抗cdh3抗体及其用图
【专利说明】
[0001] 本申请是基于申请日为2009年12月28日，申请号为200980163482.X，发明名称 为："抗CDH3抗体及其用途"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及抗CDH3抗体，使用所述抗体来治疗或预防或诊断CDH3相关疾病的方 法，以及包含所述抗体的药物组合物或诊断试剂盒。
【背景技术】
[0003] 钙粘蛋白是细胞-细胞粘附糖蛋白，它们形成钙依赖性细胞间连接点，而且在系 统发生中及在成年组织和器官的发育和维持中发挥至关重要的作用（NPL1)。在胚胎发生 期间，特定钙粘蛋白的细胞表达导致嗜同性相互作用，这些相互作用在细胞分选和组织分 层的过程中是至关重要的（NPL2-4)。这些细胞附着的改变在细胞失稳中发挥重要作用，而 且可改变受到细致调节的上皮结构分化过程（NPL5-6)。因为这个原因，已经有人暗示钙粘 蛋白的功能丧失或过表达以及编码这些蛋白的基因的背后的控制分子机制与癌发生有关 (NPL7)〇
[0004] 钙粘蛋白家族细分成多个亚家族，包括经典的E-、P_、和N-钙粘蛋白，每个亚家族 表现出独特的组织分布（NPL8)。虽然E-钙粘蛋白在所有上皮组织中表达，但是P-钙粘蛋 白（CDH3)的表达仅仅局限于分层的上皮的基底层或下层，包括前列腺和皮肤，而且还局限 于乳腺肌上皮细胞（NPL9-10)。
[0005] 现在有大量的证据也揭示异常P-钙粘蛋白表达与细胞增殖及与结肠、乳腺、肺、 甲状腺、和宫颈的肿瘤有关（NPL11-12)。人P-钙粘蛋白据报告是被针对外阴表皮样癌生成 的NCC-CAD-299单克隆抗体识别的抗原（NPL10)。预期对P-钙粘蛋白介导的粘附和细胞内 信号传导的调控会导致体内肿瘤细胞增殖和存活降低。因而，鉴于P-钙粘蛋白似乎在细胞 增殖和实体瘤进展中拥有关键作用，期望生成针对P-钙粘蛋白的抗体，它能给具有多种癌 症的患者提供治疗效益。
[0006] 针对癌症特异性分子的单克隆抗体已经证明在癌症治疗中是有用的（NPL13)。除 了用于乳腺癌、恶性淋巴瘤和结肠癌的人源化或嵌合抗体诸如曲妥单抗（NPL13)、利妥昔单 抗（NPL14)和贝伐单抗（NPL15)等临床应用的成功例子之外，有若干针对其它分子靶标的 单克隆抗体正处于开发中，而且人们正在评估它们的抗肿瘤活性。预期这些单克隆抗体会 给具有没有有效疗法的肿瘤的患者带来希望。关于这些单克隆抗体的其它重要问题之一， 是实现针对癌细胞的选择性治疗效果，而避免由于它们对表达靶分子的细胞的特异性反应 而造成的严重毒性（NPL17-19,PTL1-4)。
[0007] 引用列表
[0008] 专利文献
[0009] PTL1：W02002/097395
[0010] PTL2 ：W02004/110345
[0011] PTL 3 ：W02006/114704
[0012] PTL 4 ：W02007/102525
[0013] 非专利文献
[0014] NPL 1：Conacci-Sorrell M,et al. , J Clin Invest, 109:987-91, (2002
[0015] NPL 2 ：Nose A, et al. , Cell, 54:993-1001, (1988)
[0016] NPL 3 ：Steinberg MS, et al. ,.Proc Natl Acad Sci USA, 91:206-9, (1994)
[0017] NPL 4 ：Takeichi M. Science, 251:1451-5, (1991)
[0018] NPL 5 ：Daniel Cff, et al. , Dev Biol, 169:511-9, (1995)
[0019] NPL 6 ：Nose A and Takeichi M.J Cell Biol, 103:2649-58, (1986)
[0020] NPL 7 ：Behrens J. Cancer Metastasis Rev, 18:15-30(1999)
[0021] NPL 8 ：Takeichi M. Development, 102:639-55(1988)
[0022] NPL 9 :Takeichi M. J Cell Biol 103:2649-58,（1986)
[0023] NPL 10 ：Shimoyama Y, et al. , Cancer Res, 49:2128-33 (1989)
[0024] NPL 11：Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001)
[0025] NPL 12：Stefansson, et al. , J. Clin. Oncol. 22(7):1242-1252(2004)
[0026] NPL 13：Harris, M. Lancet Oncol, 5:292-302(2004)
[0027] NPL 14：Baselga, J. Oncology, 61: SuuplSuupl 2 14-21(2004)
[0028] NPL 15：Maloney, D. G. , et al. Blood, 90:2188-2195 (1997)
[0029] NPL 16：Ferrara, N. , et al. Nat Rev Drug Discov, 3:391-400 (2004)
[0030] NPL 17：Crist,ff. M. , et al. J Clin Oncol, 19：3091-3102 (2001)
[0031] NPL 18：ffunder, J. S. , et al. J Bone Joint Surg Am, 80:1020-1033(1998)
[0032] NPL 19：Ferguson, ff. S. and Goorin, A. M. Cancer Invest, 19:292-315 (2001)
[0033] 发明概述
[0034] 本发明提供针对⑶H3的单克隆抗体，它们特异性识别⑶H3多肽，诸如具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其片段。本发明提供了用9°Y标记的抗CDH3单克隆抗体在 携带癌细胞系的异种移植小鼠中具有显著的抗肿瘤活性。
[0035] 具体而言，本发明涉及下面各项：
[0036] [1]一种抗体或其片段，其中所述抗体包含H(重）链V(可变）区和L(轻）链V 区，其中所述H链V区和L链V区选自下组：
[0037] (a)包含具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的H链V区中所含的互补决定区 (⑶R)或与之功能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQ ID N0:12的氨基酸序列的 L链V区中所含的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区；
[0038] (b)包含具有SEQ ID N0:20所示的氨基酸序列的H链V区中所含的⑶R或与之功 能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQ ID N0:28的氨基酸序列的L链V区中所含 的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区；
[0039] (c)包含具有SEQ ID N0:36所示的氨基酸序列的H链V区中所含的⑶R或与之功 能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQ ID N0:44的氨基酸序列的L链V区中所含 的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区；和
[0040] (d)包含具有SEQ ID N0:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H链V区中所含的 ⑶R或与之功能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:60的氨基酸序列的L链V区中所含的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区，
[0041] 且其中所述抗体能够结合⑶H3多肽或其部分肽。
[0042] 在典型的实施方案中，所述抗体选自下组：小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗 体、抗体片段、以及单链抗体。
[0043] [2]本发明的抗体或其片段能够与细胞毒剂、治疗剂、放射性同位素标记物或荧光 标记物缀合。在典型的实施方案中，抗体被放射性同位素标记物标记。在更典型的实施方 案中，放射性同位素标记物选自 9°钇（9°Y)、125碘（1251)和111铟（mIn)。
[0044] [3]在受试者中治疗或预防与⑶H3有关的疾病，或抑制表达⑶H3的细胞的生长的 方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其片段。
[0045] [4] -种用于受试者中与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向的诊断或预后的 方法，其包括
[0046] (a)使来自所述受试者的样品或标本接触本发明的抗体或其片段；
[0047] (b)检测所述样品或标本中⑶H3多肽；并
[0048] (c)基于与对照相比CDH3蛋白的相对丰度来确定所述受试者是否患有或有风险 发生所述疾病。
[0049] [5]用于在受试者中治疗或预防与⑶H3有关的疾病，或抑制表达⑶H3的细胞的生 长的药物组合物，所述组合物包含有效量的本发明的抗体或其片段，以及可药用的担载体 或赋形剂。
[0050] [6] -种用于与CDH3有关的疾病的诊断或预后的试剂盒，该试剂盒包含本发明的 抗体或片段。
[0051] 本发明包括以下内容：
[0052] 实施方式1. 一种抗体或其片段，其中所述抗体包含H(重）链V(可变）区和L(轻） 链V区，其中所述H链V区和L链V区选自下组：
[0053] (a)包含具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的H链V区中所含的互补决定区 (⑶Rs)或与之功能上等同的⑶Rs的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:12的氨基酸序列 的L链V区中所含的⑶Rs或与之功能上等同的⑶Rs的L链V区；
[0054] (b)包含具有SEQIDN0:20所示的氨基酸序列的H链V区中所含的⑶Rs或与之 功能上等同的⑶Rs的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:28的氨基酸序列的L链V区中 所含的⑶Rs或与之功能上等同的⑶Rs的L链V区；
[0055] (c)包含具有SEQIDN0:36所示的氨基酸序列的H链V区中所含的⑶Rs或与之 功能上等同的⑶Rs的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:44的氨基酸序列的L链V区中 所含的⑶Rs或与之功能上等同的⑶Rs的L链V区；和
[0056] (d)包含具有SEQIDN0:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H链V区中所含的 ⑶Rs或与之功能上等同的⑶Rs的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:60的氨基酸序列的 L链V区中所含的⑶Rs或与之功能上等同的⑶Rs的L链V区，
[0057] 且其中所述抗体能够结合⑶H3多肽或其部分肽。
[0058] 实施方式2.实施方式1的抗体或其片段，其中所述H链V区和L链V区选自下 组：
[0059] (&)包含具有3￡0 10勵:6所示的氨基酸序列的〇)1?1、具有3￡0 10勵:8所示的 氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDNO: 10所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区，和包含具 有SEQIDN0:14所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:16所示的氨基酸序列的⑶R2、 和具有SEQIDN0:18所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区，
[0060] 〇3)包含具有3￡〇10勵:22所示的氨基酸序列的0?1、具有3￡〇10勵 :24所示 的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDN0:26所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区，和包 含具有SEQIDN0:30所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:32所示的氨基酸序列的 ⑶R2、和具有SEQIDN0:34所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区；
[0061]((：)包含具有3￡0 10勵:38所示的氨基酸序列的〇)1?1、具有3￡0 10勵:40所示 的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDN0:42所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区，和包 含具有SEQIDN0:46所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:48所示的氨基酸序列的 ⑶R2、和具有SEQIDN0:50所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区；和
[0062] (d)包含具有SEQIDN0:54所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDN0:70,74,78 或82所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDNO: 58所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V 区，和包含具有SEQIDN0:62所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:64所示的氨基酸 序列的⑶R2、和具有SEQIDN0:66所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区。
[0063] 实施方式3.实施方式1或2的抗体或其片段，其中所述抗体选自下组：小鼠抗体、 嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段、和单链抗体。
[0064] 实施方式4.实施方式3的抗体或其片段，其中所述抗体包含具有选自SEQID NO:4, 20, 36, 68, 72, 76和80的氨基酸序列的H链V区，和/或具有选自SEQIDNO: 12, 28, 44 和60的氨基酸序列的L链V区。
[0065] 实施方式5.实施方式4的抗体或其片段，其中所述抗体包含：
[0066] (&)具有3￡〇10勵:4所示的氨基酸序列的11链￥区和具有3￡〇10勵：12所示的 氨基酸序列的L链V区；
[0067] (b)具有SEQIDN0:20所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDN0:28所示 的氨基酸序列的L链V区；
[0068] (c)具有SEQIDN0:36所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQIDN0:44所示 的氨基酸序列的L链V区；或
[0069] (d)具有SEQID N0:68, 72, 76或80所示的氨基酸序列的H链V区和具有SEQID NO: 60所示的氨基酸序列的L链V区。
[0070] 实施方式6.实施方式4或5的抗体或其片段，其中所述抗体是嵌合抗体。
[0071] 实施方式7.实施方式6的抗体或其片段，其中所述抗体是人源化抗体。
[0072] 实施方式8.实施方式7的抗体或其片段，其中所述人源化抗体还包含人抗体 FR(框架）区和/或人抗体C区。
[0073] 实施方式9.实施方式1-8中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体与细胞毒剂、 治疗剂、放射性同位素标记物或荧光标记物缀合。
[0074] 实施方式10.实施方式9的抗体或其片段，其中所述放射性同位素标记物选自90 钇（ 9°Y)和 111 铟（mIn)。
[0075] 实施方式11.一种用于在受试者中治疗或预防与CDH3有关的疾病或抑制表达 CDH3的细胞的生长的方法，其中所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求1-10 中任一项的抗体或片段。
[0076] 实施方式12.-种用于在受试者中诊断与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向 的方法，其中所述方法包括
[0077] (a)使来自所述受试者的样品或标本接触权利要求1-10中任一项的抗体或片段；
[0078] (b)检测所述样品或标本中的⑶H3多肽；并
[0079] (c)基于与对照相比⑶H3多肽的相对丰度来判断所述受试者是否患有或有风险 发生所述疾病。
[0080] 实施方式13.-种用于治疗或预防与⑶H3有关的疾病或抑制表达⑶H3的细胞生 长的药物组合物，其中所述药物组合物包含有效量的依照权利要求1-10中任一项的抗体 或片段和可药用的担载体或赋形剂。
[0081] 实施方式14.一种用于诊断与CDH3有关的疾病的试剂盒，其中所述试剂盒包含依 照权利要求1-10中任一项的抗体或片段。
[0082] 附图简述
[0083] 图1显示9°Y标记的抗⑶H3抗体（克隆#3、#4、#5和#6)对肿瘤生长的影响。9°Y 标记的抗⑶H3抗体，特别是克隆#3、#4、和#6,有效地抑制了裸小鼠中移植的H1373细胞的 生长，而施用无标记的抗⑶H3抗体没有显示肿瘤生长的抑制。
[0084] 图2显示抗⑶H3抗体（克隆#3、#4、#5和#6)的还原型SDS-PAGE分析。克隆#3、 #4、#5的条带图样揭示了与IgG重链和轻链对应的两条带，而克隆#6的图样揭示了两条重 链带和一条轻链带。
[0085] 实施方案详述
[0086] 本发明涉及抗⑶H3抗体、包含它们的组合物、及它们在治疗或预防与⑶H3有关的 疾病如癌症中的用途。在一个典型的实施方案中，所述抗体是用放射性同位素标记物标记 的。
[0087] 已经报告了用于对自胰腺癌患者收集的胰腺癌细胞和正常细胞进行基因表达分 析的cDNA微阵列（Nakamura等，0ncogene(2004) ,23:2385-400)。随后鉴定了在胰腺癌细 胞中表达特异性增强的多种基因。胎盘钙粘蛋白（P-钙粘蛋白；CDH3)，一种胞质膜蛋白，是 这些基因之一，在主要器官中呈现低表达水平。对于癌症治疗的靶基因来说这样的特征是 合适的，因为可以避免副作用的危险。另外，在其它癌细胞系中确认了类似的CDH3过表达， 诸如肺、结肠直肠、前列腺、乳腺、胃和肝癌细胞系（W0/2007/102525)。
[0088] 定义
[0089] 如本文中使用的，术语"抗体"意图包括与指定蛋白质或其肽特异性起反应的免疫 球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗 体、融合至其它蛋白质或放射性标记物的抗体、和抗体片段。另外，本文中的抗体以最广义 使用，而且明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性 抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。"抗体"指所有 类（例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
[0090] "抗体片段"指完整抗体的一部分，一般包含完整抗体的抗原结合区或可变区。因 而，在本发明中，抗体片段可以包含完整抗体的一个或多个抗原结合部分。如本文中使用 的，术语抗体的"抗原结合部分"指抗体保留特异性结合抗原（例如CDH3)的能力的一种或 多种免疫学活性片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实施。抗体 片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab'）2、和Fv片段；线性抗体；和单链抗体分子。不管结构如 何，抗体片段结合被完整抗体识别的同一抗原。术语"抗体片段"还包括结合特定抗原的合 成的或遗传工程改造的多肽，诸如由轻链可变区组成的多肽、由重链和轻链可变区组成的 "Fv"片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头相连接的重组单链多肽分子（"scFv蛋白")、 和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
[0091] 如本文中使用的，与⑶R"功能上等同"是指⑶R赋予具备它们的抗体以与具有原 CDR的抗体基本上相等的抗原结合活性和抗原特异性。与CDR功能上等同的例子包括原始 CDR替换、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基者。只要保持抗原结合活性和抗原 特异性，氨基酸突变的数目和百分比没有特别限制。不过，一般优选改变可变区中所含的原 始⑶R的氨基酸序列的20 %以下。更优选地，突变的百分比为15%以下，10%以下，5%以 下。在优选的实施方案，氨基酸突变的数目是10个以下，5个以下，4个以下，3个以下，2个 以下，1个以下。本领域技术人员会理解可以接受的保留原始CDR的性质的突变。
[0092] 抗体的牛成
[0093] 本发明使用针对⑶H3的抗体。这些抗体将通过已知方法来提供。
[0094] 描述了用于生成依照本发明使用的抗体的例示技术。
[0095] (i)单克降抗体
[0096] 单克隆抗体是从一群基本上同质的抗体获得的，基本上同质即构成群体的各个抗 体是相同的，除了可能以极小量存在的天然突变外。因此，修饰语"单克隆"表示抗体的这 样的特征，即其不是分立（discrete)抗体的混合物。
[0097] 例如，单克隆抗体可通过最初由Kohler等，Nature 256:495 (1975)描述的杂交瘤 方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备（美国专利4, 816, 567)。
[0098] 在杂交瘤方法中，用CDH3多肽免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引 发出生成或能够生成会特异性结合CDH3多肽的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外用CDH3 多肽免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融 合，以形成杂交瘤细胞（Goding，《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》， 59-103,AcademicPress,1986)〇
[0099] 将制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未 融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常可含有次黄 嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT培养基），这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
[0100] 优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗 体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系包括鼠源骨 髓瘤系，诸如可从SalkInstituteCellDistributionCenter(SanDiege，California， USA)获得的M0PC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生鼠源骨髓瘤系，及可从AmericanType Cultu