入50ml双蒸水，再真空抽干。残渣用双蒸水稀释至100ml或200ml(根据样品浓度决定)。用Backman121MB氨基酸分析仪测定各样品的氨基酸组成。4)无菌实验．[测定指标](1)样品经乳酸发酵及EMB培养基培养后，大肠杆菌数不超过3个；(2)样品经牛肉汤培养基培养后，总菌数小于100个。4．功效(1)增加机体内T-细胞的数量-T淋巴细胞检验实验实验动物及药品实验动物昆明种小鼠，体重18～22克，疫检合格。环磷酰胺(注射用)上海第十二制药厂生产。药剂实施例1制得的干粉，于实验前配制成20μg／ml和10μg／ml的药液。实验方法将小鼠随机分为四组，每组10只，给药组每只每日腹腔注射环磷酰胺10mg／kg，再经口灌胃给药液，每只每日0．2ml，即相当于0．2mg／kg(高剂量组)和0．1mg／kg(低剂量组)；阳性对照组每只每日腹腔注射环磷酰胺10mg／kg，在经口灌胃常水0．2ml；空白对照组不注射、不给药，只经口灌胃常水0．2ml／只／日。连续给药10天后，停药3天，取小鼠眼眶血做白细胞推片、孵育、染色后，T淋巴细胞百分率。实验结果注射环磷酰胺后应造成小鼠T-淋巴细胞明显下降，但实验结果给药组反而出现上升，尤其是高剂量组其上升结果与对照组相比呈现显著性差异(P＜0．01)。实验结果表明药液具有较好的提高机体免疫力的功能。临床试用证明它对爱滋病(HIV-1)病毒、单疱疹病毒、流感A病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒等都有很好的抑制作用。(2)对皮肤中胶原蛋白含量的影响哺乳动物及人类皮肤中胶原蛋白的含量是随着年龄的增长而逐渐降低的。在胶原蛋白的氨基酸组成中，羟脯氨酸占12～14％。而其它组织中几乎不含羟脯氨酸。含量高且稳定的羟脯氨酸成分是胶原蛋白的一大特点。因此，通过定量测定皮肤中羟脯氨酸含量可作为测定皮肤衰老程度的一项指标。实验材料和仪器1)实验动物昆明种小鼠，体重28-30g，雌雄兼用。2)仪器UV-可见扫描仪。3)试剂羟脯氨酸(进口分装)；氯胺-T；对-二甲氨基苯甲醛；过氯酸；柠檬酸缓冲液，pH6试验制剂藻蓝蛋白提取物2)样品处理取上述精确称重的试剂样品置10ml具塞刻度试管中，加6NHCl2．0ml，混匀，密塞，置烘箱中于105℃酸解18小时，取出放至室温后，加10NNaOH2．0ml(使pH6)，过滤，滤液加水稀释至5．0ml，即为样品溶液。3)测定步骤标准曲线精确称取干燥至恒重的羟脯氨酸标准品50．0mg，用0．01NHCl溶解并稀释至100ml(1ml相当于500μ)，此为标准储备液。取上述标准储备液2．0ml，加水稀释至100ml(1ml相当于10μ羟脯氨酸)，即为标准应用液。取10μg／ml标准液0、0．2、0．4、0．6、0．8及1．0ml，分别置10ml具塞刻度试管中，用水将各管体积调整至1．0ml，再各加入柠檬酸缓冲液1．0ml和氯氨-T液1．0ml，混匀，放置6分钟，再向各管内加入过氯酸液1．0ml，混匀，放置5分钟，各管加入P-DMAB液1．0ml，混匀，75℃水浴放置10分钟，迅速冷却至室温，并用水调整总体积为5．0ml。以第一管做空白对照，于562nm波长测定吸收度，以羟脯氨酸含量(μg)为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线。样品测定精确量取样品溶液200μl，至具塞刻度试管内，加水至1．0ml后，按上述制备标准曲线的同样操作方法，测定样品溶液的吸收度，再从标准曲线计算样品中羟脯氨酸含量。由此可得到实验组和对照组动物皮肤中羟脯氨酸和胶原蛋白的百分含量(以胶原蛋白中羟脯氨酸含量为13％)计。实验结果实验结果以每毫克干皮肤中的羟脯氨酸的浓度表示于表1，表中所列数据均为用每组10只动物所测得的平均值。表1各组皮肤中羟脯氨酸含量注1．空白对照组即正常组；2．阴性对照组为只涂抹实验组的基质，不含药物成分；3．阳性对照组为涂抹SOD防晒霜；4．Phc实验组为涂抹试验试剂和基质所制备的样品。实验结果表明实验组的羟脯氨酸含量远远高于空白对照组和阳性对照组，经生物学统计具有非常明显的差异。组织学观察结果取空白对照组、阳性对照组和实验组三组实验小鼠的背部皮肤各一小块，制成石蜡连续切片，经H．E．染色后进行显微镜观察，结果表明(1)实验组角化层比两个对照组的角化层薄，尤其与空白对照组相比更为明显。这说明藻蓝蛋白提取物能促进角质降解使角质化层变薄，并具有一定的延缓衰老的作用。(2)实验组表皮层细胞的体积明显增大，细胞质丰富，核内染色质粗而多，细胞育良好，细胞数量也有增加，并以生发层为主，这些都说明了细胞的代谢增殖状况良好。(3)实验组的真皮层胶原纤维呈平行和相互交错的排列，纤维细胞增多，说明胶原代谢更新的状况良好，这对增强皮肤抵抗力和弹性有一定的作用。权利要求1．含藻蓝蛋白提取物的抗病毒组合物，其中含有治疗有效量的藻蓝蛋白提取物和／或药物学上可接受的载体，其中藻蓝蛋白提取物是以下列步骤制得的a．将蓝绿藻粉溶于5-20倍水中，低温保持8-30小时，b．固液分离，将溶液的pH值调至酸性，放置，c．收集所得固体为藻蓝蛋白粗品。2．根据权利要求1的组合物，其中所述藻粉选自螺旋藻粉。3．根据权利要求1的组合物，其中步骤a中水的用量为藻粉的8-15倍。4．根据权利要求3的组合物，其中步骤a中水的用量为藻粉的10倍。5．根据权利要求1的组合物，其中步骤b中溶液的pH值调节至3．8-4．2。6．藻蓝蛋白提取物的制备方法，其中包括步骤a．将蓝绿藻粉溶于5-20倍水中，低温保持8-30小时，b．固液分离，将溶液的pH值调至酸性，放置，c．收集所得固体为藻蓝蛋白粗品。7．根据权利要求6的组合物，其中藻粉选自螺旋藻粉。8．根据权利要求6的组合物，其中步骤a中水的用量为藻粉的8-15倍。9．根据权利要求8的组合物，其中步骤a中水的用量为藻粉的10倍。10．根据权利要求6的组合物，其中步骤b中溶液的pH值调节至3．8-4．2。全文摘要本发明提供了含藻蓝蛋白提取物的抗病毒组合物以及提取藻蓝蛋白的方法。文档编号A61P31/00GK1281727SQ9911083公开日2001年1月31日申请日期1999年7月22日优先权日1999年7月22日发明者刘兆乾,丁健,郭振泉,齐清申请人:齐清