本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种植物甾醇酯及其低温制备方法。
背景技术：
植物甾醇，又称植物固醇，属甾类化合物，是以环戊烷多氢菲为骨架(又称甾核)的一类天然活性物质，广泛存在于各种植物油、坚果和植物种子中，也存在于其它植物性食物和蔬菜水果中，种类繁多，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇，其中β-谷甾醇含量最高，大约占总甾醇的50～90％，是油脂不皂化物的主要成分。
植物甾醇是国际营养学会推荐的未来十大功能性营养成分之一。作为一种天然植物性食品添加剂，在人体小肠中，植物甾醇能够抑制胆固醇的吸收，从而可以有效降低血液中总胆固醇浓度和低密度脂蛋白胆固醇的含量，但是并不降低对人体有益的高密度脂蛋白胆固醇的含量，并且没有任何副作用，被美国食品及药物管理局(FDA)认可为“降低血脂、预防动脉硬化”的天然保健食品新原料，是预防心脑血管疾病“生命的钥匙”。但植物甾醇在水中几乎不溶，在油中的溶解度也很小，一般情况下在40℃其溶解度小于2％，而当添加量大于2％时，其只能以片剂或胶囊形式摄入，因此作为食品添加剂形式应用时就比较困难，或者效果不佳。
植物甾醇酯是植物甾醇通过其C-3位羟基与脂肪酸或脂肪酸甲酯等化合形成的植物甾醇衍生物，具有和植物甾醇相同的生理活性功能。植物甾醇酯比植物甾醇油溶性更好，熔点更低，能够解决植物甾醇在食品应用中的限制问题，提高了生物利用率，而且可改变其加工使用性能，是一种理想的新型功能性食品基料。
目前，对植物甾醇酯的合成方法已进行了诸多研究，主要有化学催化合成法(化学法)和生物催化合成法(酶法)：
US0015347公开了一种利用菜油甲酯与植物甾醇制备植物甾醇酯的方法，反应过程以甲醇钠为催化剂，甲醇钠的强腐蚀性和制备过程中的副产物甲醇，使其不能用于食品添加剂；
US0068425公开了一种富含油酸的植物甾醇酯的制造方法，但其在制造过程中应用到污染较大的二氯亚砜做催化剂，而且其操作条件苛刻，难于工业化生产；
EP195311描述了脂肪酶催化脂肪酸、植物甾醇直接酯化合成甾醇酯的方法，其反应体系为含水的有机溶剂。直接酯化法优点是可得到单一脂肪酸甾醇酯，方便地调整产品熔点等特性，并可实现功能性多不饱和脂肪酸与甾醇的协同增效作用；
US0020098536公开了以大豆油脱臭物为原料，脂肪酶催化植物甾醇、甘油三酯转酯化反应生成混合脂肪酸甾醇酯的方法。该法可原位生产(脱臭物无需分离即可直接作为反应原料，不需要纯的甾醇、脂肪酸做原料)，成本低。总体来讲，生物催化剂专一性强，反应条件温和，产物特性好，环境友好。但催化活性不高，容易失活，成本较高，尚不能满足工业化需要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种植物甾醇酯低温制备方法，以克服化学催化合成法(化学法)反应温度过高对植物甾醇的影响，同时克服生物催化合成法(酶法)制备时的单一性问题。本发明工艺既有化学催化合成法(化学法)的高效反应时间，又有生物催化合成法(酶法)制备的温和反应条件，减少能源消耗，利于工业化生产。
本发明所要解决的技术问题还在于提供上述方法制得的植物甾醇酯，以克服化学催化合成法(化学法)反应温度过高对植物甾醇的影响，同时克服生物催化合成法(酶法)制备时的单一性问题。本发明制备得到的植物甾醇酯纯度达95％以上。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种植物甾醇酯的低温制备方法，包括如下步骤：
(1)酯化反应：以植物甾醇和脂肪酸为原料，加入溶剂溶解植物甾醇和脂肪酸，再加入催化剂进行酯化反应，反应过程中溶剂蒸发冷凝后除水回流；
(2)酸碱中和：在所述步骤(1)酯化反应结束后加入中和剂中和催化剂及多余的脂肪酸，过滤去除不溶性固体物，真空蒸干溶剂即得植物甾醇酯；
所述步骤(1)中，所述植物甾醇包含β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇中的一种或多种，并且其中植物总甾醇含量90％以上；
所述步骤(1)中，所述溶剂为符合以下条件的有机溶剂：A.易溶植物甾醇和脂肪酸，并且不与植物甾醇或脂肪酸发生反应；B.与水能形成共沸并且所述溶剂与水的共沸混合物的沸点为30～65℃；C.冷凝成液体后与水分层形成互不相溶的两相；D.不与产物植物甾醇酯形成共沸且不会影响催化剂活性。
所述步骤(1)中，所述酯化反应在所述共沸混合物的沸点下进行，并且所述溶剂在所述溶剂与水共沸时蒸发。
优选地，所述步骤(1)中，所述植物甾醇采用商业可购买的植物甾醇商品，并且商品中植物总甾醇含量在90％以上。
更优选地，所述步骤(1)中，所述原料植物甾醇采用中粮天科生物工程(天津)有限公司生产的商品，其中植物总甾醇含量有90％和95％两种规格。
优选地，所述步骤(1)中，所述脂肪酸为C14～C20的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸中的一种或多种。
更优选地，所述步骤(1)中，所述脂肪酸为大豆脂肪酸、亚油酸、菜油脂肪酸中的一种或多种。
最优选地，所述步骤(1)中，所述脂肪酸为益海嘉里投资有限公司生产的大豆脂肪酸、亚油酸、菜油脂肪酸的一种或多种。
优选地，所述步骤(1)中，植物甾醇和脂肪酸的投料量摩尔比为1:1～1.2。
优选地，所述步骤(1)中，所述溶剂为二氯甲烷、石油醚、己烷、戊烷中的任意一种。所述石油醚沸程选择为30～60℃。
更优选地，所述步骤(1)中，所述溶剂为二氯甲烷或石油醚。所述石油醚沸程选择为30～60℃。
优选地，所述步骤(1)中，溶剂投料量为植物甾醇的3～8倍(v/m)。
上述技术方案中，“溶剂投料量为植物甾醇的1倍(v/m)”是指1g植物甾醇投入1ml溶剂。
优选地，所述步骤(1)中，所述催化剂为对甲苯磺酸或浓硫酸。
优选地，所述步骤(1)中，催化剂投料量为植物甾醇的0.1～5％(m/m)。
优选地，所述步骤(1)中，所述酯化反应温度为30～65℃，反应时间为6～15h。
优选地，所述步骤(2)中，所述中和剂为氧化钙或碳酸钙。
由于酯化反应的活化能较高，同时也有微量的热效应，因此需要适当的催化剂和一定的温度来提高反应速度，缩短达到平衡的时间，以提高酯化反应速度。酯化反应催化剂大体可分为以下几类，一是一般酸型催化剂，二是固体酸催化剂，三是均相杂多酸催化剂，四是超强酸催化剂。目前对各类催化剂的催化机理还不完全清楚，部分催化剂的使用还不能完全工业化，所有这些问题都有待于人们的进一步探索和研究。提高酯化反应效率的另一种技术方案就是升高反应体系的温度，但反应体系温度升高后又会促使副反应产生，如醇的脱水、酯的水解等，所以温度过高对酯化反应不利。
从化学平衡的原理可知，酯化反应体系中产物水和酯的浓度增加对酯化反应的转化率有不利的影响，所以及时把产物水和酯从反应体系中转移，是提高酯化反应效率的另一种手段。为了及时的连续的不断脱除反应生成的水，目前已经有分子筛吸附、膜分离吸水、负压共沸等技术，但这些技术措施均均在一些缺陷。分子筛吸附法方便易行，效果明显，在实验室研究中常常采用，但由于吸附饱和后的分子筛的再生需要专用的设备和工艺，投资成本很高，因而无法应用于大规模工业化生产中。膜分离吸水法理论上可行，但由于存在膜的堵塞、老化及使用寿命等方面的问题，因而实现起来尚有困难。采用叔戊醇、叔丁醇之类不影响催化剂活性，又可与生成的水形成共沸混合物的有机溶剂做反应媒介兼带水剂，以负压共沸蒸馏的方式将水带走，是一种不错的选择，但遗憾的是，所形成的共沸混合物冷凝后不分层，因而无法实现水的连续分离和溶剂的连续循环回用，蒸出的含水溶剂必须经过专门的干燥处理才能回用。含水溶剂的干燥处理成本大大限制了此项技术的应用。
本发明合成植物甾醇酯以低沸点有机溶剂为反应媒介，同时兼具带水剂的作用，能与水形成共沸使得能在较低的温度(30～65℃)下将水带出反应体系，使得平衡不断的朝合成植物甾醇酯的方向进行，在保证植物甾醇高转化率的同时反应条件又较为温和，无需在反应体系中通入氮气等保护性气体。本发明创新点之一反应溶剂的选择基于以下考虑：易溶植物甾醇和脂肪酸，并不与其发生反应，沸点低(植物甾醇在高于80℃时易氧化，因此选用的溶剂沸点要尽可能低，如本发明选用的二氯甲烷或沸程30～60℃的石油醚，与水能形成共沸，冷凝成液体后与水分层，形成互不相溶的两相，同时不与产物植物甾醇酯形成共沸且不会影响催化剂活性。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
(1)条件温和，整个反应均在低温(30～65℃)下进行，副反应少，产品色泽好，同时溶剂与水在此温度下形成共沸，随着溶剂的蒸发，体系中的水随之被带走，保证了植物甾醇的高转化率；
(2)工艺适用性广，原料均为普通化工原料，易采购，工艺流程短，成本低，易实现工业化；
(3)所用溶剂沸点低，易回收利用，能耗小，环境污染少；
(4)所用中和剂氧化钙或碳酸钙，其本身不溶于溶剂，能对催化剂和多余脂肪酸进行中和，只要过滤掉中和反应生成的不溶性固体物就能去除反应体系中的催化剂和多余的脂肪酸，不会对产品造成影响。工艺过程短、操作简便，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中采用的植物甾醇为中粮天科生物工程(天津)有限公司生产的商品，其中植物总甾醇含量有90％和95％两种规格；脂肪酸为益海嘉里投资有限公司生产的商品。
实施例1
取原料植物甾醇100g(植物总甾醇含量95％)，大豆脂肪酸70g，加入溶剂二氯甲烷300ml，溶解原料植物甾醇，再加入催化剂对甲苯磺酸1g，酯化反应温度为42℃，反应6h，反应过程中于42℃蒸发溶剂，冷凝后除水回流。反应结束后加入2g氧化钙中和催化剂及多余的脂肪酸，过滤去除不溶性固体，真空蒸干溶剂，得到植物甾醇酯163g，经GC-MS测定植物甾醇酯纯度达到97.3％。
实施例2
取原料植物甾醇100g(植物总甾醇含量90％)，大豆脂肪酸70g，加入溶剂石油醚800ml，溶解原料植物甾醇，再加入催化剂对甲苯磺酸1g，酯化反应温度为30℃，反应10h，反应过程中于30℃蒸发溶剂，冷凝后除水回流。反应结束后加入2g氧化钙中和催化剂及多余的脂肪酸，过滤去除不溶性固体，真空蒸干溶剂，得到植物甾醇酯164g，经GC-MS测定植物甾醇酯纯度达到96.6％。
实施例3
取原料植物甾醇100g(植物总甾醇含量90％)，亚油酸70g，加入溶剂二氯甲烷500ml，溶解原料植物甾醇，再加入催化剂对甲苯磺酸0.1g，酯化反应温度为42℃，反应15h，反应过程中于42℃蒸发溶剂，冷凝后除水回流。反应结束后加入2g氧化钙中和催化剂及多余的脂肪酸，过滤去除不溶性固体，真空蒸干溶剂，得到植物甾醇酯163g，经GC-MS测定植物甾醇酯纯度达到96.7％。
实施例4
取原料植物甾醇100g(植物总甾醇含量95％)，菜油脂肪酸70g，加入溶剂石油醚300ml，溶解原料植物甾醇，再加入催化剂浓硫酸1g，酯化反应温度为40℃，反应8h，反应过程中于40℃蒸发溶剂，冷凝后除水回流。反应结束后加入2g碳酸钙中和催化剂及多余的脂肪酸，过滤去除不溶性固体，真空蒸干溶剂，得到植物甾醇酯161g，经GC-MS测定植物甾醇酯纯度达到98.1％。
实施例5
取原料植物甾醇100g(植物总甾醇含量95％)，大豆脂肪酸70g，加入溶剂二氯甲烷300ml，溶解原料植物甾醇，再加入催化剂对甲苯磺酸0.5g，酯化反应温度为42℃，反应12h，反应过程中于42℃蒸发溶剂，冷凝后除水回流。反应结束后加入2g碳酸钙中和催化剂及多余的脂肪酸，过滤去除不溶性固体，真空蒸干溶剂，得到植物甾醇酯165g，经GC-MS测定植物甾醇酯纯度达到97.7％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。