Fgfr3单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和生物制药领域，具体地说，涉及一种FGFR3单链抗体-鱼精 蛋白融合蛋白的制备及其在靶向肿瘤细胞药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor，FGF)是一类由FGF基因家 族成员编码的结构相关的蛋白质，目前已经发现23个成员，其中心区域都含有同源性为 30% - 70%的一段氨基酸序列。庞大的FGF家族成员作为细胞间的多功能信号分子调节着 生物体的多种生理功能。
[0003]FGFs主要通过细胞膜上的FGFR受体发挥调控功能，FGFR属于酪氨酸激酶受体，是 一种单跨膜蛋白，包括与FGFs结合的细胞外部分、跨膜部分和细胞内酪氨酸激酶结构域3 个部分。其中细胞外部分包含着3个免疫球蛋白样结构域（Ig-likedomain,I-III)，第 1个免疫球蛋白区域被认为与受体的自身抑制有关，第2和第3个免疫球蛋白结构域是FGF 配体的结合位点；细胞内的酪氨酸激酶结构域则类似于VEGF受体和TOGF受体激酶。FGF共 有4种受体，分别是FGFR1 - 4,由于存在选择性剪切，最终可形成7种受体类型。
[0004] 在很多肿瘤中发现FGFs及FGF受体呈异常高表达，其中以FGFR3突变或过表达 最为频繁，已经在多发性骨髓瘤（PlowrightEE等，1995)、尿路上皮肿瘤（A1-AhmadieHA 等，2011)、膀胱癌（PandithAA等，2010)、口腔癌（HensonBJ等，2010)、睾丸癌（Goriely A等，2009)和大肠癌（SonvillaG等，2010)等多种肿瘤中发现FGFR3激活突变或过表达。 FGFR3的异常表达参与了肿瘤细胞的增殖、生存、迁移和耐药等多种生理功能。针对FGFR3 的抑制治疗也得到了科学家们的广泛重视。目前，阻断FGFR3的方法主要有酪氨酸激酶抑 制剂、反义基因方法和抗FGFR3单克隆抗体。如Henson等（2010)发现降低FGFR3表达能明 显抑制细胞增殖和增强口腔癌细胞对电离辐射的敏感性。FGFR3在放疗耐受的人鳞状细胞 癌（squamouscancer)中高表达，用FGFR3抑制剂TO173074靶向FGFR3能够增强人鳞状细 胞癌细胞的放疗敏感度，并且TO173074与放疗联用的抗肿瘤效果明显高于单独放疗或单 独使用抑制剂（UzawaK等，2011)。FGFR3也被发现在原发性巨球蛋白血症（Waldenstrom macroglobulinemia，WM)细胞中过表达，FGFR3抑制剂Dovitinib处理能诱导WM细胞凋 亡和抑制细胞增殖，同时也发现Dovitinib与其它药物联用能产生更好的治疗效果（Azab AK，2011)。然而FGFR3抑制剂不能彻底阻断FGFR3的表达，而且FGFR3抑制剂往往具有广谱 性，对其它酪氨酸激酶也具有一定的抑制作用，因此往往也干扰其它的酪氨酸激酶信号传 导通路，产生了较大的毒性，限制了它的临床应用。抗FGF受体单克隆抗体是一种更为特异 性的阻断FGF信号通路的途径，很多研究都表明，它是一种更为有效的方法。FGFR3的下调 也被发现能明显抑制膀胱癌细胞的细胞周期和削弱其在异种移植小鼠内的肿瘤发生进程， 小鼠体内实验结果显示针对FGFR3的特异性抗体处理对膀胱癌和t(4 ;14)阳性的多发性骨 髓瘤都具有明显的抗肿瘤效果（QingJ等，2009)。通过Anti-FGFR3中和抗体PRO- 001 抑制FGFR3自身磷酸化和下游的信号传导，能特异性的抑制FGFR3转化的多发性骨髓瘤细 胞生长（Trudel S等，2006)。
[0005] 尽管靶向抑制FGFR3介导的信号传导能抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织生长，但 仍然不能从根本上根除肿瘤，因为FGF受体仅仅是肿瘤恶性生长的一个因素，其他的信号 传导途径仍然可以激活促进肿瘤细胞增殖和生存。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种新型的FGFR3单链抗体（ScFv)与鱼精蛋白的融合蛋白 (R3 - P)。
[0007] 本发明的另一目的是提供所述R3 - P融合蛋白的制备方法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供所述R3 -P融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞药物中的应 用。
[0009] 本发明所提供的R3 - P融合蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。
[0010] MEVQLQQSCPGLVKPSQTLSLTCAIS⑶SVSSNSAAWNWIRQSPGRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVK SRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSYYPDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQPPSV SVAPGQTARISCSGDALGDKYASWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSCIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYC QSYDGPDLWVFGGGTKLTVLGQSSGSGSARSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRS -
[0011] 本发明所提供编码所述R3 _ P融合蛋白的基因如Seq ID No. 2所示。
[0012] ATGGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCTGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGC GCGATTAGCGGCGATAGCGTGAGCAGCAACAGCGCGGCGTGGAACTGGATTCGCCAGAGCCCGGGCCGCGGCCTGGA ATGGCTGGGCCGCACCTATTATCGCAGCAAATGGTATAACGATTATGCGGTGAGCGTGAAAAGCCGCATTACCATTA ACCCGGATACCAGCAAAAACCAGTTTAGCCTGCAGCTGAACAGCGTGACCCCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGC GCGCGCAGCTATTATCCGGATTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAG CGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGGCGCCGGGCC AGACCGCGCGCATTAGCTGCAGCGGCGATGCGCTGGGCGATAAATATGCGAGCTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAG GCGCCGGTGCTGGTGATTTATGATGATAGCGATCGCCCGAGCTGCATTCCGGAACGCTTTAGCGGCAGCAACAGCGG CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGATGAAGCGGATTATTATTGCCAGAGCTATGATGGCC CGGATCTGTGGGTGTTTGGCGGCGGCACCAAACTGACCGTGCTGGGCCAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGCGCGCAGC CAGAGCCGCAGCCGCTATTATCGCCAGCGCCAGCGCAGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCAGCTAA
[0013] 本发明含有编码所述R3 -P的基因的载体，为含有17启动子的原核表达载体 pET - 20b〇
[0014] 本发明含有编码所述R3 - P的工程菌，为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0015] 本发明所述R3-P融合蛋白的制备方法，是通过在编码所述FGFR3单链抗体的基因 的3'端添加编码截断性鱼精蛋白的基因序列，从而形成融合基因，将该融合基因克隆至原 核表达载体并在大肠杆菌细胞中进行诱导表达，然后进行包涵体分离纯化获得融合蛋白。 [0016] 应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏 好，合成相应的核苷酸序列，并将其克隆到适当的表达载体中，并转化相应的宿主。
[0017] 本发明实验方案，以pET - 20b为表达载体，BL21(DE3)作为宿主，制备FGFR单链 抗体融合蛋白的具体步骤如下：
[0018] 1)首先，合成编码R3 - P融合蛋白的核苷酸序列：由南京钟鼎生物公司合成该融 合基因。
[0019] 2)培养转化后的宿主细胞，诱导表达R3-P:将转化后的大肠杆菌BL21 (DE3)感受 态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子，将筛选的阳性重组菌BL21 (DE3)/pET- 20b-R3 -P单菌落，接种到LB培养基中，37°C振荡培养16h。然后按5%比例转接到新鲜LB培养 基中，进行温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化，经研究证实，0D值为0. 6时，ImM IPTG在37°C诱导3h，超声波（100w，超声2s，间隔2s)破菌，适于R3-P蛋白的高表达。并 以包涵体形式存在于沉淀中。
[0020] 3)分离纯化R3 -P:收集菌体，破碎后离心，取沉淀进行变性、碱性洗脱，收集洗脱 液，进行亲和层析，再经洗涤、洗脱，即得R3 _P融合蛋白。