一种双特异性抗体EpCAM×CD3的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法， 以及双抗体功能及性质检测方法。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体（bispecificantibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb 在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作 用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研宄的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相 关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。然 而，在双特异性抗体药物研发过程中，普遍存在着表达困难、产量低、纯化难、稳定性差等诸 多障碍，因此，构建新的双特异性抗体，使其能克服上述障碍，并建立相应的免疫杀伤动物 模型，是非常有必要的。本发明提供了一种新型双特性抗体的构建，并描述了对其药效学的 研宄方法及结果。以下是针对所研宄的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展 的一些【背景技术】介绍。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4种亚基组成：S、e、丫、G，其分子质量分别为18. 9kDa、23.lkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链， 常与T细胞受体（Tcellrec印tor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结 构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含 免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)， TCR识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，导致 CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷酸化，然后 可募集其他含有SH2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磷 酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此， CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。
[0005] 2. EpCAM
[0006]EpCAM(⑶326)是I型跨膜糖蛋白，作为上皮细胞的特异性细胞粘附分子。它还涉 及到其他一些过程，包括细胞迀移，增殖，分化等。EpCAM是最早应用单克隆抗体技术鉴定出 的肿瘤相关抗原之一，它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导钙非依赖性细胞 间同型黏附功能，据此可归入粘附分子家族。EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与 包括细胞与基质的相互作用、迀移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种 过程。同时，EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达，提示其与肿瘤密切相关。病理情况 下，EpCAM不同程度的表达于腺癌中，包括结直肠癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列 腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤。多项研宄已证实EpCAM的表达与乳腺癌和 结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关（见表1)。单特异性抗EpCAM单克隆抗体（MAB)， 例如单抗17_lA(glaxowellcome，Centocor)，是第一个批准德国EpCAM导向治疗结直肠癌 的辅助治疗，然而，大量的临床用药数据显示，这种单特异性抗体与化疗相比没有明显的更 加有益的效果。目前，一些其他的EpCAM定向治疗，包括双特异性抗体，正在发展为癌症治 疗的方向，双特异性抗体MT110和Catumaxomab都是针对肿瘤抗原EpCAM的治疗性双抗体 药物，其中Catumaxomab已于2009年由欧盟批准用于治疗恶性癌性腹水，MT110已在临床 研宄中。显然，EpCAM已成为目前肿瘤治疗研宄的热点靶标之一。
[0007] 表1EpCAM广泛的肿瘤分布
[0008]
【主权项】
1. 双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该 轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细胞表面抗原是 EpCAM、⑶20、和⑶30,更优选地该肿瘤细胞表面抗原是EpCAM ;和（b)单链单元，为融合肽， 该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中 该融合肽针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细胞；优选地，该融合肽对免疫细胞 表面抗原CD3具有特异性结合能力。
2. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单链单元的CH2结构域位于 scFv片段和CH3结构域之间；不包含CHl结构域。
3. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述单链可变片段由轻链可变 区和重链可变区结构域组成，它们都靶向于抗原表位CD3。
4. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：在单价单元中，所述轻链的轻链 恒定区结构域和轻链可变区结构域都靶向于肿瘤抗原表位EpCAM ;所述重链的重链恒定区 结构域CHl和重链可变区结构域也革E向于肿瘤抗原表位EpCAM ;所述轻链通过二硫键与所 述重链结合；所述重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。
5. 权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单链单元包括针对CD3的抗体 抗-CD3,单价单元包括针对EpCAM的抗体抗-EpCAM ; 优选地，所述的抗-EpCAM重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-EpCAM 的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述的抗-CD3 ScFv-Fc的氨基 酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-EpCAM重链在223位点上的半胱氨酸与 抗-EpCAM的轻链220位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EpCAM重链在229 和232位点上的半胱氨酸与抗-CD3 ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫 键的形式连接，所述的抗-EpCAM重链在395和412位点上与抗-⑶3 ScFv-Fc的428和397 位点上形成盐桥连接，所述的抗-EpCAM重链在369位点上与抗-⑶3 ScFv-Fc的436位点 上形成隆突-入-穴连接。
6. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元中的重链包含人 或者人源化的Fc片段，优选地，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段；所述融合肽的Fc片 段包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
7. 根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元的人IgG Fc段和 所述单链单元的IgG Fc通过盐桥和隆突-入穴结构连接。
8. 制备权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，所述的方法 包括步骤： (1) 分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表 达载体上； (2) 将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清； (3) 将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述的细胞是CHO-S细胞； 或者优选地，所述的分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域 的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓 缩置换缓冲液PBS。
9. 根据权利要求8所述的方法，所述的第一表达载体是pCHOl. 0 ;所述的第二表达载体 是是pCHOl.O-潮霉素。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法的步骤（1)中： 所述单价单元为抗-EpCAM抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak (EcoR V)F、MK-前导序 列（EcoRV)F、M701-VL Fl和hIgK(PacI)R，通过重叠 PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及 酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-前导序 列（Avrll)F、M701-VH Fl和hlgGl (sbfl)R，通过重叠 PCR扩增，将Kozak序列、前导序列 及酶切位点AvrII与BstZ17I引入重链；扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切 过的pCHOl. 0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EpCAM轻链的表达载体；然后用AvrII 与BstZ17I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EpCAM的pCHOl. 0表达载体，质粒命名为 pCHOl. O-抗-EpCAM-HL-KKW ; 所述单链单元为抗-⑶3 ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(AvrII)F、MK-前导 序列（AvrII) F、L2K-VH(MK) Fl 和 hlgGl (sbfl) R，通过重叠 PCR 扩增抗 CD3ScFv-Fc 结构域， 并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZ17I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片 段与酶切过的pCHOl. 0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗⑶3 ScFv-Fc的表达载 体，质粒命名为pCHOl. 0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。
11. 权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制 备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗 EpCAM特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达EpCAM细胞。
12. 权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制备的 双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞 系中筛选用于治疗表达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的双抗体药物或者评价用于 治疗表达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的双抗体药物的药效。
【专利摘要】本发明提供了一种双特异性抗体，本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单价单元针对肿瘤细胞表面抗原EpCAM具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(scFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途。
【IPC分类】A61K39-395, C07K16-46, C07K16-30, C12N15-85, A61P35-00
【公开号】CN104592392
【申请号】CN201510031516
【发明人】王涛, 方丽娟, 胡柳, 刘杨, 张雨, 范克索, 周鹏飞
【申请人】武汉友芝友生物制药有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月21日