一种甘精胰岛素前体的复性方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘精胰岛素前体的复性方法，属于生物医药蛋白折叠领域。本发明通过将甘精胰岛素前体溶解于变性剂溶液中，加入还原剂进行还原，调节pH值为9.5～11.5，控制反应体系的温度为35℃～45℃，反应30～60min，获得变性后的甘精胰岛素前体溶液；将变性后的甘精胰岛素前体加入稀释缓冲液中，再加入蛋白质折叠添加剂，调节pH值为9.5～11.5，向溶液中持续通入空气，控制反应体系的温度0℃～20℃，反应2～40小时，获得甘精胰岛素复性液。本发明缩短了复性反应时间，提高了正确折叠的蛋白含量，复性效率提高至51%～62%，同时降低了生产成本，适合工业化大生产应用。
【专利说明】一种甘精胰岛素前体的复性方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药蛋白折叠领域，具体涉及一种甘精胰岛素前体的复性方法，特别涉及一种利用聚乙二醇、甘油和金属离子等作为蛋白质折叠添加剂的空气氧化稀释复性方法，将错误折叠的甘精胰岛素前体转化成具有正确空间结构的前体，复性效率可以超过50%，降低了二硫键错配副产物的生成，给后续纯化工作带来了极大的方便。
【背景技术】
[0002]甘精胰岛素(glycine arginine insulin)是一种通过重组DNA技术生产并用于治疗1、II型糖尿病的长效胰岛素类生物制品。它是在人胰岛素B链羧基末端增加了两个精氨酸，同时也把A链羧基末端A21位置的天冬酰胺替换成甘氨酸，A链羧基末端为甘氨酸防止了脱氨产物的形成，使甘精胰岛素具有很好的稳定性；又由于增加的两个精氨酸带正电荷，所以甘精膜岛素的等电点由5.4 (膜岛素等电点)左右升闻至7.0左右，因此该膜岛素类似物可以在偏酸的条件下(PH4.0)配制成性质稳定且澄清的注射液。甘精胰岛素注射前勿需混悬，皮下注射后在体内(PH7.4)形成微小沉淀可持续缓慢释放甘精胰岛素，血浆浓度平稳，峰谷曲线小，作用持续时间长。每日皮下注射一次降糖作用可维持24小时，且无明显的血药峰值出现，可较好地模拟正常基础胰岛素的分泌，降低发生低血糖的概率。
[0003]目前国内外生产的甘精胰岛素前体采用大肠杆菌表达，其体系中缺乏真核生物形成蛋白正确结构的环 境以及相关的修饰元件，在大肠杆菌中高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。包涵体经过分离、变性溶解和复性后，形成有生物活性的蛋白，在复性过程中需要提供有利于单链蛋白的折叠环境，同时提供适当的氧化还原环境，使甘精胰岛素前体形成正确的二级结构。
[0004]复性的效率直接影响着产量的高低。复性是一个复杂的过程，复性过程中的蛋白聚集反应是导致复性率低的首要原因。当变性剂的浓度较低后，单链的蛋白分子迅速折叠形成大量的二级结构的中间态分子，中间态分子表面暴露的疏水区相互作用，发生聚集作用。蛋白的聚集和正确折叠式之间是竞争反应，因此减少蛋白的聚集作用，提高蛋白的正确折叠对复性至关重要。
[0005]现有技术中有关于胰岛素的复性方法，例如在F-J.鲁伯洛德C07K14/62，中国专利CN1132845C中公开了获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素前体的改进的方法，即在半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐和离液助剂存在下，获得到30%~50%的正确复性产物。王骊丽C07K14/62，中国专利CN103172727A中公开了一种高效体积排阻色谱复性同时纯化重组人胰岛素原的方法，尝试该方法在甘精胰岛素前体进行复性中，结果显示回收率低。目前，在已公开文献中鲜有关于甘精胰岛素高复性效率的工艺及参数报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于通过优化复性工艺参数，提供一种甘精胰岛素前体的复性方法，即用变性剂溶解包涵体，加入还原剂打开链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，具有一级结构的甘精胰岛素前体在稀释液中正确折叠成具有活性的蛋白，在复性过程中加入聚乙二醇、甘油、金属离子等蛋白质折叠添加剂。该方法能提高复性的效率至51%~62%，降低了二硫键错配副产物的生成，给后续纯化工作带来了极大的方便。
[0007]本发明的目的是通过采用下述技术方案来实现的:一种甘精胰岛素前体的复性方法，包括如下步骤:
[0008]将甘精胰岛素前体溶解于变性剂溶液中，得到溶液I ;再加入还原剂进行还原，调节pH值为9.5~11.5，控制反应体系I的温度为35°C~45°C，反应30~60min，获得变性后的甘精胰岛素前体溶液；将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入稀释缓冲液中，得到溶液II ;向溶液II中加入蛋白质折叠添加剂，调节PH值为9.5~11.5 ;接着向得到的溶液中持续通入空气，控制反应体系II的温度为O V~20°C，反应2~40小时，获得甘精胰岛素复性液。
[0009]所述的甘精胰岛素前体为由大肠杆菌通过重组DNA技术以包涵体形式表达获得，具体是利用基因重组技术对人胰岛素的进行结构改造而成，为20A-Gly21-C肽-30B-Arg31-Arg32，即将人胰岛素A链的第21位氨基酸由甘氨酸替换，同时在B链第30位氨基酸后引入两个精氨酸，再以C肽连接A链和B链后转入大肠杆菌中进行表达。
[0010]所述的溶液I中的甘精胰岛素前体的浓度优选为17~28g/L。
[0011 ] 所述的变性 剂为尿素或盐酸胍。
[0012]所述的变性剂溶液优选为6~8M尿素溶液或盐酸胍溶液，pH值为9.5~11.5 ;进一步优选6~8M、pH9.5~11.5的尿素溶液。
[0013]所述的还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸盐酸盐中的一种或两种。
[0014]所述的还原剂的用量为按还原剂与甘精胰岛素前体质量比1:2~1:4计算。
[0015]所述的稀释缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碳酸氢铵和磷酸盐中的一种制备得到的缓冲液。
[0016]所述的稀释缓冲液优选为10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl缓冲液或10~50mM、pH9.5~11.5的甘氨酸缓冲液。
[0017]所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度优选为0.8~2.0g/L，更优选为 1.0 ~1.4g/L。
[0018]所述的蛋白质折叠添加剂为聚乙二醇、甘油和金属离子中的至少一种。
[0019]所述的聚乙二醇为PEG4000或PEG6000。
[0020]所述的金属离子为Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+中的一种。
[0021]所述的蛋白质折叠添加剂优选为以所述的溶液II的体积为分母，浓度为0.5~2g/L的聚乙二醇、体积百分比5%~20%的甘油和5~50 μ M的金属离子组成，进一步优选为浓度为0.5~2g/L的聚乙二醇4000、体积百分比5%~20%的甘油和5~20 μ M的Cu2+组成。
[0022]所述的Cu2+由CuSO4或CuCl2提供。
[0023]所述的通入空气优选为将空气按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通入。
[0024]所述的反应体系II的反应条件优选为4~15°C反应12~25小时。
[0025]所述的甘精胰岛素前体的复性方法，更具体包括如下步骤:[0026](I)甘精胰岛素的变性方法:将甘精胰岛素前体溶解于6~8M、pH9.5~11.5的变性剂溶液中，得到溶液I ;加入还原剂，调节PH值为9.5~11.5，其中还原剂与甘精胰岛素前体按质量比1:2~1:4配比，控制反应体系的温度为35°C~45°C，反应30~60min，获得变性后的甘精胰岛素前体溶液；
[0027](2)甘精胰岛素的复性方法:将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入稀释缓冲液中，得到溶液II;向溶液II中加入聚乙二醇、甘油和金属离子，其中，以溶液II的体积为基准，聚乙二醇的浓度为0.5~2g/L，甘油的浓度为体积百分比5%~20%、金属离子的浓度为5~50 μ M，调节pH值为9.5~11.5 ;接着向所得溶液中持续通入空气，控制反应体系的温度(TC~20°C，反应2~40小时，获得甘精胰岛素复性液；
[0028]步骤(1)中所述的甘精胰岛素前体为由大肠杆菌通过重组DNA技术以包涵体形式表达获得，具体是利用基因重组技术对人胰岛素的进行结构改造而成，为20A-Gly21-C肽-30B-Arg31-Arg32，即将人胰岛素A链的第21位氨基酸由甘氨酸替换，同时在B链第30位氨基酸后引入两个精氨酸，再以C肽连接A链和B链后转入大肠杆菌中进行表达；优选将甘精胰岛素前体按17~28g/L的浓度溶解于6~8M的变性剂溶液中；
[0029]步骤(1)中所述的变性剂优选为尿素或盐酸胍；
[0030]步骤(1)中所述的还原剂优选为DTT和半胱氨酸盐酸盐中的一种或两种；
[0031]步骤(2)中所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度优选为0.8~
2.0g/L，更优选为 1.0~1.4g/L;
[0032]步骤(2)中所述的稀释缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碳酸氢铵和磷酸盐中的一种配制得到的缓冲液；
`[0033]所述稀释缓冲液优选为10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl缓冲液或10~50mM、pH9.5~11.5的甘氨酸缓冲液；
[0034]步骤(2)中所述的聚乙二醇选自PEG4000和PEG6000中的一种；优选为聚乙二醇4000 ；
[0035]步骤(2)中所述的金属离子为Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+中的一种；优选为由CuSO4或CuCl2提供的Cu2+ ;浓度优选为5~20 μ M ;
[0036]步骤(2)中所述的通入空气优选为将空气按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通入；
[0037]步骤(2)中所述的反应体系的反应温度优选为4~15°C ;
[0038]步骤(2)中所述的反应体系的反应时间优选为12~25小时。
[0039]本发明中的还原剂的加入比例在甘精胰岛素前体复性过程至关重要的。甘精胰岛素前体含有三对二硫键，在大肠杆菌表达形成包涵体过程中，链间和链内的二硫键错配导致蛋白无活性，需要加入巯基还原剂进行处理以还原这些二硫键，还原剂的加入比例需要考虑到后续的复性过程。当加入过高浓度的还原剂时，不仅能够还原打开包涵体中错误配对的二硫键，还能还原包涵体中正确配对的二硫键，给后续的复性反应造成困难，而低浓度的还原剂由于不能够彻底还原包涵体中错误配对的二硫键，同样会直接影响复性反应中目的蛋白正确折叠和二硫键正确配对。本发明优选还原剂与甘精胰岛素前体的质量比优选为1:3加入还原剂。
[0040]本发明中蛋白质折叠添加剂聚乙二醇、甘油和金属离子的加入对甘精胰岛素前体复性的效率提高很大。甘精胰岛素前体的稀释氧化复性体系，是以空气中的氧气作为氧化剂。蛋白质折叠添加剂可以减少聚集，促进折叠，如聚乙二醇可以保护熔球体，增加黏度，甘油对蛋白质具有优先的水合作用，金属离子可以催化蛋白质中还原剂残基的空气氧化速率。蛋白质折叠添加剂的加入，可以加速形成正确配对的二硫键，从而有效增加了正确折叠的目的蛋白含量，同时也大大缩短了包涵体的复性反应时间。本发明优选为0.5~2g/L聚乙二醇4000，金属离子溶液为5~20 μ M CuSO4或CuCl2。
[0041]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0042](1)本发明涉及的甘精胰岛素前体复性方法，二硫键错配的副产物少，所得的复性液更有利于后续的纯化工艺。
[0043](2)本发明采用蛋白质折叠添加剂聚乙二醇、甘油和金属离子辅助复性，缩短了反应时间，提高了正确折叠的蛋白含量，大大地提高复性效率至51%~62%。
[0044](3)本发明涉及的复性方法，采用稀释复性，以空气作为氧化剂，大大的降低了生产成本，且适合工业化大生产应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1实施例1复性后的样品HPLC图谱图。
[0046]图2实施例2复性后的样品HPLC图谱图。
[0047]图3实施例3复性后的样品HPLC图谱图。
[0048]图4实施例4复性后的样品HPLC图谱图。
【具体实施方式】
[0049]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0050]本发明实施例在复性过程中用于检测复性效率(％)的公式如下:
[0051]复性效率(％)=(复性后正确折叠的甘精胰岛素前体质量/复性前甘精胰岛素前体质量)X 100%
[0052]实验材料:
[0053]甘精胰岛素前体:珠海联邦制药股份有限公司提供，批号F18121101 ;具体为按美国专利 US6100376 (A211B30, MODIFIED INSULIN DERIVATIVES HAVING AN ALTERED ACTIONPROFILE)中实施例6制备。
[0054]尿素来源于广州西陇化工有限公司；半胱氨酸盐酸盐来源于武汉远大弘元股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷来源于北京科奥科技有限公司；聚乙二醇4000来源于湖南尔康制药股份有限公司；甘油来源于湖南尔康制药股份有限公司；硫酸铜来源于广州西陇化工有限公司；氯化铜来源于广州西陇化工有限公司；盐酸来源于珠海市华成达化工有限公司；氢氧化钠来源于东江化学试剂有限公司。
[0055]通气设备:E+H空气流量计、压缩空气。
[0056]实施例1甘精胰岛素前体的复性
[0057]室温下，将10克甘精胰岛素前体溶解于588mL6M、pH9.5的尿素溶液中，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度约为17g/L ;再加入5g DTT，调节pH值为9.5，控制反应体系的温度为35°C，反应 30min。
[0058]将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入10mM、pH9.5的Tri s_HCl缓冲液中，用Tris-HCl缓冲液定容至10L，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度为l.0g/L，接着加入5gPEG4000、500mL甘油、8mg CuSO4,调节pH值为9.5，以20cm3/H的速率向复性液中持续通入空气，控制反应体系的温度为4°C，反应12小时后停止该反应。取复性液20 μ L经HPLC分析检测，复性后的样品HPLC图谱见图1，正确折叠复性的甘精胰岛素前体HPLC图谱的保留时间为19.98min，根据甘精胰岛素前体的峰面积归一化法计算复性后实际得到正确折叠复性的甘精胰岛素前体的量为6.lg，甘精胰岛素前体复性的收率经计算约为61%。
[0059]实施例2甘精胰岛素前体的复性
[0060]室温下，将10克甘精胰岛素前体溶解于357mL8M、pHll.5的尿素溶液中，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度约为28g/L，加入2.5g DTT，调节pH值为11.5，控制反应体系的温度为45°C，反应 60min。
[0061]将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入50mM、pHll.5的Tris-HCl缓冲液中，用Tris-HCl缓冲液定容至7.14L，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度为1.4g/L，接着加入14.28gPEG4000、1428mL甘油、22.85mg CuSO4，调节pH值为11.5,以714cm3/H的速率向复性液中持续通入空气，控制反应体系的温度15°C，反应25小时后停止该反应。取复性液20 μ L经HPLC分析检测，复性后的样品HPLC图谱见图2，正确折叠复性的甘精胰岛素前体HPLC图谱的保留时间为20.71min，根据甘精胰岛素前体的峰面积归一化法计算复性后实际得到正确折叠复性的甘精胰岛素前体的量为5.14g，甘精胰岛素前体复性的收率经计算约为51.40% ο
[0062]实施例3甘精胰岛素前体的复性
[0063]室温下，将10克甘精胰岛素前体溶解于588mL6M、pH9.5的尿素溶液中，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度约为17g/L,加入5g半胱氨酸盐酸盐,调节pH值为9.5,控制反应体系的温度为35°C，反应30min。
[0064]将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入10mM、pH9.5的甘氨酸稀释缓冲液中，用甘氨酸稀释缓冲液定容至10L，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度为1.(^/1，接着加入58PEG4000、500mL甘油、6.75mg CuCl2，调节pH值为9.5，以20cm3/H的速率向复性液中持续通入空气，控制反应体系的温度4°C，反应12小时后停止该反应。取复性液20 μ L经HPLC分析检测，复性后的样品HPLC图谱见图3，正确折叠复性的甘精胰岛素前体HPLC图谱的保留时间为19.94min，根据甘精胰岛素前体的峰面积归一化法计算复性后实际得到正确折叠复性的甘精胰岛素前体的量为6.2g，甘精胰岛素前体复性的收率经计算约为62%。
[0065]实施例4甘精胰岛素前体的复性
[0066]室温下，将10克甘精胰岛素前体溶解于357mL8M、pHll.5的尿素溶液中，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度约为28g/L,加入2.5g半胱氨酸盐酸盐,调节pH值为11.5,控制反应体系的温度为45°C，反应60min。
[0067]将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入50mM、pHll.5的甘氨酸稀释缓冲液中，用甘氨酸稀释缓冲液定容至7.14L，使甘精胰岛素前体的蛋白浓度为1.4g/L，接着加入14.28gPEG4000、1428mL甘油、19.28mg的CuCl2，调节pH值为IL 5，以714cm3/H的速率向复性液中持续通入空气，控制反应体系的温度15°C，反应25小时后停止该反应。取复性液20 μ L经HPLC分析检测，复性后的样品HPLC图谱见图4，正确折叠复性的甘精胰岛素前体HPLC图谱的保留时间为20.75min，根据甘精胰岛素前体的峰面积归一化法计算复性后实际得到正确折叠复性的甘精胰岛素前体的量为5.35g，甘精胰岛素前体复性的收率经计算约为53.5%。
[0068]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式 ， 都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于包括如下步骤:将甘精胰岛素前体溶解于变性剂溶液中，得到溶液I ;再加入还原剂进行还原，调节PH值为9.5~11.5，控制反应体系I的温度为35°C~45°C，反应30~60min，获得变性后的甘精胰岛素前体溶液；将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入稀释缓冲液中，得到溶液II ;向溶液II中加入蛋白质折叠添加剂，调节pH值为9.5~11.5 ;接着向得到的溶液中持续通入空气，控制反应体系II的温度为0°C~20°C，反应2~40小时，获得甘精胰岛素复性液。
2.根据权利要求1所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于: 所述的溶液I中的甘精胰岛素前体的浓度为17~28g/L ； 所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度为0.8~2.0g/L。
3.根据权利要求2所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于:所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度为1.0~1.4g/L。
4.根据权利要求1所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于: 所述的变性剂为尿素或盐酸胍； 所述的还原剂为二硫苏糖醇和半胱氨酸盐酸盐中的一种或两种； 所述的稀释缓冲液为三羟甲基氨基甲烷 、甘氨酸、碳酸氢铵和磷酸盐中的一种制备得到的缓冲液； 所述的蛋白质折叠添加剂为聚乙二醇、甘油和金属离子中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于: 所述的变性剂溶液为6~8M、pH9.5~11.5的尿素溶液或盐酸胍溶液； 所述的还原剂的用量为按还原剂与甘精胰岛素前体质量比1:2~1:4计算； 所述的稀释缓冲液为10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl缓冲液或10~50mM、pH9.5~11.5的甘氨酸缓冲液。
6.根据权利要求4所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于: 所述的聚乙二醇为PEG4000或PEG6000 ； 所述的金属离子为Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe3+中的一种； 所述的蛋白质折叠添加剂为由以溶液II体积为基准，浓度为0.5~2g/L的聚乙二醇、体积百分比5%~20%的甘油和5~50 μ M的金属离子组成。
7.根据权利要求6所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于:所述的蛋白质折叠添加剂为由以溶液11体积为基准，浓度为0.5~2g/L的聚乙二醇4000、体积百分比5%~20%的甘油和5~20 μ M的Cu2+组成。
8.根据权利要求1所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于:所述的通入空气为将空气按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通入； 所述的反应体系II的反应条件为4~15°C反应12~25小时。
9.根据权利要求1~8任一项所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于包括如下步骤: (O甘精胰岛素的变性方法:将甘精胰岛素前体溶解于6~SM、pH9.5~11.5的变性剂溶液中，得到溶液I ;加入还原剂，调节PH值为9.5~11.5，其中还原剂与甘精胰岛素前体按质量比1:2~1:4配比，控制反应体系的温度为35°C~45°C，反应30~60min，获得变性后的甘精胰岛素前体溶液；(2)甘精胰岛素的复性方法:将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入稀释缓冲液中，得到溶液II ;向溶液II中加入聚乙二醇、甘油和金属离子，其中，以溶液II的体积为基准，聚乙二醇的浓度为0.5~2g/L，甘油的浓度为体积百分比5%~20%、金属离子的浓度为5~.50 μ M，调节pH值为9.5~11.5 ;接着向所得溶液中持续通入空气，控制反应体系的温度(TC~20°C，反应2~40小时，获得甘精胰岛素复性液。
10.根据权利要求9所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于: 步骤(1)中所述的溶液I中的甘精胰岛素前体的浓度为17~28g/L ； 步骤(1)中所述的变性剂为尿素或盐酸胍； 步骤(1)中所述的还原剂为DTT和半胱氨酸盐酸盐中的一种或两种； 步骤(2)中所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度为1.0~1.4g/L ； 所述稀释缓冲液为10~50mM、pH9.5~11.5的Tris-HCl缓冲液或10~50mM、pH9.5~.11.5的甘氨酸缓冲液； 所述的聚乙二醇为PEG4000 ； 步骤(2)中所述的金属离子为Cu2+，浓度为5~20μ M ; 步骤(2)中所述的通入空气为将空气按每升溶液中以2~100cm3/H的速率向溶液中通 A ； 步骤(2)中所述的反应体系的反应温度为4~15°C ； 步骤(2)中所述的反应体系的反应时间为12~25小时。
【文档编号】C07K1/14GK103694339SQ201310754124
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】黄晓泉, 肖拥军, 曹春来, 张伟 申请人:珠海联邦制药股份有限公司