从植物甾醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法和工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种从植物甾醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法和工艺。所述方法包括：采用植物甾醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮；将发酵结束后的发酵液通过离心机进行液固分离，提取湿固体物料；在所述湿固体物料中加入丙酮-纯水的混合溶剂，在升温至40-60℃的条件下持续搅拌60-90分钟后，在40℃以上的温度条件下进行固液分离；对固液分离后得到的溶液进行结晶处理；对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品。本发明可以减少4-雄烯二酮产品中的杂质，简化提取精制的过程。
【专利说明】从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法和工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及发酵领域，特别是涉及一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法和工艺。
【背景技术】 [0002]4-雄烯二酮是合成甾体激素类药物的重要中间体，目前主要由植物甾醇作为主要原料经微生物发酵制得。由于发酵过程中很难将植物留醇全部转化为4-雄烯二酮，因此，发酵结束后发酵液中存在着植物留醇和4-雄烯二酮两种物质。发酵结束后需要用适当的有机溶剂将4-雄烯二酮从发酵液中分离提取出来。
[0003]目前国内在这一提取过程中使用的有机溶剂有多种，例如乙酸乙酯，乙酸丁酯，丙酮，甲醇，乙醇，二氯甲烷等。而上述这些溶剂，对植物甾醇和4-雄烯二酮这两种物质没有选择性(或选择性很低)，其结果是经过上述溶剂的提取，两种物质都被提取到有机溶剂中，给其后的分离精制过程(精制的目的是制备高纯度的4-雄烯二酮)带来了很大的麻烦。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种从植物甾醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法，以减少4-雄烯二酮产品中的杂质，简化提取精制的过程。
[0005]为了解决上述问题，本发明公开了一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法，包括:
[0006]采用植物留醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮；
[0007]将发酵结束后的发酵液通过离心机进行液固分离，提取湿固体物料；
[0008]在所述湿固体物料中加入丙酮-纯水的混合溶剂，在升温至40_60°C的条件下持续搅拌60-90分钟后，在40°C以上的温度条件下进行固液分离，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80% ；
[0009]对固液分离后得到的溶液进行结晶处理，所述结晶处理包括:将所述溶液升温至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，对所述溶液逐渐降温至0-10°C后保温0.5-2.0小时，降温速度为每小时5~7°C，所述结晶的过程中持续搅拌，搅拌的速度为15 ~25r/min ；
[0010]对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品。
[0011]优选地，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品的步骤包括:
[0012]在所述粗品中按照每升丙酮溶解180g粗品的比例加入丙酮；
[0013]采用80°C的水浴进行升温，升温至40-60°C后保温一小时，缓慢降温至0-10°C时停止降温，保温0.5-2.0小时后进行离心，将离心后的固相作为4-雄烯二酮成品。
[0014]优选地，所述方法还包括:
[0015]对所述4-雄烯二酮成品进行干燥，得到干燥的成品。[0016]本发明还提供了一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的工艺，包括:
[0017]采用植物留醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮；
[0018]将发酵结束后的发酵液通过涡螺离心机进行液固分离，将分离后的湿固体物料置入提取te ；
[0019]在所述提取罐中加入丙酮-纯水的混合溶剂，对所述提取罐加热至40_60°C的条件下持续搅拌90分钟，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80%，所述提取罐的顶部安装有回流装置以防止所述混合溶剂中的丙酮挥发；
[0020]在40°C以上的温度条件下，使用碟片离心机或板框压滤机进行固液分离；
[0021]对固液分离后得到的溶液进行结晶处理，所述结晶处理包括:将所述溶液升温至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，对所述溶液逐渐降温至0-10°C后保温0.5-2.0小时，降温速度为每小时5~7°C，所述结晶的过程中持续搅拌，搅拌的速度为15 ~25r/min ；
[0022]采用吊带离心机对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品。
[0023]优选地，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品的步骤包括:
[0024]将所述粗品投入到结晶罐中，按照每升丙酮溶解180g粗品的比例加入丙酮；
[0025]向所述结晶罐的夹套内通入80°C的热水进行升温，升温至40-60°C后保温一小时，缓慢降温至0-10°C时停止降温，保温0.5-2.0小时后进行离心，将离心后的固相作为4-雄烯二酮成品。
[0026]优选地，所述工艺还包括:`
[0027]将所述4-雄烯二酮成品装入到双锥干燥机内进行干燥，得到干燥的成品。
[0028]与现有技术相比，本发明包括以下优点:
[0029]依据本发明实施例，在发酵结束后，对提取的湿固体物料中加入丙酮-纯水的混合溶剂，在升温至40-60°C的条件下持续搅拌60-90分钟后进行固液分离，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80%，并对分离后的溶液按照预设的条件进行结晶和离心处理得到4-雄烯二酮成品。相比于【背景技术】，本发明实施例采用了一种新的溶剂系统，将丙酮和纯水按一定比例配制成混合溶剂，代替了传统的单一溶剂，此混合溶剂在一定温度下对4-雄烯二酮有较好的溶解度，而对植物留醇的溶解度极小。因此，本发明实施例可以选择性地将发酵产物4-雄烯二酮提取出来，而将植物留醇留在残渣中。提取后混合溶剂中的植物留醇量极小(可以忽略不计)。使用该溶剂系统，本发明制备的4-雄烯二酮产品质量好，极大地减少了 4-雄烯二酮产品中的杂质，简化了提取精制的过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是本发明的一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法实施例的流程图；
[0031]图2是本发明的一种从植物甾醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的工艺实施例的流程图；
[0032]图3给出了本发明示例中从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的工艺的流程图。
【具体实施方式】
[0033]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0034]参见图1给出了本发明的一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法实施例的流程图，包括:
[0035]发酵步骤101、采用植物留醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮。
[0036]4-雄烯二酮(4-androstenedione)简称AD,本发明实施例采用植物甾醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮，可以采用现有技术中任意一种可实现的具体方法，一般而言，已知的发酵方法包括在适当的营养培养基中增殖分枝杆菌属突变体，将培养物转入含植物甾醇的生物反应器中，随后经过大约120小时生物转化为AD。
[0037]发酵液的离心分离步骤102、将发酵结束后的发酵液通过离心机进行液固分离，提取湿固体物料。
[0038]发酵结束后，先将发酵液通过离心机进行液固分离，由于产物4-雄烯二酮位于湿固体物料中，因此发酵液的离心分离这一过程的目的是将含有4-雄烯二酮的固相与液相(发酵废水)分离，将湿固体物料(称为菌渣)保留，菌渣中含有4-雄烯二酮、残余的植物甾醇、微生物菌体以及残余的发酵培养基成分,将水相(废液)弃去。
[0039]混合溶剂提取步骤103、在所述湿固体物料中加入丙酮-纯水的混合溶剂，在升温至40-60°C的条件下持续搅拌60-`90分钟后，在40°C以上的温度条件下进行固液分离，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80%。
[0040]本发明所述的方法适用于水相发酵液，需要说明的是，该方法并不适用于水油两相发酵液。
[0041]具体而言，对湿固体物料进行秤重后，再按一定的比例加入计算量的丙酮和纯水，然后升温至40-60度并搅拌90分钟进行提取，提取结束后，趁热进行固液分离，为了防止丙酮挥发，可以在本步骤进行的设备中安装有回流装置。
[0042]其中，菌渣与混合溶剂的比例为1:4，即Ikg重量的菌渣，加入4L的混合溶剂。
[0043]搅拌后，在40°C以上的温度条件下进行固液分离，固液分离的目的是将混合溶剂提取后的液相与固相分离。此时，4-雄烯二酮已经被提取到混合溶剂的液相中，而固相中主要含有菌体、不溶解的培养基成分和植物留醇。固液分离的温度需要保持温度在40度以上，以防止在低温下4-雄烯二酮结晶析出。此步得到的滤液通入到结晶罐中，而固相为废弃物。
[0044]结晶步骤104、对固液分离后得到的溶液进行结晶处理，所述结晶处理包括:将所述溶液升温至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，对所述溶液逐渐降温至0-10°C后保温0.5-2.0小时，降温速度为每小时5~7°C，所述结晶的过程中持续搅拌，搅拌的速度为15~25r/min。
[0045]结晶时先对溶液加热至40_60°C，以使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，然后，停止加热，并控制溶液缓慢降温，每小时降低5~7°C，当降至0-10度时停止降温，并保持此温度0.5-2.0小时后进行放料离心。[0046]精制步骤105、对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品。
[0047]将结晶后的物料进行离心，得到的固相为4-雄烯二酮的湿粗品，液相为粗品母液，可以回收。
[0048]其中，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品的步骤可以包括:
[0049]子步骤S11、在所述粗品中按照每升丙酮溶解180g粗品的比例加入丙酮；
[0050]子步骤S12、采用80°C的水浴进行升温，升温至40-60°C后保温一小时，缓慢降温至0-10°C时停止降温，保温0.5-2.0小时后进行离心，将离心后的固相作为4-雄烯二酮成
品O
[0051]在制得成品后，还可以对成品进行进一步的精制，具体还包括:
[0052]对所述4-雄烯二酮成品进行干燥，得到干燥的成品。
[0053]综上所述，依据本发明实施例，在发酵结束后，对提取的湿固体物料中加入丙酮-纯水的混合溶剂，在升温至40-60°C的条件下持续搅拌60-90分钟后进行固液分离，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80%，并对分离后的溶液按照预设的条件进行结晶和离心处理得到4-雄烯二酮成品。相比于【背景技术】，本发明实施例采用了一种新的溶剂系统，将丙酮和纯水按一定比例配制成混合溶剂，代替了传统的单一溶剂，此混合溶剂在一定温度下对4-雄烯二酮有较好的溶解度，而对植物甾醇的溶解度极小。因此，本发明实施例可以选择性地将发酵产物4-雄烯二酮提取出来，而将植物留醇留在残渣中。提取后混合溶剂中的植物留醇量极小(可以忽略不计)。使用该溶剂系统，本发明制备的4-雄烯二酮产品质量好，极大地减少了 4-雄烯二酮产品中的杂质，简化了提取精制的过程。
`[0054]参见图2给出了本发明的一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的工艺实施例的流程图，包括:
[0055]步骤201、采用植物留醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮。
[0056]步骤202、将发酵结束后的发酵液通过涡螺离心机进行液固分离，将分离后的湿固体物料置入提取罐。
[0057]发酵液的离心分离的目的是将含有4-雄烯二酮的固相与液相(发酵废水)分离，然后将水相弃去，保留固相(称为菌渣)。菌渣中含有4-雄烯二酮、残余的植物留醇、微生物菌体以及残余的发酵培养基成分，分离用的设备为涡螺离心机。
[0058]步骤203、在所述提取罐中加入丙酮-纯水的混合溶剂，对所述提取罐加热至40-60°C的条件下持续搅拌90分钟，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80%，所述提取罐的顶部安装有回流装置以防止所述混合溶剂中的丙酮挥发。
[0059]混合溶剂提取过程使用的设备为提取罐，菌渣与混合溶剂的比例为1:4 ( Ikg重量的菌渣，加入4L的混合溶剂，在提取罐中进行加热搅拌90分钟，加热至40-60度，为了防止丙酮挥发，提取罐顶部安装有回流装置。
[0060]步骤204、在40°C以上的温度条件下，使用碟片离心机或板框压滤机进行固液分离。
[0061]这步操作的目的是将提取后的液相与固相分离。此时，4-雄烯二酮已经被提取到混合溶剂的液相中，而固相中主要含有菌体、不溶解的培养基成分和植物留醇。分离使用的设备为碟片离心机，也可以使用板框压滤机。此过程需要保持温度在40度以上，以防止在低温下4-雄烯二酮结晶析出。此步得到的滤液通入到结晶罐中，而分离出的固相为废弃物。
[0062]步骤205、对固液分离后得到的溶液进行结晶处理，所述结晶处理包括:将所述溶液升温至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，对所述溶液逐渐降温至
0-10°C后保温0.5-2.0小时，降温速度为每小时5~TC，所述结晶的过程中持续搅拌，搅拌的速度为15~25r/min。
[0063]结晶处理时先将溶液(滤液)搅拌并升温至40-60度，而后开始逐渐降温，控制降温速度为每小时5-7度，当降至0-10度时停止降温，并保持此温度0.5-2.0小时后进行放料离心。结晶过程中控制搅拌速度在15-25r/min。
[0064]步骤206、采用吊带离心机对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品。
[0065]将结晶后的物料通入到吊带离心机中进行离心，得到的固相为4-雄烯二酮的湿粗品，液相为粗品母液(回收)。
[0066]其中，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品的步骤包括:
[0067]将所述粗品投入到结晶罐中，按照每升丙酮溶解180g粗品的比例加入丙酮；
[0068]向所述结晶罐的夹套内通入80°C的热水进行升温，升温至40-60°C后保温I小时，缓慢降温至0-10°C时停止降温，保温0.5-2.0小时后进行离心，将离心后的固相作为4-雄烯二酮成品。
[0069]将粗品投入到结晶罐内，按照每升丙酮溶解180g粗品的量加入丙酮，向结晶罐的夹套内通入80度热水进行升温，升温至40-60度后保持I小时，然后再缓慢降温，当温度降至0-10度时，停止降温，保持该温度0.5-2.0小时后，放料离心，得到固相为湿成品，液相为成品母液(回收)。
[0070]进一步优选地，所述工艺还可以包括:
[0071]将所述4-雄烯二酮成品装入到双锥干燥机内进行干燥，得到干燥的成品。
[0072]将湿成品装入到双锥干燥机内进行干燥，得到干燥的成品。
[0073]本实施例中离心机的使用主要在以下几步中，离心机的选取主要依据各步的物料性质和工艺要求而定。
[0074]例如:本实施例第一次使用的离心机是用来将发酵液中的废水和发酵液中的固体物料(菌渣)分开，此时的物料为 水性物料，不含有机溶剂，但发酵液较粘。此时使用涡螺离心机是因为该离心机适合粘性物料的分离，同时由于物料中不含有机溶剂，而不必担心涡螺离心机密封性差的缺点。
[0075]本实施例中第二次使用的离心机是用来从提取罐放出的物料中将丙酮-水提取液和料渣分开，此时物料的特点是物料中含有热的有机溶剂，对提取设备的要求除了要能分离开液固两相外，还要求设备的密封性较好，避免热的有机溶剂挥发，固此时选用密封性较好的碟片离心机，或使用带隔膜阀的板框压滤机。这两款离心机密封性较好，可以降低有机溶剂的挥发。
[0076]本实施例中第三次和第四次使用的离心机是用来分离结晶罐放出的料液(主要含结晶AD湿粗品和结晶母液)，此时物料的特点是:低温，含有机溶剂多，由于有结晶性颗粒的存在，物料过滤性较好，不粘稠。此时选用吊带式离心机是因为该离心机的密封性较好，可以防止离心时有机溶剂的挥发，此外如选用自动下料式吊带离心机还可以减轻劳动强度，避免工人直接接触有机溶剂，有利于保护劳动者的身体健康。
[0077]为了使本领域技术人员更好地理解本发明，通过具体的示例对本发明的从植物甾醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮(AD)的工艺进行说明，参见图3给出了本发明示例中从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的工艺的流程图，具体包括:
[0078]对水相发酵液进行液固分离，得到将水相的废水排污弃去，保留固相的菌渣。对固相的菌渣采用丙酮-水的混合溶剂进行提取。提取的混合液进行液固两相分离，固相为提取后的料渣，可以弃去，液相为混合溶剂的提取液，进行降温结晶后离心处理，得到AD粗品.AD粗品进一步采用一定比例的丙酮加热溶解，并降温结晶，得到AD的湿精品，进一步干燥后得到干燥的AD成品。
[0079]其中具体的细节在上述两个实施例中有详细说明，此处不再赘述。
[0080]下面通过三个表分别示出了 4-雄烯二酮发酵提取生产的三个具体的示例及主要参数:
[0081]示例一、
[0082]
【权利要求】
1.一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的方法，其特征在于，包括: 采用植物留醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮； 将发酵结束后的发酵液通过离心机进行液固分离，提取湿固体物料； 在所述湿固体物料中加入丙酮-纯水的混合溶剂，在升温至40-60°C的条件下持续搅拌60-90分钟后，在40°C以上的温度条件下进行固液分离，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80% ； 对固液分离后得到的溶液进行结晶处理，所述结晶处理包括:将所述溶液升温至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，对所述溶液逐渐降温至0-10°C后保温0.5-2.0小时，降温速度为每小时5~7°C，所述结晶的过程中持续搅拌，搅拌的速度为15 ~25r/min ； 对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品的步骤包括: 在所述粗品中按照每升丙酮溶解180g粗品的比例加入丙酮； 采用80°C的水浴进行升温，升温至40-60°C后保温一小时，缓慢降温至0-10°C时停止降温，保温0.5-2.0小时后进 行离心，将离心后的固相作为4-雄烯二酮成品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括: 对所述4-雄烯二酮成品进行干燥，得到干燥的成品。
4.一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二酮的工艺，其特征在于，包括: 采用植物留醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮； 将发酵结束后的发酵液通过涡螺离心机进行液固分离，将分离后的湿固体物料置入提取te ； 在所述提取罐中加入丙酮-纯水的混合溶剂，对所述提取罐加热至40-60°C的条件下持续搅拌90分钟，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙酮的比例为70~80%，所述提取罐的顶部安装有回流装置以防止所述混合溶剂中的丙酮挥发； 在40°C以上的温度条件下，使用碟片离心机或板框压滤机进行固液分离； 对固液分离后得到的溶液进行结晶处理，所述结晶处理包括:将所述溶液升温至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，对所述溶液逐渐降温至0-10°C后保温0.5-2.0小时，降温速度为每小时5~7°C，所述结晶的过程中持续搅拌，搅拌的速度为15 ~25r/min ； 采用吊带离心机对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品。
5.如权利要求4所述的工艺，其特征在于，对所述粗品进行精制得到4-雄烯二酮成品的步骤包括: 将所述粗品投入到结晶罐中，按照每升丙酮溶解180g粗品的比例加入丙酮； 向所述结晶罐的夹套内通入80°C的热水进行升温，升温至40-60°C后保温一小时，缓慢降温至0-10°C时停止降温，保温0.5-2.0小时后进行离心，将离心后的固相作为4-雄烯二酮成品。
6.如权利要求4所述的工艺，其特征在于，还包括:将所述4-雄烯二 酮成品装入到双锥干燥机内进行干燥，得到干燥的成品。
【文档编号】C07J1/00GK103773832SQ201310754003
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】何建勇, 刘艳玲, 潘之安 申请人:菏泽赛托生物科技有限公司