四价双特异性抗体的制作方法
【专利说明】四价双特异性抗体
[oow] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请第61/793, 153号的权益 和优先权，其公开通过引用全文纳入本文。 发明领域
[0003] 本发明设及四价双特异性抗体灯etBiAb)、其制备方法和使用其治疗癌症或免疫 疾病或者诊断的方法。 阳004] 背景 阳0化]抗体工程改造的最新技术进步聚焦于使用双特异性方法来（1)契合效应细胞用 于肿瘤细胞的重定向裂解，（2)增加对目标的结合亲合力和特异性，或（3)出于监管和商 业原因将两种药物候选物合二为一。在第一种方法中，双特异性抗体通过与用于重定向裂 解的CD3 (Baeuerle等，Cancer Res. 69 :4941，2009)、CD16 (Weiner等，Cancer Immunol. Immunother. 45：190,1997)或CD64 (Graziano等，Cancer Immunol. Immunother. 45 :124， 1997)的契合发挥致病细胞和效应细胞之间桥梁的作用。在第二种方法中，可通过将具有一 般结合亲合力的两种抗体分别合并成双互补位化iparatopic)(结合相同目标抗原上的两 种不同表位）或双特异性（结合相同目标细胞上的两种不同抗原）抗体显著提高对目标或 目标细胞的特异性。第S种方法通过同时结合两种可溶性细胞因子例示（M油ry等，Protein Eng. Des. &Sel.23 :115,2010 ;Wu等，化Uire Biotech. 25 :1290,2007)，其探索了在合适的 疾病设定中双重祀向的潜在协同。除了通过可变区提供精细的结合特异性W外，IgG也具 有效用功能和非常长的血清半衰期，并且因此通常是设计双特异性抗体的优选骨架。
[0006] 现有的双特异性抗体技术大都依靠scFv(可变区的单链片段）形式（Coloma和 Morrison,化 1:ureBiotechnol. 15 :159,1997;Lu等，J.Biol.Qiem. 280 :19665, 200f5)，其中 各VH(重链可变区）与其同源化（可变轻链区）共价连接，因为在F油形式中还没有可指 导游离的轻链仅与其同源重链特异性配对的现有技术并且因此不同抗原特异性的游离轻 链与重链随机配对。然而，单链抗体的表达在技术上经常是挑战性的，由于可能丢失结合亲 合力、蛋白聚集、弱稳定性和低生产水平值emarest等，化rr.化in.DrugDiscov.Devel. 11 : 675,2008 ;Michaelson等，mAbs1:2，128-141，2009)。如果起始抗体是来自杂交瘤（与来 自隧菌体展示文库的单链抗体相反）（必须重排成单链抗体），运是特别真实的。在另一个 方面，从隧菌体中分离的scFv通常在哺乳动物细胞中弱表达。
[0007] 几种新技术使得能够几乎排他性地组装Fc异二聚体W提供用于设计双特异性 的骨架，例如，结进孔（knob-in-holeHRidgway等，ProteinE：ng. 9 :617，1996)、静电操 作（Gunasekaran等，J.Biol.Chem. 285:19637,2010)和链交换工程改造结构域（S邸D) 值avis,ProteinEng.Des.&Sel. 23 :195, 2010)。然而，仍然没有能够指导游离的轻链仅与 其同源重链特异性配对的现有技术，运种技术使得对双特异性抗体的工程改造依靠天然重 链-轻链Fab形式。由于前述的scFv形式的问题，一些技术筛选两个不同Fab'S的共同 轻链（Merchant等，化1:ureBiotechnol. 16 :677,1998)或者使用单个可变结构域来避免一 起使用轻链（化en等，J.Immunol.Methods318 :65, 2007)。
[0008] 在双可变结构域值VD) -Ig方法中，第二抗体的化和VH通过柔性接头分别与第一 抗体的轻链和重链的N-端融合，产生2个串联的可变结构域（VD)，称为外VD和内VD(Wu 等，同上）。由于外VD靠近内VD的配体结合位点所产生的空间位阻，需要设及从多个可得 的单克隆抗体选择VD，VD的取向和接头设计（其大多数必须靠经验确定）的广泛的优化W 保持内VD的结合亲合力值iGiammarino等，899 :145,2012)。
[0009] 另一种方法利用大鼠/小鼠四体杂交瘤中优先的物种限制的重链和轻链配对 化in化ofer等，J.Immunol. 155 :219,1995)。然而，生成的双特异性抗体是大鼠/小鼠抗体， 其作为治疗剂明显具有免疫原性的问题。
[0010] 基于结进孔（knob-into-hole)的异二聚化重链的化ossmab方法另外使用免疫球 蛋白结构域交叉作为产生双特异性IgG抗体的通用方法（Schaefer等，Proc.化tl.Acad. Sci.USA，108 :11187,2011)。然而，H链异二聚体和同源Fv's的正确配对不是排他性的，并 且必须在纯化期间去除不需要的副产物。
[0011] 使用化ossmab方法的延伸通过将其他组的F油和化ossmabF油片段附加在 化ossmab的C-端来生成四价双特异性抗体（Regula等，美国专利申请第2010/0322, 934 号），并且获得H链异二聚体和同源Fv'S的排他性正确配对的挑战性仍然存在。
[0012] 由"二合一"抗体证明了另一种针对双特异性的方法，该方法使用单个结合位点来 祀向两个不同的抗原。一个运类"二合一"抗体是抗体贺赛汀的变体，其同时与化r2和VEGF 相互作用度ostrom等，Science323:1610,2009)。运种方法对临床应用而言是有吸引力 的，因为其提供了具有与正常IgG相同形式的双特异性抗体。然而，筛选运种变体是非常消 耗劳动的，并且无法确保可得到可结合两种感兴趣的抗原的单个结合位点。
[0013] 在美国公开专利申请US2011/0076722中描述了仅具有基于单组F油片段的单特 异性的稳定多价抗体。另一种技术使用停靠并锁定值ock-and-Lock)结构域来将具有不同 特异性的预制F油片段与抗体连接W形成六价双特异性抗体（Rossi等，CancerRes. 68 : 8384,2008)〇
[0014] 由于大多数的抗体（即，从杂交瘤生成的那些，F油文库和B-细胞克隆，无论起源 是否来自正常小鼠、大鼠和兔，或转基因（人源化）小鼠或大鼠，或患者）具有与其同源重 链配对的游离轻链，迫切需要一种避免随机轻链配对的双特异性抗体的基于Fab的技术。 运类技术将促进从两个现有抗体中简单并高效地产生双特异性抗体，其可首先用作多功能 工具分子W探测双重祀向的潜在协同，并其次作为治疗方法来探索在设定待治疗的疾病中 完全抗体环境下的双重祀向。
【发明内容】
[0015] 本发明的特征在于四价双特异性抗体（TetBiAb)。在本发明的一个通用的实施方 式中，抗体含有通过F油轻链在其C-端与F油连接的抗体Fc区。在Te巧iAb的一个实施 方式中，抗体通过F油轻链在其C-端与具有第二结合特异性的第二对F油共价连接，其中 连接的F油轻链与游离的同源F油重链配对。与此相反，在抗体N-端的F油重链通常与其 同源游离轻链配对。所得的抗体就其各结合特异性而言为二价。TetBiAb中多肤链的排列 示于图1B。
[0016] 在Te巧iAb的一个替代性实施方式中，抗体Fc区通过F油轻链在其N-端与具有 第一特异性的F油连接，其中连接的F油轻链与游离的同源F油重链配对，并且另外，抗体Fc区通过F油重链在其C-端与具有第二特异性的F油连接。在抗体C-端处连接的F油重 链通常与其同源游离轻链配对。同样，所得的抗体就其各结合特异性而言为二价。运一替 代性Te巧iAb中多肤链的排列示于图1D。 阳017] 因此，在本发明的一个实施方式中，TetBiAb包含（i)第一多肤，其包含第一抗 体的抗体重链，其中该重链含有第一抗体的可变结构域和恒定结构域（VH(l)-CHl-较 链-C肥-C册），其中重链通过肤键在其C-端处直接或间接连接至第二抗体的抗体轻链 的N-端，其中轻链含有第二抗体的可变结构域和恒定结构域（VL(2)-CL) ;(ii)第二 多肤，其包含第一抗体的抗体轻链，其中第一抗体的轻链包含可变结构域和恒定结构域 (VL(1)-化）；化及（iii)第S多肤，其包含第二抗体的F油重链并缺少C肥和C册恒定结构 域（VH(2)-CH1)。应理解第一抗体和第二抗体具有不同的结合特异性，即，抗体与不同的表 位特异性结合。运些多肤组装成完全四价双特异性抗体。 阳0化]在本发明的另一个实施方式中，TetBiAb的第一多肤（VH(l)-CHl-较 链-C肥-C册-(L)-VL(2)-化）还包含接头，该接头可操作地将重链恒定结构域的C-端连接 到轻链可变结构域的N-端。在一个实施方式中，该接头具有氨基酸序列（GGGG巧。(SEQID NO:6)，其中n为1至10之间的整数。在另一个实施方式中，该接头是（GGGG巧。，其中n为 4。
[0019] 在本发明的其他实施方式中，TetBiAb的所述第一多肤的重链恒定结构域是IgG 恒定结构域。
[0020] 在本发明的其他实施方式中，TetBiAb的所述第一多肤缺少C肥结构域。
[0021] 在本发明的其他实施方式中，第S多肤（VH(2)-CH1)包括在其C-端的上部较链 区，其具有序列EPKSC(沈QIDN0:10)。
[0022] 在本发明的另一个方面，提供编码形成Te巧iAb的多肤链的DM分子。在一个 实施方式中，提供了包含第一DNA序列的DNA分子，其中DNA序列编码第一抗体的重链 (VH(1) -CH1-较链-C肥-C册），其通过任选的接头遗传融合到第二抗体的轻链（VL(2)-化)， W得到编码VH(1)-CH1-较链-C肥-C册-(任选的接头）-VL似-CL的序列。在其他实施 方式中，另外向第一DNA序列提供第二DNA，其中第二序列编码第一抗体（VL(l)-CL)的轻 链。在其他实施方式中，另外提供第SDNA序列，其中第S序列编码第二抗体的Fab重链 (VH(2)-CH1)，任选地与编码具有氨基酸序列EPKSC(SEQIDN0:10)的较链区的其他序列 连接。在其他实施方式中，在单独的DNA分子上含有第一、第二或第SDNA序列中的至少一 个。
[0023] 在本发明的另一个实施方式中，提供了含有第一、第二和第S基因构建体的DNA 分子，其中第一构建体编码第一抗体的重链（VH(1) -CH1-较链-C肥-C册），其通过任选的接 头与第二抗体的轻链（VL(2)-化）遗传融合，W得到编码VH(1)-CH1-较链-C肥-C册-任选 的接头-VL(2)-CL的序列；第二构建体编码第一抗体的轻链（VL(1)-化）；并且第S构建体 编码第二抗体的Fab重链（VH(2)-CH1)，其任选地与编码较链区的其他序列连接（氨基酸序 列EPKSC，沈QIDNO:10 ;参见图 1A)。
[0024] 本发明还提供了携带本发明的DNA分子的宿主细胞。
[00巧]本发明还提供了生产本发明的TetBiAb的方法。
[00%] 在本发明的另一个方面中，提供了选择对于本发明的Te巧iAb合适的目标结合特 异性的方法。
[0027] 也提供了特异性Te巧iAb。在一个实施方式中，TetBiAb祀向CD20和CD16。在另 一个实施方式中，TetBiAb祀向EGFR和CD16。在另一个实施方式中，TetBiAb祀向CD20和 CD47。在另一个实施方式中，TetBiAb祀向CD20和CD52。在另一个实施方式中，TetBiAb 祀向化Cam和CD47。
[0028] 本发明的一个方面提供了用本发明的TetBiAb治疗患有癌症或免疫相关疾病的 方法，包括向个体给予治疗有效量的Te巧iAb，例如上文所列实施方式的Te巧iAbW治疗疾 病。
【附图说明】
[0029] 图1示意性显示了四价双特异性抗体灯etBiAb)。在图1A中，显示了用于表达 TetBiAb的DNA构建体。DNA构建体1 (上部）编码来自第一抗体的重链可变结构域（VH(1))， 之后是通过任选的接头（L)与第二抗体的轻链可变结构域（VL(2))遗传融合的重链恒定结 构域（CH1，较链（H)-C肥-C册），之后是轻链恒定结构域（化）。DNA构建体2 (中间）编码第 一抗体的轻链可变结构域（VL(1))之后是轻链恒定结构域（CL)。DNA构建体3(底部）编 码第二抗体的重链可变结构域（VH(2))，之后是重链恒定结构域l(CHl)和任选的上部较链 区化*)。在图1B中，TetBiAb的示意图显示了包含由图1A所示的DNA构建体编码的3个 多肤组分的六聚体结构。链间二硫键显示为2条多肤链之间的短杆。在图1C中，显示了用 于表达Te巧iAb的替代性DNA构建体。DNA构建体1 (上部）编码第一抗体的轻链可变结构 域（VL(1))，之后是轻链恒定结构域（CL)，之后是通过任选的接头（L)与第二抗体的重链可 变结构域（VH(2))遗传融合的重链恒定结构域（较链（H)-C肥-C册），之后是重链恒定结构 域1 (CH1)，和任选的上部较链区（H*)。DNA构建体2 (中间）编码第二抗体的轻链可变结构 域（VL(2))之后是轻链恒定结构域（CL)。DNA构建体3 (底部）编码第一抗体的重链可变结 构域（VH(1))，之后是恒定结构域l(CHl)和任选的上部较链区脚）。在图1D中，TetBiAb 的示意图显示了包含由图1C所示的DM构建体编码的3个多肤组分的六聚体结构。链间 二硫键显示为2条多肤链之间的短杆。
[0030] 图2通过用EGF的竞争结合试验显示了抗-EGFR(实屯、圆圈，实线）、 FC-G4S-抗-EGFR (VHCH1)(空屯、方块，点线）和FC-G4S-抗-EGFR (LC)(实屯、方块，虚线）与 表达EGFR的人A431表皮样癌细胞的结合（实施例1)。 W31 ] 图3通过SPR分析显示了各浓度的EGFR与固定的FC-G4S-抗-EGFR(VHCH1)、FC-G4S-抗-EGFR(LC)和Fc- (G4巧4-抗-EGFR(LC)的结合。 阳0巧 图4显示了抗-CD20 (实屯、圆圈，实线）、FC-G4S-抗-CD20 (V肥H1)(空屯、立角，点 线）、FC-G4S4-抗-CD20 (VHCH1)(空屯、方块，短虚线）、FC-G4S-抗-CD20 0X)(实屯、S角， 实线）和Fc-(G4巧4-抗-CD2(KLC)(实屯、方块，长虚线）与道迪细胞上表达的CD20的结合 (实施例2)。
[0033] 图5显示了通过SDS-PAGE对抗-CD16/抗-EGFR(泳道2)和抗-EGFR/抗-CD16 (泳 道3)的=种多肤的表达的分析（图5A)，和通过尺寸排阻色谱（SEC)对抗-CD16/ 抗-EGFR(上图）和抗-EGFR/抗-CD16(下图）的完整六聚体分子组装的分析（图5B;实 施例3)。
[0034]图6通过用EGF的竞争结合试验显示了抗-EGFR(实屯、圆圈，实线）、抗-EGFR/抗-CD16 (空屯、圆圈，点线）和抗-CD16/抗-EGFR(空屯、方块，虚线）与表达EGFR的人A431 表皮样癌细胞的结合（实施例3)。 阳0对 图7显示了抗-EGFR(实屯、圆圈，实线）、抗-EGFR/抗-CD16 (空屯、圆圈，点线）和 抗-CD16/抗-EGFR(空屯、方块，虚线）对人A431表皮样癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性（ADCC)活性，使用静息人外周血单核细胞（PBMC)作为效应物（效应物与目标细胞 之比为100 : 1)(实施例4)。
[0036] 图8显示了通过SDS-PAGE对抗-CD20/抗-CD16的S种多肤表达的分析（图8A) 和通过尺寸排阻色谱（SEC)对完整六聚体分子组装的分析（图8B)。
[0037] 图9显示了抗-CD20/抗-CD16(空屯、圆圈，点线）和抗-CD20(实屯、圆圈，实线） 与表达CD20的道迪细胞的结合。 阳0測 图10显示了抗-CD20/抗-CD16 (空屯、圆圈，点线）和抗-CD20 (实屯、圆圈，实 线）对人拉莫斯伯基特（RamosBurkitt'S)淋己瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒 性（ADCC)活性，使用纯化的人自然杀伤（NK)细胞作为效应物（效应物与目标细胞之比为 10 : 1)。两个图像表示来自不同供体的效应细胞的结果。
[0039]图11显示了通过SDS-PAGE对抗-CD20/抗-CD47的S种多肤表达的分析（图11A) 和通过尺寸排阻色谱（SEC)对完整六聚体分子组装的分析（图11B;实施例5)。 W40] 图12显示了抗-CD20/抗-CD47(空屯、圆圈，点线）、抗-CD20(实屯、圆圈，实线）和 抗-CD47 (实屯、方块，实线）与表达CD20 (CD20-转染的NS0细胞；图12A)或CD47扣937细 胞；图12B)或同时表达两者（SU-DHL4细胞；图12C)的细胞的结合。 W41] 图13显示了通过SDS-PAGE对抗-CD20/抗-CD52(泳道。和抗-CD52/ 抗-CD20(泳道3)的=种多肤的表达的分析（图13A)，和通过尺寸排阻色谱（SEC)对 抗-CD20/抗-CD52 (上图）和抗-CD52/抗-CD20 (下图）的完整六聚体分子组装的分析 (图13B;实施例6)。 阳0创 图14显示了抗-CD20/抗-CD52(空屯、圆圈，点线）、抗-CD52/抗-CD20(空屯、S 角，虚线）、抗-CD20 (实屯、圆圈，实线）和抗-CD52 (实屯、=角，实线）与表达CD20 (道迪细 胞，图14A)或CD52〇(asumi-3细胞，图14B)的细胞的结合。 阳0创 图15通过化ISA显示了Fc-(G4巧广抗-CD47 (V肥H1)(空屯、S角，点线）、 Fc-(G4巧4-抗-CD47 0X)(实屯、S角，虚线）和抗-CD47在各种抗体浓度下与固定的CD47 的结合（实施例7)。
[0044]图 16 显示 了通过SDS-PAGE对抗-EGFR/ 抗-CD47 (泳道 2)和抗-CD47/ 抗-EGFR(泳道3)的S种多肤的表达的分析（图16A)，和通过尺寸排阻色谱（SEC)对 抗-EGFR/抗-CD47(上图）和抗-CD47/抗-EGFR(下图）的完整六聚体分子组装的分析 (图16B;实施例8)。 W45] 图17通过化ISA显示了抗-EGFR/抗-CD47 (空屯、圆圈，点线）、抗-CD47/ 抗-EGFR(空屯、方块，虚线）、抗-EGFR(实屯、圆圈，实线）和抗-CD47 (实屯、方块，实线）与固 定的CD47(图17A)或与固定的EGFR(图17B)的结合。图17C显示了抗-EGFR/抗-CD47(空 屯、圆圈，点线）、抗-EGFR(实屯、圆圈，实线）和抗-CD47(实屯、方块，实线）与A431细胞（其 表达高水平的EGFR和低水平的CD47)的结合。
[0046]图 18 显示 了通过SDS-PAGE对抗-HER2/ 抗-CD47 (泳道 3)和抗-CD47/ 抗-肥R2(泳道3)的=种多肤的表达的分析（图18A)，和通过尺寸排阻色谱（SEC)对 抗-肥R2/抗-CD47 (上图）和抗-CD47/抗-肥R2 (下图）的完整六聚体分子组装的分析 (图18B;实施例9)。 W47] 图19通过化ISA显示了抗-肥R2/抗-CD47 (空屯、S角，点线）、抗-CD47/ 抗-HER2 (空屯、方块，虚线）、抗-HER2 (实屯、S角，实线）和抗-CD47 (实屯、方块，实线）与固 定的CD47 (图19A)或与表达肥R2但不表达CD47的SK-BR3细胞（图17B)的结合。
[0048] 发明实施方式的详述 W例本发明克服了包含具有不同结合特异性的2个F油片段的双特异性抗体的细胞表 达、组装和纯化中的基础性问题：两种游离轻链与Fab重链随机配对，导致产生多种异常的 抗体物质。运些异常的抗体可能难W从所需产